Imunomodulačné metabolity sú kľúčovým znakom nádorového mikroprostredia (TME), ale až na niekoľko výnimiek zostáva ich identita do značnej miery neznáma. V tejto štúdii sme analyzovali nádory a T bunky z nádorov a ascitu pacientov s vysokostupňovým seróznym karcinómom (HGSC), aby sme odhalili metabolom týchto rôznych kompartmentov TME. Ascites a nádorové bunky majú rozsiahle rozdiely v metabolitoch. V porovnaní s ascitom sú nádor infiltrujúce T bunky významne obohatené o 1-metylnikotínamid (MNA). Hoci je hladina MNA v T bunkách zvýšená, expresia nikotínamid N-metyltransferázy (enzým, ktorý katalyzuje prenos metylových skupín z S-adenozylmetionínu na nikotínamid) je obmedzená na fibroblasty a nádorové bunky. Funkčne MNA indukuje T bunky k sekrécii cytokínu tumor nekrotizujúceho faktora alfa, ktorý podporuje rast nádoru. MNA odvodený z TME preto prispieva k imunitnej regulácii T buniek a predstavuje potenciálny cieľ imunoterapie pri liečbe rakoviny u ľudí.
Metabolity pochádzajúce z nádoru môžu mať výrazný inhibičný účinok na protinádorovú imunitu a stále viac dôkazov ukazuje, že môžu slúžiť aj ako kľúčová hnacia sila progresie ochorenia (1). Okrem Warburgovho efektu sa v poslednej dobe začali práce zaoberať charakterizáciou metabolického stavu nádorových buniek a jeho vzťahu s imunitným stavom nádorového mikroprostredia (TME). Štúdie na myších modeloch a ľudských T bunkách ukázali, že metabolizmus glutamínu (2), oxidačný metabolizmus (3) a metabolizmus glukózy (4) môžu pôsobiť nezávisle na rôzne podskupiny imunitných buniek. Niekoľko metabolitov v týchto dráhach inhibuje protinádorovú funkciu T buniek. Bolo dokázané, že blokáda koenzýmu tetrahydrobiopterínu (BH4) môže poškodiť proliferáciu T buniek a zvýšenie BH4 v tele môže zvýšiť protinádorovú imunitnú odpoveď sprostredkovanú CD4 a CD8. Okrem toho je možné imunosupresívny účinok kynurenínu zvrátiť podávaním BH4 (5). V glioblastóme s mutáciou izocitrátdehydrogenázy (IDH) inhibuje sekrécia enantiometabolického (R)-2-hydroxyglutarátu (R-2-HG) aktiváciu, proliferáciu a cytolýzu T buniek (6). Nedávno sa ukázalo, že metylglyoxal, vedľajší produkt glykolýzy, je produkovaný supresorovými bunkami myeloidného pôvodu a prenos metylglyoxalu T bunkami môže inhibovať funkciu efektorových T buniek. Pri liečbe môže neutralizácia metylglyoxalu prekonať aktivitu supresorových buniek odvodených z myeloidu (MDSC) a synergicky posilniť terapiu blokády kontrolných bodov v myších modeloch (7). Tieto štúdie spoločne zdôrazňujú kľúčovú úlohu metabolitov odvodených z TME v regulácii funkcie a aktivity T buniek.
Dysfunkcia T buniek bola široko hlásená pri rakovine vaječníkov (8). Čiastočne je to spôsobené metabolickými charakteristikami, ktoré sú vlastné hypoxii a abnormálnej vaskulatúre nádoru (9), čo vedie k premene glukózy a tryptofánu na vedľajšie produkty, ako je kyselina mliečna a kynurenín. Nadmerný extracelulárny laktát znižuje produkciu interferónu-γ (IFN-γ) a riadi diferenciáciu myelosupresívnych podskupín (10, 11). Konzumácia tryptofánu priamo inhibuje proliferáciu T buniek a inhibuje signalizáciu receptorov T buniek (12-14). Napriek týmto pozorovaniam sa veľa prác týkajúcich sa imunitného metabolizmu vykonalo v in vitro kultúre T buniek s použitím optimalizovaných médií alebo sa obmedzilo na homológne myšie modely in vivo, pričom ani jedno z nich úplne neodráža heterogenitu ľudských druhov rakoviny a fyziologického makro a mikro prostredia.
Spoločným znakom rakoviny vaječníkov je peritoneálne šírenie a výskyt ascitu. Hromadenie bunkovej tekutiny v ascite je spojené s pokročilým ochorením a zlou prognózou (15). Podľa správ je tento jedinečný kompartment hypoxický, má vysoké hladiny vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGF) a indoleamín-2,3-dioxygenázy (IDO) a je infiltrovaný regulačnými T bunkami a myeloidnými inhibičnými bunkami (15-18). Metabolické prostredie ascitu sa môže líšiť od metabolického prostredia samotného nádoru, takže preprogramovanie T buniek v peritoneálnom priestore nie je jasné. Okrem toho kľúčové rozdiely a heterogenita medzi ascitom a metabolitmi prítomnými v prostredí nádoru môžu brániť infiltrácii imunitných buniek a ich funkcii na nádoroch a je potrebný ďalší výskum.
Aby sme tieto problémy vyriešili, navrhli sme citlivú metódu separácie buniek a tandemovej hmotnostnej spektrometrie s kvapalinovou chromatografiou (LC-MS/MS) na štúdium rôznych typov buniek (vrátane CD4+ a CD8+ T buniek), ako aj v rámci nádorov a medzi nimi. Jeho metabolity sa nachádzajú v bunkách v rovnakom ascite a nádorovom prostredí pacienta. Túto metódu používame v spojení s vysokorozmernou prietokovou cytometriou a sekvenovaním RNA jednotlivých buniek (scRNA-seq), aby sme poskytli vysoko rozlíšený portrét metabolického stavu týchto kľúčových populácií. Táto metóda odhalila významný nárast hladiny 1-metylnikotínamidu (MNA) v nádorových T bunkách a experimenty in vitro ukázali, že imunomodulačný účinok MNA na funkciu T buniek bol doteraz neznámy. Vo všeobecnosti táto metóda odhaľuje vzájomné metabolické interakcie medzi nádormi a imunitnými bunkami a poskytuje jedinečný pohľad na metabolity imunitnej regulácie, čo môže byť užitočné pri liečbe rakoviny vaječníkov na báze T buniek. Možnosti liečby.
Na súčasnú kvantifikáciu príjmu glukózy [2-(N-(7-nitrofenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglukóza (2-NBDG) a mitochondriálna aktivita [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) sú typické markery, ktoré odlišujú imunitné bunky a populácie nádorových buniek (Tabuľka S2 a Obrázok S1A), sme použili vysokorozmernú prietokovú cytometriu. Táto analýza ukázala, že v porovnaní s T bunkami majú ascites a nádorové bunky vyššie hladiny príjmu glukózy, ale menšie rozdiely v mitochondriálnej aktivite. Priemerný príjem glukózy nádorovými bunkami [CD45-EpCAM (EpCAM)+] je tri až štyrikrát vyšší ako u T buniek a priemerný príjem glukózy CD4+ T buniek je 1,2-krát vyšší ako u CD8+ T buniek, čo naznačuje, že nádor infiltrujúce lymfocyty (TIL) majú odlišné metabolické požiadavky aj v rovnakom TME (Obrázok 1A). Naproti tomu mitochondriálna aktivita v nádorových bunkách je podobná aktivite CD4+ T buniek a mitochondriálna aktivita oboch typov buniek je vyššia ako aktivita CD8+ T buniek (obrázok 1B). Vo všeobecnosti tieto výsledky odhaľujú metabolickú úroveň. Metabolická aktivita nádorových buniek je vyššia ako aktivita CD4+ T buniek a metabolická aktivita CD4+ T buniek je vyššia ako aktivita CD8+ T buniek. Napriek týmto účinkom naprieč typmi buniek neexistuje konzistentný rozdiel v metabolickom stave CD4+ a CD8+ T buniek alebo ich relatívnych podieloch v ascite v porovnaní s nádormi (obrázok 1C). Naproti tomu vo frakcii CD45-buniek sa podiel buniek EpCAM+ v nádore zvýšil v porovnaní s ascitom (obrázok 1D). Pozorovali sme tiež jasný metabolický rozdiel medzi zložkami buniek EpCAM+ a EpCAM-. Bunky EpCAM+ (nádorové) majú vyššie vychytávanie glukózy a mitochondriálnu aktivitu ako bunky EpCAM-, ktorá je oveľa vyššia ako metabolická aktivita fibroblastov v nádorových bunkách pri TME (obrázok 1, E a F).
