Kyselina propiónová (PPA), antimykotikum a bežná potravinová prísada, preukázateľne spôsobuje abnormálny neurovývoj u myší sprevádzaný gastrointestinálnou dysfunkciou, ktorá môže byť spôsobená črevnou dysbiózou. Bola naznačená súvislosť medzi expozíciou PPA v strave a dysbiózou črevnej mikrobioty, ale nebola priamo skúmaná. V tejto štúdii sme skúmali zmeny v zložení črevnej mikrobioty súvisiace s PPA, ktoré môžu viesť k dysbióze. Črevné mikrobiómy myší kŕmených neošetrenou stravou (n=9) a stravou obohatenou o PPA (n=13) boli sekvenované pomocou metagenomického sekvenovania s dlhým dosahom s cieľom posúdiť rozdiely v mikrobiálnom zložení a bakteriálnych metabolických dráhach. PPA v strave bola spojená so zvýšením počtu významných taxónov vrátane niekoľkých druhov Bacteroides, Prevotella a Ruminococcus, ktorých členovia boli predtým zapojení do produkcie PPA. Mikrobiómy myší vystavených PPA mali tiež viac dráh súvisiacich s metabolizmom lipidov a biosyntézou steroidných hormónov. Naše výsledky naznačujú, že PPA môže zmeniť črevnú mikrobiotu a s ňou spojené metabolické dráhy. Tieto pozorované zmeny zdôrazňujú, že konzervačné látky klasifikované ako bezpečné na konzumáciu môžu ovplyvniť zloženie črevnej mikrobioty a následne aj ľudské zdravie. Spomedzi nich sa vyberá P, G alebo S v závislosti od analyzovanej úrovne klasifikácie. Na minimalizáciu vplyvu falošne pozitívnych klasifikácií sa prijal minimálny prah relatívnej abundancie 1e-4 (1/10 000 čítaní). Pred štatistickou analýzou sa relatívne abundancie hlásené Brackenom (fraction_total_reads) transformovali pomocou transformácie centrovaného logaritmického pomeru (CLR) (Aitchison, 1982). Metóda CLR bola zvolená na transformáciu údajov, pretože je invariantná voči mierke a postačujúca pre neriedke súbory údajov (Gloor a kol., 2017). Transformácia CLR používa prirodzený logaritmus. Údaje o počtoch hlásené Brackenom boli normalizované pomocou relatívneho logaritmického výrazu (RLE) (Anders a Huber, 2010). Obrázky boli vygenerované pomocou kombinácie matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 a sekvenčných logaritmov (Gloor a kol., 2017). 0.12.2 a stantanotácie v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier a kol., 2022). Pomer Bacillus/Bacteroidetes bol vypočítaný pre každú vzorku pomocou normalizovaného počtu baktérií. Hodnoty uvedené v tabuľkách sú zaokrúhlené na 4 desatinné miesta. Simpsonov index diverzity bol vypočítaný pomocou skriptu alpha_diversity.py, ktorý je súčasťou balíka KrakenTools v. 1.2 (Lu a kol., 2022). V skripte je uvedená Brackenova správa a pre parameter -an je uvedený Simpsonov index „Si“. Významné rozdiely v početnosti boli definované ako priemerné rozdiely CLR ≥ 1 alebo ≤ -1. Priemerný rozdiel CLR ±1 označuje 2,7-násobné zvýšenie početnosti daného typu vzorky. Znamienko (+/-) označuje, či je taxón početnejší vo vzorke PPA a v kontrolnej vzorke. Významnosť bola stanovená pomocou Mann-Whitneyho U testu (Virtanen a kol., 2020). Použil sa softvér Statsmodels v. 0.14 (Benjamini a Hochberg, 1995; Seabold a Perktold, 2010) a na korekciu viacnásobného testovania sa použil Benjaminiho-Hochbergov postup. Ako prahová hodnota na určenie štatistickej významnosti sa použila upravená p-hodnota ≤ 0,05.
Ľudský mikrobióm sa často označuje ako „posledný orgán tela“ a zohráva dôležitú úlohu v ľudskom zdraví (Baquero a Nombela, 2012). Najmä črevný mikrobióm je uznávaný pre svoj celosystémový vplyv a úlohu v mnohých základných funkciách. Komenzálne baktérie sú v čreve hojné, zaberajú viacero ekologických niek, využívajú živiny a súťažia s potenciálnymi patogénmi (Jandhyala a kol., 2015). Rôzne bakteriálne zložky črevnej mikrobioty sú schopné produkovať základné živiny, ako sú vitamíny, a podporovať trávenie (Rowland a kol., 2018). Ukázalo sa tiež, že bakteriálne metabolity ovplyvňujú vývoj tkanív a zlepšujú metabolické a imunitné dráhy (Heijtz a kol., 2011; Yu a kol., 2022). Zloženie ľudského črevného mikrobiómu je mimoriadne rozmanité a závisí od genetických a environmentálnych faktorov, ako je strava, pohlavie, lieky a zdravotný stav (Kumbhare a kol., 2019).
Materská strava je kritickou súčasťou vývoja plodu a novorodenca a predpokladaným zdrojom zlúčenín, ktoré môžu ovplyvniť vývoj (Bazer a kol., 2004; Innis, 2014). Jednou z takýchto zaujímavých zlúčenín je kyselina propiónová (PPA), vedľajší produkt mastnej kyseliny s krátkym reťazcom získaný bakteriálnou fermentáciou a potravinárska prísada (den Besten a kol., 2013). PPA má antibakteriálne a antifungálne vlastnosti, a preto sa používa ako konzervačná látka v potravinách a v priemyselných aplikáciách na inhibíciu rastu plesní a baktérií (Wemmenhove a kol., 2016). PPA má rôzne účinky v rôznych tkanivách. V pečeni má PPA protizápalové účinky tým, že ovplyvňuje expresiu cytokínov v makrofágoch (Kawasoe a kol., 2022). Tento regulačný účinok bol pozorovaný aj v iných imunitných bunkách, čo vedie k zníženiu zápalu (Haase a kol., 2021). Opačný účinok bol však pozorovaný v mozgu. Predchádzajúce štúdie ukázali, že expozícia PPA vyvoláva u myší správanie podobné autizmu (El-Ansary a kol., 2012). Ďalšie štúdie ukázali, že PPA môže indukovať gliózu a aktivovať prozápalové dráhy v mozgu (Abdelli a kol., 2019). Keďže PPA je slabá kyselina, môže difundovať cez črevný epitel do krvného obehu a tak prekonávať reštriktívne bariéry vrátane hematoencefalickej bariéry, ako aj placenty (Stinson a kol., 2019), čo zdôrazňuje význam PPA ako regulačného metabolitu produkovaného baktériami. Hoci potenciálna úloha PPA ako rizikového faktora autizmu je v súčasnosti predmetom skúmania, jej účinky na jedincov s autizmom môžu presahovať rámec indukcie neurálnej diferenciácie.
Gastrointestinálne príznaky, ako je hnačka a zápcha, sú bežné u pacientov s neurovývinovými poruchami (Cao a kol., 2021). Predchádzajúce štúdie ukázali, že mikrobióm pacientov s poruchami autistického spektra (PAS) sa líši od mikrobiómu zdravých jedincov, čo naznačuje prítomnosť dysbiózy črevnej mikrobioty (Finegold a kol., 2010). Podobne sa charakteristiky mikrobiómu pacientov so zápalovými ochoreniami čriev, obezitou, Alzheimerovou chorobou atď. tiež líšia od charakteristík zdravých jedincov (Turnbaugh a kol., 2009; Vogt a kol., 2017; Henke a kol., 2019). Doteraz však nebola preukázaná žiadna kauzálna súvislosť medzi črevným mikrobiómom a neurologickými ochoreniami alebo príznakmi (Yap a kol., 2021), hoci sa predpokladá, že niekoľko bakteriálnych druhov zohráva úlohu v niektorých z týchto chorobných stavov. Napríklad Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio a ďalšie rody sú hojnejšie zastúpené v mikrobiote pacientov s autizmom (Tomova a kol., 2015; Golubeva a kol., 2017; Cristiano a kol., 2018; Zurita a kol., 2020). Je pozoruhodné, že druhy niektorých z týchto rodov majú gény spojené s produkciou PPA (Reichardt a kol., 2014; Yun a Lee, 2016; Zhang a kol., 2019; Baur a Dürre, 2023). Vzhľadom na antimikrobiálne vlastnosti PPA môže byť zvýšenie jej množstva prospešné pre rast baktérií produkujúcich PPA (Jacobson a kol., 2018). Prostredie bohaté na PFA teda môže viesť k zmenám v črevnej mikrobiote vrátane gastrointestinálnych patogénov, čo môžu byť potenciálne faktory vedúce ku gastrointestinálnym symptómom.
Ústrednou otázkou vo výskume mikrobiómu je, či sú rozdiely v mikrobiálnom zložení príčinou alebo príznakom základných ochorení. Prvým krokom k objasneniu komplexného vzťahu medzi stravou, črevným mikrobiómom a neurologickými ochoreniami je posúdenie vplyvu stravy na mikrobiálne zloženie. Na tento účel sme použili metagenomické sekvenovanie s dlhým čítaním na porovnanie črevného mikrobiómu potomstva myší kŕmených stravou bohatou na PPA alebo s nízkym obsahom PPA. Potomstvo bolo kŕmené rovnakou stravou ako ich matky. Predpokladali sme, že strava bohatá na PPA bude mať za následok zmeny v mikrobiálnom zložení čreva a mikrobiálnych funkčných dráhach, najmä tých, ktoré súvisia s metabolizmom PPA a/alebo produkciou PPA.