(A a B) Medián intenzity fluorescencie (MFI) absorpcie glukózy (2-NBDG) (A) a mitochondriálna aktivita CD4+ T buniek (MitoTracker tmavočervená) (B) Reprezentatívne grafy (vľavo) a tabuľkové údaje (vpravo), CD8+ T bunky a EpCAM+ CD45-nádorové bunky z ascitu a nádoru. (C) Pomer CD4+ a CD8+ buniek (CD3+ T buniek) v ascite a nádore. (D) Podiel nádorových buniek EpCAM+ v ascite a nádore (CD45−). (E a ​​F) Absorpcia glukózy EpCAM+ CD45-nádor a EpCAM-CD45-matrix (2-NBDG) (E) a mitochondriálna aktivita (MitoTracker tmavočervená) (F) Reprezentatívne grafy (vľavo) a tabuľkové údaje (vpravo) Ascites a nádorové bunky. (G) Reprezentatívne grafy expresie CD25, CD137 a PD1 prietokovou cytometriou. (H a I) Expresia CD25, CD137 a PD1 na CD4+ T bunkách (H) a CD8+ T bunkách (I). (J a K) Naivné, centrálne pamäťové (Tcm), efektorové (Teff) a efektorové pamäťové (Tem) fenotypy založené na expresii CCR7 a CD45RO. Reprezentatívne obrázky (vľavo) a tabuľkové údaje (vpravo) CD4+ T buniek (J) a CD8+ T buniek (K) v ascite a nádoroch. Hodnoty P určené párovým t-testom (*P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001). Čiara predstavuje zhodných pacientov (n = 6). FMO, fluorescencia mínus jedna; MFI, stredná intenzita fluorescencie.
Ďalšia analýza odhalila ďalšie významné rozdiely medzi fenotypovým stavom vysoko rozlíšených T buniek. Aktivované (obrázok 1, G až I) a efektorové pamäťové (obrázok 1, J a K) sú v nádoroch oveľa častejšie ako ascites (podiel CD3+ T buniek). Podobne analýza fenotypu expresiou aktivačných markerov (CD25 a CD137) a markerov deplécie [proteín programovanej bunkovej smrti 1 (PD1)] ukázala, že hoci metabolické charakteristiky týchto populácií sú odlišné (obrázok S1, B až E), neboli pozorované žiadne významné metabolické rozdiely medzi naivnými, efektorovými alebo pamäťovými podskupinami (obrázok S1, F až I). Tieto výsledky boli potvrdené použitím metód strojového učenia na automatické priradenie bunkových fenotypov (21), čo ďalej odhalilo prítomnosť veľkého počtu buniek kostnej drene (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) v ascite pacienta (obrázok S2A). Spomedzi všetkých identifikovaných typov buniek táto populácia myeloidných buniek vykazovala najvyššiu absorpciu glukózy a mitochondriálnu aktivitu (obrázok S2, B až G). Tieto výsledky zdôrazňujú silné metabolické rozdiely medzi viacerými typmi buniek nachádzajúcimi sa v ascite a nádoroch u pacientov s HGSC.
Hlavnou výzvou pri pochopení metabonomických charakteristík TIL je potreba izolovať vzorky T buniek dostatočnej čistoty, kvality a množstva z nádorov. Nedávne štúdie ukázali, že metódy triedenia a obohacovania guľôčkami založené na prietokovej cytometrii môžu viesť k zmenám v profiloch bunkových metabolitov (22-24). Aby sme tento problém prekonali, optimalizovali sme metódu obohacovania guľôčkami na izoláciu a izoláciu TIL z chirurgicky resekovaného ľudského karcinómu vaječníkov pred analýzou pomocou LC-MS/MS (pozri Materiály a metódy; Obrázok 2A). Aby sme posúdili celkový vplyv tohto protokolu na zmeny metabolitov, porovnali sme profily metabolitov T buniek aktivovaných zdravými darcami po vyššie uvedenom kroku separácie guľôčok s bunkami, ktoré neboli separované guľôčkami, ale zostali na ľade. Táto analýza kontroly kvality zistila, že medzi týmito dvoma podmienkami existuje vysoká korelácia (r = 0,77) a technická opakovateľnosť skupiny 86 metabolitov má vysokú opakovateľnosť (Obrázok 2B). Tieto metódy preto dokážu vykonávať presnú analýzu metabolitov v bunkách, ktoré prechádzajú obohacovaním bunkového typu, a tým poskytujú prvú platformu s vysokým rozlíšením na identifikáciu špecifických metabolitov v HGSC, čo ľuďom umožňuje získať hlbšie pochopenie špecifickosti buniek v programe sexuálneho metabolizmu.
(A) Schematický diagram obohatenia magnetickými guľôčkami. Pred analýzou pomocou LC-MS/MS bunky absolvujú tri po sebe nasledujúce kolá obohatenia magnetickými guľôčkami alebo zostanú na ľade. (B) Vplyv typu obohatenia na množstvo metabolitov. Priemer troch meraní pre každý typ obohatenia ± SE. Sivá čiara predstavuje vzťah 1:1. Vnútrotriedna korelácia (ICC) opakovaných meraní je znázornená v označení osi. NAD, nikotínamid adenín dinukleotid. (C) Schematický diagram pracovného postupu analýzy metabolitov pacienta. Ascites alebo nádory sa odoberajú od pacientov a kryokonzervujú. Malá časť každej vzorky sa analyzovala prietokovou cytometriou, zatiaľ čo zvyšné vzorky sa podrobili trom kolám obohatenia o bunky CD4+, CD8+ a CD45-. Tieto bunkové frakcie sa analyzovali pomocou LC-MS/MS. (D) Tepelná mapa štandardizovaného množstva metabolitov. Dendrogram predstavuje Wardovo zhlukovanie euklidovských vzdialeností medzi vzorkami. (E) Analýza hlavných komponentov (PCA) mapy metabolitov vzorky, zobrazujúca tri replikáty každej vzorky, vzorky od toho istého pacienta sú spojené čiarou. (F) PCA profilu metabolitov vzorky podmienenej pacientom (t. j. s použitím čiastočnej redundancie); typ vzorky je obmedzený konvexným obalom. PC1, hlavná zložka 1; PC2, hlavná zložka 2.
Následne sme túto metódu obohatenia použili na analýzu 99 metabolitov vo frakciách buniek CD4+, CD8+ a CD45- v primárnom ascite a nádoroch šiestich pacientov s HGSC (obrázok 2C, obrázok S3A a tabuľky S3 a S4). Populácia, ktorá je predmetom záujmu, predstavuje 2 % až 70 % pôvodnej veľkej vzorky živých buniek a podiel buniek sa medzi pacientmi značne líši. Po oddelení guľôčok predstavuje obohatená frakcia (CD4+, CD8+ alebo CD45-) v priemere viac ako 85 % všetkých živých buniek vo vzorke. Táto metóda obohatenia nám umožňuje analyzovať bunkové populácie z metabolizmu ľudského nádorového tkaniva, čo je nemožné urobiť z veľkých vzoriek. Pomocou tohto protokolu sme zistili, že l-kynurenín a adenozín, tieto dva dobre charakterizované imunosupresívne metabolity, boli zvýšené v nádorových T bunkách alebo nádorových bunkách (obrázok S3, B a C). Tieto výsledky preto demonštrujú presnosť a schopnosť našej technológie separácie buniek a hmotnostnej spektrometrie nájsť biologicky dôležité metabolity v tkanivách pacientov.
Naša analýza tiež odhalila silnú metabolickú separáciu bunkových typov v rámci pacientov a medzi nimi (obrázok 2D a obrázok S4A). Najmä v porovnaní s inými pacientmi vykazoval pacient 70 odlišné metabolické charakteristiky (obrázok 2E a obrázok S4B), čo naznačuje, že medzi pacientmi môže existovať značná metabolická heterogenita. Stojí za zmienku, že v porovnaní s inými pacientmi (1,2 až 2 litre; tabuľka S1) bolo celkové množstvo odobratého ascitu u pacienta 70 (80 ml) menšie. Kontrola heterogenity medzi pacientmi počas analýzy hlavných komponentov (napríklad pomocou analýzy čiastočnej redundancie) ukazuje konzistentné zmeny medzi bunkovými typmi a bunkové typy a/alebo mikroprostredie sú jasne agregované podľa profilu metabolitov (obrázok 2F). Analýza jednotlivých metabolitov zdôraznila tieto účinky a odhalila významné rozdiely medzi bunkovými typmi a mikroprostredím. Stojí za zmienku, že najextrémnejším pozorovaným rozdielom je MNA, ktorá je zvyčajne obohatená o CD45-bunky a o CD4+ a CD8+ bunky, ktoré infiltrujú nádor (obrázok 3A). V prípade buniek CD4+ je tento účinok najzreteľnejší a zdá sa, že aj MNA v bunkách CD8+ je silne ovplyvnená prostredím. To však nie je dôležité, pretože iba u troch zo šiestich pacientov je možné vyhodnotiť skóre CD8+ nádoru. Okrem MNA sú v rôznych typoch buniek v ascite a nádoroch aj iné metabolity, ktoré sú v TIL slabo charakterizované, rozdielne bohaté aj na iné (obrázky S3 a S4). Tieto údaje preto odhaľujú sľubný súbor imunomodulačných metabolitov pre ďalší výskum.
(A) Normalizovaný obsah MNA v bunkách CD4+, CD8+ a CD45- z ascitu a nádoru. Krabicový graf zobrazuje medián (čiara), interkvartilný rozsah (záves rámca) a rozsah údajov až do 1,5-násobku interkvartilného rozsahu (fín rámca). Ako je popísané v časti Materiály a metódy pre pacientov, použite hodnotu limma pacienta na určenie hodnoty P (*P<0,05 a **P<0,01). (B) Schematický diagram metabolizmu MNA (60). Metabolity: S-adenozyl-1-metionín; SAH, S-adenozín-1-homocysteín; NA, nikotínamid; MNA, 1-metylnikotínamid; 2-PY, 1-metyl-2-pyridón-5-karboxamid; 4-PY, 1-metyl-4-pyridón-5-karboxamid; NR, nikotínamidribóza; NMN, nikotínamidmononukleotid. Enzýmy (zelené): NNMT, nikotínamid N-metyltransferáza; SIRT, sirtuíny; NAMPT, nikotínamid fosforibozyltransferáza; AOX1, aldehydoxidáza 1; NRK, nikotínamid ribozidkináza; NMNAT, nikotínamid mononukleotid adenyláttransferáza; Pnp1, purín nukleozid fosforyláza. (C) t-SNE scRNA-seq ascitu (sivá) a nádoru (červená; n = 3 pacienti). (D) Expresia NNMT v rôznych bunkových populáciách identifikovaných pomocou scRNA-seq. (E) Expresia NNMT a AOX1 v SK-OV-3, ľudských embryonálnych obličkách (HEK) 293T, T bunkách a T bunkách ošetrených MNA. Zložená expresia je zobrazená v porovnaní s SK-OV-3. Je zobrazený expresný vzorec so SEM (n = 6 zdravých darcov). Hodnoty Ct vyššie ako 35 sa považujú za nedetekovateľné (UD). (F) Expresia SLC22A1 a SLC22A2 v SK-OV-3, HEK293T, T bunkách a T bunkách ošetrených 8 mM MNA. Zobrazená je zložená expresia v porovnaní s SK-OV-3. Zobrazený je expresný vzorec so SEM (n = 6 zdravých darcov). Hodnoty Ct vyššie ako 35 sa považujú za nedetekovateľné (UD). (G) Obsah MNA buniek v aktivovaných zdravých darcovských T bunkách po 72 hodinách inkubácie s MNA. Zobrazený je expresný vzorec so SEM (n = 4 zdraví darcovia).
MNA sa produkuje prenosom metylovej skupiny z S-adenozyl-1-metionínu (SAM) na nikotínamid (NA) pomocou nikotínamid-N-metyltransferázy (NNMT; Obrázok 3B). NNMT je nadmerne exprimovaný v rôznych typoch ľudských rakovín a je spojený s proliferáciou, inváziou a metastázami (25-27). Aby sme lepšie pochopili zdroj MNA v T bunkách pri TME, použili sme scRNA-seq na charakterizáciu expresie NNMT naprieč typmi buniek v ascite a nádoroch troch pacientov s HGSC (Tabuľka S5). Analýza približne 6 500 buniek ukázala, že v prostredí ascitu a nádoru bola expresia NNMT obmedzená na predpokladané populácie fibroblastov a nádorových buniek (Obrázok 3, C a D). Stojí za zmienku, že v žiadnej populácii, ktorá exprimuje PTPRC (CD45+), neexistuje žiadna zjavná expresia NNMT (Obrázok 3D a Obrázok S5A), čo naznačuje, že MNA detegovaná v spektre metabolitov bola zavedená do T buniek. Expresia aldehydoxidázy 1 (AOX1) premieňa MNA na 1-metyl-2-pyridón-5-karboxamid (2-PYR) alebo 1-metyl-4-pyridón-5-karboxamid (4-PYR); Obrázok 3B) je tiež obmedzený na populáciu fibroblastov exprimujúcich COL1A1 (Obrázok S5A), čo spolu naznačuje, že T-bunky nemajú schopnosť konvenčného metabolizmu MNA. Expresný vzorec týchto génov súvisiacich s MNA bol overený pomocou druhého nezávislého súboru bunkových údajov z ascitu od pacientov s HGSC (Obrázok S5B; n = 6) (16). Okrem toho kvantitatívna analýza polymerázovej reťazovej reakcie (qPCR) zdravých darcovských T-buniek liečených MNA ukázala, že v porovnaní s kontrolnými ovariálnymi nádorovými bunkami SK-OV-3 neboli NNMT alebo AOX1 takmer exprimované (Obrázok 3E). Tieto neočakávané výsledky naznačujú, že MNA môže byť vylučovaná z fibroblastov alebo nádorov do susedných T-buniek pri TME.
Hoci medzi kandidátov patrí rodina organických katiónových transportérov 1 až 3 (OCT1, OCT2 a OCT3) kódovaných rodinou rozpustných nosičov 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 a SLC22A3), potenciálni transportéri MNA stále nie sú definovaní (28). QPCR mRNA zo zdravých darcovských T buniek vykazovala nízke hladiny expresie SLC22A1, ale nedetekovateľné hladiny SLC22A2, čo potvrdilo, že to bolo predtým hlásené v literatúre (obrázok 3F) (29). Naproti tomu ovariálna nádorová bunková línia SK-OV-3 exprimovala vysoké hladiny oboch transportérov (obrázok 3F).
Aby sa otestovala možnosť, že T bunky majú schopnosť absorbovať cudzí MNA, zdravé darcovské T bunky boli kultivované 72 hodín v prítomnosti rôznych koncentrácií MNA. V neprítomnosti exogénneho MNA nie je možné zistiť bunkový obsah MNA (obrázok 3G). Aktivované T bunky ošetrené exogénnym MNA však vykazovali od dávky závislý nárast obsahu MNA v bunkách až do 6 mM MNA (obrázok 3G). Tento výsledok naznačuje, že napriek nízkej úrovni expresie transportérov a nedostatku hlavného enzýmu zodpovedného za intracelulárny metabolizmus MNA, TIL môže stále prijímať MNA.