V tejto štúdii boli použité transgénne myši FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories), ktoré nadmerne exprimujú zelený fluorescenčný proteín (GFP) pod kontrolou glia-špecifického promótora GFAP podľa pokynov Výboru pre inštitucionálnu starostlivosť o zvieratá a ich používanie na University of Central Florida (UCF-IACUC) (číslo povolenia na používanie zvierat: PROTO202000002). Po odstavení boli myši umiestnené jednotlivo v klietkach s 1 – 5 myšami každého pohlavia na klietku. Myši boli kŕmené ad libitum buď purifikovanou kontrolnou diétou (modifikovaná otvorená štandardná diéta, 16 kcal% tuku), alebo diétou doplnenou propionátom sodným (modifikovaná otvorená štandardná diéta, 16 kcal% tuku, obsahujúca 5 000 ppm propionátu sodného). Použité množstvo propionátu sodného bolo ekvivalentné 5 000 mg PFA/kg celkovej hmotnosti potravy. Toto je najvyššia koncentrácia PPA schválená na použitie ako konzervačná látka v potravinách. Na prípravu tejto štúdie boli rodičovské myši kŕmené oboma druhmi krmiva 4 týždne pred párením a pokračovalo sa v podávaní počas celej gravidity matky. Potomstvo myší [22 myší, 9 kontrolných (6 samcov, 3 samice) a 13 PPA (4 samce, 9 samíc)] bolo odstavené a potom pokračovalo v podávaní rovnakej krmiva ako matky počas 5 mesiacov. Potomstvo myší bolo usmrtené vo veku 5 mesiacov a ich črevný obsah bol zozbieraný a najprv uskladnený v 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmavkách pri teplote -20 °C a potom prenesený do mrazničky pri teplote -80 °C, kým sa nevyčerpala hostiteľská DNA a neextrahovali sa mikrobiálne nukleové kyseliny.
Hostiteľská DNA bola odstránená podľa upraveného protokolu (Charalampous a kol., 2019). Stručne povedané, obsah stolice bol prenesený do 500 µl InhibitEX (Qiagen, kat. č./ID: 19593) a uskladnený zmrazený. Na extrakciu spracujte maximálne 1 – 2 pelety stolice. Obsah stolice bol potom mechanicky homogenizovaný pomocou plastovej tĺčika vo vnútri skúmavky za vzniku suspenzie. Vzorky centrifugujte pri 10 000 RCF počas 5 minút alebo kým sa vzorky nepeletujú, potom odsajte supernatant a peletu resuspendujte v 250 µl 1× PBS. Do vzorky pridajte 250 µl 4,4 % roztoku saponínu (TCI, číslo produktu S0019) ako detergent na uvoľnenie membrán eukaryotických buniek. Vzorky boli jemne premiešané do hladka a inkubované pri izbovej teplote počas 10 minút. Následne sa na rozrušenie eukaryotických buniek do vzorky pridalo 350 μl vody bez nukleáz, inkubovalo sa 30 sekúnd a potom sa pridalo 12 μl 5 M NaCl. Vzorky sa potom centrifugovali pri 6000 RCF počas 5 minút. Supernatant sa odsal a pelet sa resuspendoval v 100 μl 1X PBS. Na odstránenie hostiteľskej DNA sa pridalo 100 μl pufra HL-SAN (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml vody bez nukleáz) a 10 μl enzýmu HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Vzorky boli dôkladne premiešané pipetovaním a inkubované pri teplote 37 °C počas 30 minút pri 800 ot./min. na zariadení Eppendorf™ ThermoMixer C. Po inkubácii boli centrifugované pri 6000 RCF počas 3 minút a dvakrát premyté s 800 µl a 1000 µl 1X PBS. Nakoniec boli pelety resuspendované v 100 µl 1X PBS.