Spektrum metabolitov v T bunkách pacientov a experimenty s absorpciou MNA in vitro zvyšujú možnosť, že fibroblasty asociované s rakovinou (CAF) vylučujú MNA a nádorové bunky môžu regulovať fenotyp a funkciu TIL. Na stanovenie účinku MNA na T bunky boli zdravé darcovské T bunky aktivované in vitro v prítomnosti alebo neprítomnosti MNA a bola vyhodnotená ich proliferácia a produkcia cytokínov. Po 7 dňoch pridávania MNA v najvyššej dávke sa počet zdvojení populácie mierne znížil, zatiaľ čo vitalita sa zachovala pri všetkých dávkach (obrázok 4A). Okrem toho liečba exogénnym MNA viedla k zvýšeniu podielu CD4+ a CD8+ T buniek exprimujúcich faktor nekrózy nádorov-α (TNFα; obrázok 4B). Naproti tomu intracelulárna produkcia IFN-γ bola významne znížená v CD4+ T bunkách, ale nie v CD8+ T bunkách, a nedošlo k žiadnej významnej zmene interleukínu 2 (IL-2; obrázok 4, C a D). Preto enzýmovo-imunoanalýza (ELISA) supernatantov z týchto kultúr T buniek ošetrených MNA preukázala významný nárast TNFα, pokles IFN-γ a žiadnu zmenu IL-2 (obrázok 4, E až G). Pokles IFN-γ naznačuje, že MNA môže hrať úlohu pri inhibícii protinádorovej aktivity T buniek. Aby sa simuloval účinok MNA na cytotoxicitu sprostredkovanú T bunkami, chimérické bunky antigénového receptora T (FRα-CAR-T) zamerané na folátový receptor α a bunky CAR-T (GFP) regulované zeleným fluorescenčným proteínom (GFP)-CAR-T) sú produkované zdravými mononukleárnymi bunkami periférnej krvi (PBMC) darcov. Bunky CAR-T boli kultivované 24 hodín v prítomnosti MNA a potom kokultivované s ľudskými ovariálnymi nádorovými bunkami SK-OV-3 exprimujúcimi folátový receptor α v pomere efektora k cieľu 10:1. Liečba MNA viedla k významnému zníženiu zabíjacej aktivity buniek FRα-CAR-T, čo bolo podobné bunkám FRα-CAR-T liečeným adenozínom (obrázok 4H).
(A) Celkový počet životaschopných buniek a zdvojenie populácie (PD) priamo z kultúry na 7. deň. Stĺpcový graf predstavuje priemer + SEM šiestich zdravých darcov. Predstavuje údaje z najmenej n = 3 nezávislých experimentov. (B až D) CD3/CD28 a IL-2 boli použité na aktiváciu T buniek pri ich príslušných koncentráciách MNA počas 7 dní. Pred analýzou boli bunky stimulované PMA/ionomycínom s GolgiStopom počas 4 hodín. Expresia TNFα (B) v T bunkách. Príklad obrázka (vľavo) a tabuľkové údaje (vpravo) expresie TNFα v živých bunkách. Expresia IFN-γ (C) a IL-2 (D) v T bunkách. Expresia cytokínov bola meraná prietokovou cytometriou. Stĺpcový graf predstavuje priemer (n = 6 zdravých darcov) + SEM. Na určenie hodnoty P použite jednosmernú analýzu rozptylu a opakované merania (*P<0,05 a **P<0,01). Predstavuje údaje z najmenej n = 3 nezávislých experimentov. (E až G) CD3/CD28 a IL-2 boli použité na aktiváciu T buniek pri ich príslušných koncentráciách MNA počas 7 dní. Médium bolo odobraté pred a po 4 hodinách stimulácie PMA/ionomycínom. Koncentrácie TNFα (E), IFN-γ (F) a IL-2 (G) boli merané pomocou ELISA. Stĺpcový graf predstavuje priemer (n = 5 zdravých darcov) + SEM. Hodnota P bola stanovená pomocou jednosmernej analýzy rozptylu a opakovaných meraní (*P<0,05). Prerušovaná čiara označuje detekčný limit detekcie. (H) Test lýzy buniek. Bunky FRα-CAR-T alebo GFP-CAR-T boli upravené adenozínom (250 μM) alebo MNA (10 mM) počas 24 hodín alebo neboli ošetrené (Ctrl). Bolo merané percento usmrtenia buniek SK-OV-3. Hodnota P bola stanovená Welchovým t-testom (*P<0,5 a **P<0,01).
Aby sa získalo mechanistické pochopenie regulácie expresie TNFα závislej od MNA, boli vyhodnotené zmeny v mRNA TNFα buniek T ošetrených MNA (obrázok 5A). Zdravé darcovské bunky T ošetrené MNA vykazovali dvojnásobné zvýšenie hladín transkripcie TNFα, čo naznačuje, že MNA je závislá od transkripčnej regulácie TNFα. Na preskúmanie tohto možného regulačného mechanizmu boli vyhodnotené dva známe transkripčné faktory, ktoré regulujú TNFα, a to aktivovaný nukleárny faktor T buniek (NFAT) a špecifický proteín 1 (Sp1), v reakcii na väzbu MNA na proximálny promótor TNFα (30). Promótor TNFα obsahuje 6 identifikovaných väzbových miest NFAT a 2 väzbové miesta Sp1, ktoré sa prekrývajú v jednom mieste [-55 párov báz (bp) od 5'-čiapočky] (30). Imunoprecipitácia chromatínu (ChIP) ukázala, že po ošetrení MNA sa väzba Sp1 na promótor TNFα zvýšila trojnásobne. Inkorporácia NFAT sa tiež zvýšila a priblížila sa k významu (obrázok 5B). Tieto údaje naznačujú, že MNA reguluje expresiu TNFα prostredníctvom transkripcie Sp1 a v menšej miere expresiu NFAT.
(A) V porovnaní s T bunkami kultivovanými bez MNA, násobná zmena expresie TNFα v T bunkách ošetrených MNA. Je znázornený expresný vzorec so SEM (n = 5 zdravých darcov). Predstavuje údaje z najmenej n = 3 nezávislých experimentov. (B) Promótor TNFα T buniek ošetrených s alebo bez 8 mM MNA po NFAT a Sp1 boli kombinované so stimuláciou (Ctrl) a PMA/ionomycínom počas 4 hodín. Imunoglobulín G (IgG) a H3 boli použité ako negatívna a pozitívna kontrola pre imunoprecipitáciu. Kvantifikácia ChIP ukázala, že väzba Sp1 a NFAT na promótor TNFα v bunkách ošetrených MNA sa niekoľkonásobne zvýšila v porovnaní s kontrolou. Predstavuje údaje z najmenej n = 3 nezávislých experimentov. Hodnota P určená viacerými t-testmi (*** P <0,01). (C) V porovnaní s ascitom HGSC, T bunky (necytotoxické) vykazovali zvýšenú expresiu TNF v nádore. Farby predstavujú rôznych pacientov. Zobrazené bunky boli náhodne vzorkované do 300 a roztrasené, aby sa obmedzilo prekresľovanie (** Padj = 0,0076). (D) Navrhovaný model MNA pre rakovinu vaječníkov. MNA sa produkuje v nádorových bunkách a fibroblastoch v TME a je prijímaná T bunkami. MNA zvyšuje väzbu Sp1 na promótor TNFα, čo vedie k zvýšenej transkripcii TNFα a produkcii cytokínov TNFα. MNA tiež spôsobuje zníženie IFN-γ. Inhibícia funkcie T buniek vedie k zníženej schopnosti ničenia a zrýchlenému rastu nádoru.
Podľa správ má TNFα predné a spätne závislé protinádorové a protinádorové účinky, ale má dobre známu úlohu pri podpore rastu a metastázovania rakoviny vaječníkov (31-33). Podľa správ je koncentrácia TNFα v ascite a nádorových tkanivách u pacientov s rakovinou vaječníkov vyššia ako v benígnych tkanivách (34-36). Z hľadiska mechanizmu môže TNFα regulovať aktiváciu, funkciu a proliferáciu bielych krviniek a meniť fenotyp rakovinových buniek (37, 38). V súlade s týmito zisteniami analýza diferenciálnej génovej expresie ukázala, že TNF bol v T bunkách v nádorových tkanivách v porovnaní s ascitom významne zvýšený (obrázok 5C). Zvýšenie expresie TNF bolo evidentné iba v populáciách T buniek s necytotoxickým fenotypom (obrázok S5A). Stručne povedané, tieto údaje podporujú názor, že MNA má dvojité imunosupresívne a nádor podporujúce účinky pri HGSC.
Fluorescenčné značenie založené na prietokovej cytometrii sa stalo hlavnou metódou na štúdium metabolizmu TIL. Tieto štúdie ukázali, že v porovnaní s periférnymi krvnými lymfocytmi alebo T bunkami zo sekundárnych lymfoidných orgánov majú myšie a ľudské TIL vyššiu tendenciu k absorpcii glukózy (4, 39) a postupnú stratu mitochondriálnej funkcie (19, 40). Hoci sme v tejto štúdii pozorovali podobné výsledky, kľúčovým vývojom je porovnanie metabolizmu nádorových buniek a TIL z rovnakého resekovaného nádorového tkaniva. V súlade s niektorými z týchto predchádzajúcich správ majú nádorové (CD45-EpCAM+) bunky z ascitu a nádorov vyššie vychytávanie glukózy ako CD8+ a CD4+ T bunky, čo podporuje tvrdenie, že vysoké vychytávanie glukózy nádorovými bunkami možno porovnať s T bunkami. Koncept konkurencie T buniek. TME. Mitochondriálna aktivita nádorových buniek je však vyššia ako aktivita CD8+ T buniek, ale mitochondriálna aktivita je podobná aktivite CD4+ T buniek. Tieto výsledky posilňujú vznikajúcu tému, že oxidačný metabolizmus je dôležitý pre nádorové bunky (41, 42). Taktiež naznačujú, že CD8+ T bunky môžu byť náchylnejšie na oxidačnú dysfunkciu ako CD4+ T bunky alebo že CD4+ T bunky môžu na udržanie mitochondriálnej aktivity využívať iné zdroje uhlíka ako glukózu (43, 44). Treba poznamenať, že sme nepozorovali žiadny rozdiel v príjme glukózy alebo mitochondriálnej aktivite medzi efektormi CD4+ T, efektorovými pamäťovými T bunkami a centrálnymi pamäťovými T bunkami v ascite. Podobne stav diferenciácie CD8+ T buniek v nádoroch nemá nič spoločné so zmenami v príjme glukózy, čo zdôrazňuje významný rozdiel medzi T bunkami kultivovanými in vitro a ľudskou TIL in vivo (22). Tieto pozorovania boli potvrdené aj použitím nestrannej automatickej alokácie bunkovej populácie, ktorá ďalej odhalila, že bunky CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ s vyšším príjmom glukózy a mitochondriálnou aktivitou ako nádorové bunky sú rozšírené, ale majú metabolicky aktívnu bunkovú populáciu. Táto populácia môže predstavovať predpokladanú subpopuláciu myeloidných supresorových buniek alebo plazmacytoidných dendritických buniek identifikovaných v analýze scRNA-seq. Hoci obe tieto zložky boli hlásené v prípade ľudských ovariálnych nádorov [45], stále je potrebné ich ďalej skúmať. Ďalšia práca sa zameriava na opis tejto myeloidnej subpopulácie.
Hoci metódy založené na prietokovej cytometrii dokážu objasniť všeobecné rozdiely v metabolizme glukózy a oxidačného metabolizmu medzi typmi buniek, presné metabolity produkované glukózou alebo inými zdrojmi uhlíka pre mitochondriálny metabolizmus v TME ešte neboli stanovené. Priradenie prítomnosti alebo neprítomnosti metabolitov k danej podskupine TIL vyžaduje purifikáciu bunkovej populácie z vyrezaného tkaniva. Preto naša metóda obohatenia buniek v kombinácii s hmotnostnou spektrometriou môže poskytnúť prehľad o metabolitoch, ktoré sú diferencovane obohatené v T bunkách a populáciách nádorových buniek v zodpovedajúcich vzorkách pacientov. Hoci táto metóda má výhody oproti triedeniu buniek aktivovaným fluorescenciou, určité knižnice metabolitov môžu byť ovplyvnené kvôli inherentnej stabilite a/alebo rýchlej rýchlosti obmeny (22). Napriek tomu naša metóda dokázala identifikovať dva rozpoznané imunosupresívne metabolity, adenozín a kynurenín, pretože sa medzi typmi vzoriek značne líšia.
Naša metabonomická analýza nádorov a podtypov TIL poskytuje viac informácií o úlohe metabolitov v ovariálnom TME. Po prvé, pomocou prietokovej cytometrie sme zistili, že medzi nádormi a CD4+ T bunkami nebol žiadny rozdiel v mitochondriálnej aktivite. Analýza LC-MS/MS však odhalila významné zmeny v množstve metabolitov medzi týmito populáciami, čo naznačuje, že závery o metabolizme TIL a jeho celkovej metabolickej aktivite si vyžadujú starostlivú interpretáciu. Po druhé, MNA je metabolit s najväčším rozdielom medzi CD45-bunkami a T bunkami v ascite, nie v nádoroch. Preto môžu mať kompartmentalizácia a umiestnenie nádoru rôzne účinky na metabolizmus TIL, čo zdôrazňuje možnú heterogenitu v danom mikroprostredí. Po tretie, expresia enzýmu NNMT produkujúceho MNA je obmedzená hlavne na CAF, čo je v menšej miere prítomné v nádorových bunkách, ale detekovateľné hladiny MNA sa pozorujú v T bunkách odvodených z nádorov. Nadmerná expresia NNMT v ovariálnom CAF má známy účinok podporujúci rakovinu, čiastočne vďaka podpore metabolizmu CAF, invázii nádoru a metastázovaniu (27). Hoci je celková hladina TIL stredná, expresia NNMT v CAF úzko súvisí s mezenchymálnym podtypom Cancer Genome Atlas (TCGA), ktorý je spojený so zlou prognózou (27, 46, 47). Expresia enzýmu AOX1 zodpovedného za degradáciu MNA je nakoniec obmedzená aj na populáciu CAF, čo naznačuje, že T-bunky nemajú schopnosť metabolizovať MNA. Tieto výsledky podporujú myšlienku, že hoci je na overenie tohto zistenia potrebný ďalší výskum, vysoké hladiny MNA v T-bunkách môžu naznačovať prítomnosť imunosupresívneho mikroprostredia CAF.
Vzhľadom na nízku úroveň expresie transportérov MNA a nedetekovateľné hladiny kľúčových proteínov zapojených do metabolizmu MNA je prítomnosť MNA v T bunkách neočakávaná. Ani NNMT, ani AOX1 nebolo možné detegovať pomocou scRNA-seq analýzy a cielenej qPCR dvoch nezávislých kohort. Tieto výsledky naznačujú, že MNA nie je syntetizovaná T bunkami, ale absorbovaná z okolitého TME. Experimenty in vitro ukazujú, že T bunky majú tendenciu akumulovať exogénny MNA.
Naše štúdie in vitro ukázali, že exogénny MNA indukuje expresiu TNFα v T bunkách a zvyšuje väzbu Sp1 na promótor TNFα. Hoci TNFα má protinádorové aj protinádorové funkcie, pri rakovine vaječníkov môže TNFα podporovať rast rakoviny vaječníkov (31-33). Neutralizácia TNFα v kultúre nádorových buniek vaječníkov alebo eliminácia signálu TNFα v myších modeloch môže zlepšiť produkciu zápalových cytokínov sprostredkovanú TNFα a inhibovať rast nádoru (32, 35). Preto v tomto prípade môže MNA odvodený od TME pôsobiť ako prozápalový metabolit prostredníctvom mechanizmu závislého od TNFα prostredníctvom autokrinnej slučky, čím podporuje výskyt a šírenie rakoviny vaječníkov (31). Na základe tejto možnosti sa blokáda TNFα skúma ako potenciálne terapeutické činidlo pre rakovinu vaječníkov (37, 48, 49). Okrem toho MNA zhoršuje cytotoxicitu CAR-T buniek voči nádorovým bunkám vaječníkov, čo poskytuje ďalší dôkaz o imunosupresii sprostredkovanej MNA. Tieto výsledky spoločne naznačujú model, v ktorom nádory a bunky CAF vylučujú MNA do extracelulárneho TME. Prostredníctvom (i) stimulácie rastu rakoviny vaječníkov indukovanej TNF a (ii) inhibície cytotoxickej aktivity T buniek indukovanej MNA to môže mať dvojitý účinok na nádor (obrázok 5D).
Záverom možno povedať, že táto štúdia, ktorá použila kombináciu rýchleho obohatenia buniek, sekvenovania jednotlivých buniek a metabolického profilovania, odhalila obrovské imunometabolomické rozdiely medzi nádorovými a ascitovými bunkami u pacientov s HGSC. Táto komplexná analýza ukázala, že existujú rozdiely v príjme glukózy a mitochondriálnej aktivite medzi T bunkami a identifikovala MNA ako nebunkový autonómny imunitný regulačný metabolit. Tieto údaje majú vplyv na to, ako TME ovplyvňuje metabolizmus T buniek v ľudských rakovinových ochoreniach. Hoci bola hlásená priama konkurencia o živiny medzi T bunkami a rakovinovými bunkami, metabolity môžu pôsobiť aj ako nepriame regulátory na podporu progresie nádoru a pravdepodobne aj na potlačenie endogénnych imunitných reakcií. Ďalší opis funkčnej úlohy týchto regulačných metabolitov môže otvoriť alternatívne stratégie na posilnenie protinádorovej imunitnej reakcie.
Vzorky pacientov a klinické údaje boli získané prostredníctvom úložiska tkaniva nádoru prsníka certifikovaného Kanadskou sieťou úložísk tkanív. Podľa protokolu schváleného Etickou komisiou pre výskum rakoviny prsníka BC a Univerzitou Britskej Kolumbie (H07-00463) všetky vzorky a klinické údaje pacientov získali informovaný písomný súhlas alebo formálne vzdali súhlas. Vzorky sú uložené v certifikovanej BioBanke (BRC-00290). Podrobné charakteristiky pacientov sú uvedené v tabuľkách S1 a S5. Na kryokonzerváciu sa skalpelom mechanicky rozloží vzorka nádoru pacienta a potom sa pretlačí cez 100-mikrónový filter, čím sa získa suspenzia jednotlivých buniek. Ascites pacienta sa centrifugoval pri 1500 otáčkach za minútu počas 10 minút pri teplote 4 °C, aby sa bunky peletovali a odstránil supernatant. Bunky získané z nádoru a ascitu sa kryokonzervovali v 50 % teplom inaktivovanom ľudskom sére AB (Sigma-Aldrich), 40 % RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) a 10 % dimetylsulfoxide. Tieto konzervované suspenzie jednotlivých buniek boli rozmrazené a použité na metabolomiku a stanovenie metabolitov opísaných nižšie.
Kompletné médium pozostáva z 0,22 μm filtrovaného 50:50 doplneného média RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM L-glutamínu (Thermo Fisher Scientific) doplneného 10 % tepelne inaktivovaným ľudským sérom AB (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM L-glutamínu (Thermo Fisher Scientific), 1 x roztoku penicilínu a streptomycínu (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) a 50 μMB-merkaptoetanolu. AimV (Invitrogen) je doplnené 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) a 2 mM L-glutamínu (Thermo Fisher Scientific). Farbiaci pufor pre prietokový cytometr pozostával z 0,22 μm filtrovaného fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS; Invitrogen) doplneného 3 % tepelne inaktivovaným ľudským sérom AB (Sigma). Pufor na obohatenie buniek sa skladá z 0,22 μm filtrovaného PBS a doplneného o 0,5 % tepelne inaktivovaného ľudského AB séra (Sigma-Aldrich).
V kompletnom médiu s teplotou 37 °C boli bunky farbené s 10 nM MT DR a 100 μM 2-NBDG počas 30 minút. Následne boli bunky farbené farbivom na viabilitu eF506 pri teplote 4 °C počas 15 minút. Bunky resuspendujte v FC Block (eBioscience) a Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), zrieďte v farbiacom pufri pre prietokovú cytometriu (podľa pokynov výrobcu) a inkubujte 10 minút pri izbovej teplote. Bunky farbite sadou protilátok (Tabuľka S2) v farbiacom pufri pre prietokovú cytometriu pri teplote 4 °C počas 20 minút. Pred analýzou bunky resuspendujte v farbiacom pufri pre prietokovú cytometriu (Cytek Aurora; konfigurácia 3L-16V-14B-8R). Na analýzu údajov o počte buniek použite SpectroFlo a FlowJo V10 a na vytvorenie údajov použite GraphPad Prism 8. Medián intenzity fluorescencie (MFI) 2-NBDG a MT DR bol logaritmicky normalizovaný a potom bol na štatistickú analýzu použitý párový t-test na zohľadnenie zhodných pacientov. Z analýzy odstráňte všetky populácie s menej ako 40 udalosťami; pred vykonaním štatistickej analýzy a vizualizácie údajov zadajte hodnotu MFI 1 pre všetky záporné hodnoty.
Na doplnenie stratégie manuálneho hradlovania vyššie uvedeného procesného panela sme použili úplnú anotáciu pomocou stromu obmedzení tvaru (FAUST) (21) na automatické priradenie buniek k populácii po eliminácii mŕtvych buniek vo FlowJo. Výstup sme spravovali manuálne, aby sme zlúčili populácie, ktoré sa zdajú byť nesprávne priradené (kombinácia PD1+ s PD1-nádorovými bunkami) a zachované populácie. Každá vzorka obsahuje v priemere viac ako 2 % buniek, čo je celkovo 11 populácií.
Na oddelenie PBMC od produktov separácie leukocytov sa použila centrifugácia s gradientom hustoty Ficoll (STEMCELL Technologies). CD8+ T bunky boli izolované z PBMC pomocou CD8 MicroBeads (Miltenyi) a expandované v kompletnom médiu pomocou TransAct (Miltenyi) počas 2 týždňov podľa pokynov výrobcu. Bunky boli ponechané 5 dní v kompletnom médiu obsahujúcom IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) a potom restimulované TransAct. Na 7. deň sa podľa pokynov výrobcu na obohatenie buniek v troch po sebe nasledujúcich kolách použili ľudské CD45 MicroBeads (Miltenyi). Bunky boli rozdelené na alikvotné podiely pre analýzu prietokovou cytometriou (ako je opísané vyššie) a jeden milión buniek bol trikrát alikvotne rozdelený pre analýzu LC-MS/MS. Vzorky boli spracované pomocou LC-MS/MS, ako je opísané nižšie. Hodnotu chýbajúceho metabolitu sme odhadli s iónovým číslom 1 000. Každá vzorka je pred analýzou normalizovaná podľa celkového počtu iónov (TIC), logaritmicky prepočítaná a automaticky normalizovaná v MetaboAnalystR.
Suspenzia jednotlivých buniek od každého pacienta bola rozmrazená a prefiltrovaná cez 40 μm filter do kompletného média (ako je opísané vyššie). Podľa protokolu výrobcu boli na obohatenie vzoriek o bunky CD8+, CD4+ a CD45- (na ľade) použité tri po sebe nasledujúce kolá pozitívnej selekcie magnetickou separáciou guľôčok s použitím MicroBeads (Miltenyi). Stručne povedané, bunky boli resuspendované v pufri na obohatenie buniek (ako je opísané vyššie) a spočítané. Bunky boli inkubované s ľudskými guľôčkami CD8, ľudskými guľôčkami CD4 alebo ľudskými guľôčkami CD45 (Miltenyi) pri teplote 4 °C počas 15 minút a potom premyté pufrom na obohatenie buniek. Vzorka bola prefiltrovaná cez kolónu LS (Miltenyi) a pozitívne a negatívne frakcie boli zhromaždené. Aby sa skrátilo trvanie a maximalizoval krok regenerácie buniek, frakcia CD8 sa potom použila na druhé kolo obohatenia CD4+ a frakcia CD4 sa použila na následné obohatenie CD45. Roztok sa uchovával na ľade počas celého procesu separácie.
Na prípravu vzoriek na analýzu metabolitov sa bunky raz premyli ľadovo studeným soľným roztokom a do každej vzorky sa pridal 1 ml 80 % metanolu, potom sa premiešali na vortexovom miešadle a rýchlo zmrazili v tekutom dusíku. Vzorky sa podrobili trom cyklom zmrazovania a rozmrazovania a centrifugovali sa pri 14 000 ot./min. počas 15 minút pri teplote 4 °C. Supernatant obsahujúci metabolity sa odparil do sucha. Metabolity sa znovu rozpustili v 50 μl 0,03 % kyseliny mravčej, premiešali sa na vortexovom miešadle a potom sa centrifugovali, aby sa odstránili zvyšky.
Metabolity extrahujte podľa vyššie uvedeného postupu. Supernatant preneste do fľaše pre vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu na metabolomický výskum. Na ošetrenie každej vzorky podobným počtom buniek použite protokol náhodného spracovania, aby ste predišli účinkom šarže. Vykonali sme kvalitatívne hodnotenie globálnych metabolitov, ktoré bolo predtým publikované na trojitom kvadrupólovom hmotnostnom spektrometri AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Chromatografická analýza a integrácia plochy píku sa vykonali pomocou softvéru MultiQuant verzie 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Na odhad hodnoty chýbajúceho metabolitu sa použil počet iónov 1000 a TIC každej vzorky sa použil na výpočet normalizovanej plochy píku každého detekovaného metabolitu, aby sa korekcia zmien zavedených inštrumentálnou analýzou zo spracovania vzorky. Po normalizácii TIC sa na logaritmickú konverziu a automatické škálovanie normatívnej čiary použije MetaboAnalystR(51) (predvolený parameter). Na vykonanie exploračnej analýzy rozdielov v metabolóme medzi typmi vzoriek sme použili PCA s balíkom vegánsky R a na analýzu pacientov sme použili analýzu čiastočnej redundancie. Na zoskupenie euklidovskej vzdialenosti medzi vzorkami sme použili Wardovu metódu na vytvorenie dendrogramu tepelnej mapy. Na identifikáciu rozdielne sa vyskytujúcich metabolitov v celom bunkovom type a mikroprostredí sme použili limmu (52) na štandardizovanej abundancii metabolitov. Pre zjednodušenie vysvetlenia používame parameter skupinového priemeru na špecifikáciu modelu a typy buniek v mikroprostredí považujeme za každú skupinu (n = 6 skupín); pre test významnosti sme vykonali tri opakované merania pre každý metabolit. Aby sme sa vyhli falošnej replikácii, pacient bol zahrnutý ako prekážka v návrhu limmy. Aby sme overili rozdiely v metabolitoch medzi rôznymi pacientmi, upravili sme limma model vrátane pacientov fixným spôsobom. Uvádzame významnosť vopred špecifikovaného kontrastu medzi typom buniek a mikroprostredím Padj < 0,05 (Benjaminiho-Hochbergova korekcia).
Po obohatení o vitalitu pomocou súpravy Miltenyi Dead Cell Removal Kit (životaschopnosť > 80 %) sa vykonalo sekvenovanie transkriptómu jednotlivých buniek na celkových živých zmrazených vzorkách ascitu a nádorov s použitím protokolu 10x 5′ génovej expresie. Analyzovalo sa päť prípadov so zhodnými nádormi a ascitom, hoci nízka životaschopnosť z jednej vzorky nádoru zabránila jej zahrnutiu. Aby sme dosiahli viacnásobný výber pacientov, skombinovali sme vzorky každého pacienta v dráhach 10x chrómového kontroléra a analyzovali sme ascites a nádorové miesta samostatne. Po sekvenovaní [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; priemerne 73 488 a 41 378 čítaní na bunku pre nádor a ascites]], použili sme CellSNP a Vireo (53) (na základe CellSNP ako Bežnému ľudskému SNP (VCF) poskytnutému GRCh38 je priradená identita darcu. Používame SNPRelate na odvodenie najbližšej identity (IBS) genotypového stavu pacienta (IBS), pričom vylučujeme nepriradené bunky a bunky identifikované ako duplexy a zodpovedajúce darcovia medzi vzorkami ascitu a nádoru (54). Na základe tejto úlohy sme si ponechali tri prípady s hojným zastúpením buniek v nádore a ascite pre následnú analýzu. Po vykonaní kroku hmotnostnej filtrácie v balení BioConductor scater (55) a scran (56) sa získalo 6975 buniek (2792 a 4183 buniek z nádoru a ascitu) na analýzu. Používame igraphovo (57) Louvainovo zhlukovanie zdieľanej siete najbližších susedov (SNN) na základe Jaccardovej vzdialenosti od zhlukovacích buniek podľa expresie. Klastre boli manuálne anotované k predpokladaným bunkovým typom na základe expresie markerových génov a vizualizované pomocou t-SNE. Cytotoxické T bunky sú definované expresiou CD8A a GZMA, s výnimkou subklastrov s nízkou expresiou ribozomálnych proteínov. Využili sme publikované údaje od Izara a kol. (16), vrátane ich vloženia t-SNE, ktoré môžu kontrolovať prekrývanie expresie medzi markermi imunitných buniek a expresiou NNMT.
PBMC boli oddelené od produktov separácie leukocytov (STEMCELL Technologies) pomocou gradientovej hustotnej centrifugácie Ficoll. Bunky CD3+ boli izolované z PBMC pomocou CD3 guľôčok (Miltenyi). V prítomnosti alebo neprítomnosti MNA boli bunky CD3+ aktivované s CD3 viazaným na platni (5 μg/ml), rozpustným CD28 (3 μg/ml) a IL-2 (300 U/ml; Proleukin). V posledný deň expanzie bola prietokovou cytometriou vyhodnotená životaschopnosť (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) a proliferácia (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific). Vyhodnoťte efektorovú funkciu stimuláciou buniek pomocou PMA (20 ng/ml) a ionomycínu (1 μg/ml) pomocou GolgiStopu počas 4 hodín a monitorujte CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) a TNFα-fluoresceín izotiokyanátu (FITC) (MAb11, BD). Stimulujte bunky qPCR a ChIP pomocou PMA (20 ng/ml) a ionomycínu (1 μg/ml) počas 4 hodín. Supernatant ELISA sa odobral pred a po stimulácii pomocou PMA (20 ng/ml) a ionomycínu (1 μg/ml) počas 4 hodín.
Na izoláciu RNA pomocou súpravy RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) postupujte podľa protokolu výrobcu. Na homogenizáciu vzorky použite QIAshredder (QIAGEN). Na syntézu komplementárnej DNA (cDNA) použite súpravu High-Capacity RNA to cDNA Kit (Thermo Fisher Scientific). Na kvantifikáciu génovej expresie (podľa protokolu výrobcu) použite TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) s nasledujúcimi sondami: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyd-3-fosfát z vodíka (GAPDH)] a Hs01010726_m1 (SLC22A2). Vzorky boli analyzované na systéme StepOnePlus real-time PCR (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) v rýchlej optickej 96-jamkovej reakčnej platni MicroAmp (Applied Biosystems) s optickým filmom MicroAmp. Akákoľvek hodnota Ct, ktorá presahuje 35, sa považuje za hodnotu nad detekčným prahom a označuje sa ako nedetekovateľná.
Vykonajte ChIP podľa predtým opísaného postupu (58). Stručne povedané, bunky boli ošetrené formaldehydom (konečná koncentrácia 1,42 %) a inkubované pri izbovej teplote počas 10 minút. Použite doplnený napučiavací pufor (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl a 0,1 % NP-40) na ľade počas 10 minút, potom resuspendujte v imunoprecipitačnom pufri podľa opísaného postupu (58). Vzorka bola potom sonikovaná s nasledujúcimi cyklami: 10 cyklov (20 1-sekundových impulzov) a statický čas 40 sekúnd. Inkubujte protilátky imunoglobulínu G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histónu H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) a SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) kvality ChIP so vzorkou pri 4 °C a pretrepávajte cez noc. Inkubujte guľôčky proteínu A (Thermo Fisher Scientific) so vzorkou pri teplote 4 °C za jemného trasenia počas 1 hodiny, potom použite chelexové guľôčky (Bio-Rad) na obohatenie DNA a proteinázu K (Thermo Fisher) na štiepenie proteínov. Promótor TNFα bol detegovaný pomocou PCR: dopredný smer, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; naopak, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produkt). Snímky boli vytvorené softvérom Image Lab (Bio-Rad) a kvantifikované pomocou softvéru ImageJ.
Supernatant bunkovej kultúry sa zozbieral podľa vyššie uvedeného postupu. Stanovenie sa uskutočnilo podľa postupov výrobcu súpravy ELISA pre ľudský TNFα (Invitrogen), súpravy ELISA pre ľudský IL-2 (Invitrogen) a súpravy ELISA pre ľudský IFN-γ (Abcam). Podľa protokolu výrobcu sa supernatant zriedil v pomere 1:100 na detekciu TNFα a IL-2 a v pomere 1:3 na detekciu IFN-γ. Na meranie absorbancie pri 450 nm sa použila čítačka EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer).
PBMC boli oddelené od produktov separácie leukocytov (STEMCELL Technologies) pomocou gradientovej hustotnej centrifugácie Ficoll. Bunky CD3+ boli izolované z PBMC pomocou CD3 guľôčok (Miltenyi). V prítomnosti alebo neprítomnosti MNA boli bunky CD3+ aktivované s CD3 viazaným na platni (5 μg/ml), rozpustným CD28 (3 μg/ml) a IL-2 (300 U/ml; Proleukin) počas 3 dní. Po 3 dňoch boli bunky zozbierané a premyté 0,9 % fyziologickým roztokom a peleta bola rýchlo zmrazená. Počítanie buniek bolo vykonané prietokovou cytometriou (Cytek Aurora; konfigurácia 3L-16V-14B-8R) s použitím 123count eBeads.
Metabolity extrahujte podľa vyššie uvedeného popisu. Vysušený extrakt bol rekonštituovaný v koncentrácii 4000 bunkových ekvivalentov/μl. Vzorku analyzujte chromatografiou s reverznými fázami (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) a kolónou CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, veľkosť častíc 1,6 μm, veľkosť pórov 120 Å; #186008500, Waters). Polárny hmotnostný spektrometer (6470, Agilent), v ktorom elektrosprejová ionizácia pracuje v pozitívnom móde. Mobilná fáza A je 0,1 % kyselina mravčia (v H2O), mobilná fáza B je 90 % acetonitril, 0,1 % kyselina mravčia. Gradient LC je 0 až 2 minúty pre 100 % A, 2 až 7,1 minúty pre 99 % B a 7,1 až 8 minút pre 99 % B. Potom sa kolóna znovu vyrovná s mobilnou fázou A pri prietoku 0,6 ml/min počas 3 minút. Prietok je 0,4 ml/min a komora kolóny sa zahreje na 50 °C. Na stanovenie retenčného času (RT) a transformácie (RT = 0,882 minúty, transformácia 1 = 137→94,1, transformácia 2 = 137→92, konverzia 3 = 137→78) sa použije čistý chemický štandard MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada). Keď všetky tri prechody nastanú v správnom retenčnom čase, na kvantifikáciu sa použije prechod 1, aby sa zabezpečila špecificita. Štandardná krivka MNA (Toronto Research Chemical Company) bola vytvorená šiestimi sériovými riedeniami zásobného roztoku (1 mg/ml) na získanie štandardov s koncentráciou 0,1, 1,0, 10 a 100 ng/ml a 1,0 a 10 μg/ml v uvedenom poradí. Detekčný limit je 1 ng/ml a lineárna odozva je medzi 10 ng/ml a 10 μg/ml. Každá injekcia dvoch mikrolitrov vzorky a štandardu sa používa na LC/MS analýzu a zmiešaná vzorka na kontrolu kvality sa aplikuje každých osem injekcií, aby sa zabezpečila stabilita analytickej platformy. Odozvy MNA všetkých bunkových vzoriek ošetrených MNA boli v lineárnom rozsahu testu. Analýza údajov sa vykonala pomocou softvéru na kvantitatívnu analýzu MassHunter (v9.0, Agilent).
Konštrukcia αFR-CAR druhej generácie bola prevzatá od Songa a kol. (59). Stručne povedané, konštrukt obsahuje nasledujúci obsah: vedúcu sekvenciu CD8a, variabilný fragment s jedným reťazcom špecifický pre ľudský αFR, pántovú a transmembránovú oblasť CD8a, intracelulárnu doménu CD27 a intracelulárnu doménu CD3z. Kompletná sekvencia CAR bola syntetizovaná pomocou GenScript a potom klonovaná do lentivírusového expresného vektora druhej generácie pred expresnou kazetou GFP použitou na vyhodnotenie účinnosti transdukcie.
Lentivírus sa produkuje transfekciou buniek HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); pestovaných v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu obsahujúcom 10 % fetálneho bovinného séra (FBS) a 1 % PenStrep a s použitím vektora CAR-GFP a baliacich plazmidov (psPAX2 a pMD2.G, Addgene) sa použije lipofekčný amín (Sigma-Aldrich). Supernatant obsahujúci vírus sa zozbieral 48 a 72 hodín po transfekcii, prefiltroval a zakoncentroval ultracentrifugáciou. Koncentrovaný vírusový supernatant sa skladuje pri teplote -80 °C až do transdukcie.
PBMC sa oddelia od produktov separácie leukocytov zdravých darcov (STEMCELL Technologies) pomocou gradientovej hustotnej centrifugácie Ficoll. Na izoláciu CD8+ buniek z PBMC sa použijú mikroguličky CD8 s pozitívnou selekciou (Miltenyi). T bunky sa stimulujú pomocou TransAct (Miltenyi) a v médiu TexMACS [Miltenyi; doplnené o 3 % tepelne inaktivovaného ľudského séra, 1 % PenStrep a IL-2 (300 U/ml)]. Dvadsaťštyri hodín po stimulácii sa T bunky transdukujú lentivírusom (10 μl koncentrovaného vírusového supernatantu na 106 buniek). 1 až 3 dni po transdukcii na Cytek Aurora (na FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) sa vyhodnotí expresia GFP buniek, aby sa preukázala účinnosť transdukcie najmenej 30 %.
Bunky CAR-T boli kultivované 24 hodín v médiu Immunocult (STEMCELL Technologies; doplnené 1 % PenStrep) za nasledujúcich podmienok: neošetrené, ošetrené 250 μM adenozínom alebo 10 mM MNA. Po predbežnej úprave boli bunky CAR-T premyté PBS a zmiešané s 20 000 bunkami SK-OV-3 [ATCC; v médiu McCoy 5A (Sigma-Aldrich) doplnenom 10 % FBS a 1 % PenStrep pri 10: Pomer efektora k cieľu 1 bol amplifikovaný v troch opakovaniach v doplnenom médiu Immunocult. Bunky SK-OV-3 a bunky SK-OV-3 lyzované digitalisovým saponínom (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) boli použité ako negatívne a pozitívne kontroly. Po 24 hodinách kokultivácie bol supernatant zozbieraný a laktátdehydrogenáza (LDH) bola meraná podľa pokynov výrobcu (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatant LDH bol zriedený v pomere 1:50 v LDH pufri. Percento usmrtenia bolo merané pomocou nasledujúceho vzorca: percento usmrtenia = percento korekcie / maximálna miera usmrtenia x 100 %, kde percento korekcie = iba kokultivácia T buniek a maximálna miera usmrtenia = pozitívna kontrola - negatívna kontrola.
Ako je popísané v texte alebo materiáloch a metódach, na štatistickú analýzu použite GraphPad Prism 8, Microsoft Excel alebo R v3.6.0. Ak sa od toho istého pacienta odoberie viacero vzoriek (napríklad ascites a nádor), použijeme párový t-test alebo pacienta podľa potreby zahrnieme ako náhodný efekt do lineárneho alebo zovšeobecneného modelu. Pre metabolomickú analýzu sa test dôležitosti vykonáva v troch opakovaniach.
Doplňujúce materiály k tomuto článku nájdete na stránke http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný podľa podmienok licencie Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ktorá umožňuje použitie, distribúciu a reprodukciu v akomkoľvek médiu, pokiaľ konečné použitie nie je na komerčný zisk a predpokladom je, že pôvodné dielo je správne. Zdroj.
Poznámka: Žiadame vás o poskytnutie vašej e-mailovej adresy iba preto, aby osoba, ktorú odporúčate stránke, vedela, že chcete, aby videla daný e-mail a že nejde o spam. Nebudeme zaznamenávať žiadne e-mailové adresy.
Táto otázka sa používa na overenie, či ste návštevník, a na zabránenie automatického odosielania spamu.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. J.Rardinph), J. Bellalph, Rardini Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA prispieva k imunosupresii T buniek a predstavuje potenciálny cieľ imunoterapie pri liečbe rakoviny u ľudí.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. J.Rardinph), J. Bellalph, Rardini Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA prispieva k imunosupresii T buniek a predstavuje potenciálny cieľ imunoterapie pri liečbe rakoviny u ľudí.
©2021 American Association for the Advancement of Science. všetky práva vyhradené. AAAS je partnerom HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.