Celková bakteriálna DNA bola izolovaná pomocou súpravy New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, kat. č. T3010L). Štandardný operačný postup dodaný so súpravou je mierne upravený. Pred operáciou inkubujte a udržiavajte vodu bez nukleáz pri teplote 60 °C pre konečnú eluciu. Do každej vzorky pridajte 10 µl proteinázy K a 3 µl RNázy A. Potom pridajte 100 µl lyzačného pufra buniek a jemne premiešajte. Vzorky boli potom inkubované v Eppendorf™ ThermoMixer C pri teplote 56 °C a 1400 ot./min. počas najmenej 1 hodiny a maximálne 3 hodín. Inkubované vzorky boli centrifugované pri 12 000 RCF počas 3 minút a supernatant z každej vzorky bol prenesený do samostatnej 1,5 ml mikrocentrifugácie obsahujúcej 400 µl väzbového roztoku. Skúmavky boli potom pulzne vortexované počas 5 – 10 sekúnd v 1-sekundových intervaloch. Celý kvapalný obsah každej vzorky (približne 600 – 700 µl) preneste do filtračnej kazety umiestnenej v prietokovej zbernej skúmavke. Skúmavky boli centrifugované pri 1 000 RCF počas 3 minút, aby sa umožnila počiatočná väzba DNA, a potom boli centrifugované pri 12 000 RCF počas 1 minúty, aby sa odstránila zvyšková kvapalina. Kolóna so vzorkou bola prenesená do novej zbernej skúmavky a potom dvakrát premytá. Pri prvom premytí pridajte do každej skúmavky 500 µl premývacieho pufra. Skúmavku 3 – 5-krát prevráťte a potom centrifugujte pri 12 000 RCF počas 1 minúty. Kvapalinu zo zbernej skúmavky vylejte a filtračnú kazetu vložte späť do tej istej zbernej skúmavky. Pri druhom premytí pridajte do filtra 500 µl premývacieho pufra bez prevracania. Vzorky boli centrifugované pri 12 000 RCF počas 1 minúty. Filter preneste do 1,5 ml skúmavky LoBind® a pridajte 100 µl predhriatej vody bez nukleáz. Filtre boli inkubované pri izbovej teplote počas 1 minúty a potom centrifugované pri 12 000 RCF počas 1 minúty. Eluovaná DNA bola skladovaná pri teplote -80 °C.
Koncentrácia DNA bola kvantifikovaná pomocou fluorometra Qubit™ 4.0. DNA bola pripravená pomocou súpravy Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (kat. č. Q33231) podľa pokynov výrobcu. Distribúcia dĺžky fragmentov DNA bola meraná pomocou zariadenia Aglient™ 4150 alebo 4200 TapeStation. DNA bola pripravená pomocou reagencií Agilent™ Genomic DNA Reagents (kat. č. 5067-5366) a Genomic DNA ScreenTape (kat. č. 5067-5365). Príprava knižnice bola vykonaná pomocou súpravy Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) podľa pokynov výrobcu. DNA bola sekvenovaná pomocou sekvenátora ONT GridION™ Mk1 s prietokovou kyvetou Min106D (R 9.4.1). Nastavenia sekvenovania boli: vysoko presné volanie báz, minimálna hodnota q 9, nastavenie čiarového kódu a orezanie čiarového kódu. Vzorky boli sekvenované 72 hodín, po ktorých boli údaje z bázického volania odoslané na ďalšie spracovanie a analýzu.
Bioinformatické spracovanie sa vykonalo pomocou predtým opísaných metód (Greenman a kol., 2024). Súbory FASTQ získané sekvenovaním boli rozdelené do adresárov pre každú vzorku. Pred bioinformatickou analýzou boli údaje spracované pomocou nasledujúceho postupu: najprv boli súbory FASTQ vzoriek zlúčené do jedného súboru FASTQ. Potom boli čítania kratšie ako 1000 bp filtrované pomocou Filtlong v. 0.2.1, pričom jediný zmenený parameter bol –min_length 1000 (Wick, 2024). Pred ďalším filtrovaním bola kvalita čítania kontrolovaná pomocou NanoPlot v. 1.41.3 s nasledujúcimi parametrami: –fastq –plots dot –N50 -o
Pre taxonomickú klasifikáciu boli čítania a zostavené kontigy klasifikované pomocou Kraken2 v. 2.1.2 (Wood a kol., 2019). Generujte správy a výstupné súbory pre čítania a zostavy. Na analýzu čítaní a zostáv použite možnosť –use-names. Pre segmenty čítania sú zadané možnosti –gzip-compressed a –paired. Relatívna abundancia taxónov v metagenómoch bola odhadnutá pomocou Bracken v. 2.8 (Lu a kol., 2017). Najprv sme vytvorili databázu kmer obsahujúcu 1000 báz pomocou bracken-build s nasledujúcimi parametrami: -d
Génová anotácia a odhad relatívnej abundancie boli vykonané pomocou modifikovanej verzie protokolu opísaného Marangom a kol. (Maranga a kol., 2023). Najprv boli zo všetkých zostáv odstránené kontigy kratšie ako 500 bp pomocou SeqKit v. 2.5.1 (Shen a kol., 2016). Vybrané zostavy boli potom zlúčené do pan-metagenómu. Otvorené čítacie rámce (ORF) boli identifikované pomocou Prodigal v. 1.0.1 (paralelná verzia Prodigal v. 2.6.3) s nasledujúcimi parametrami: -d
Gény boli najprv zoskupené podľa ortologických (KO) identifikátorov Kjótskej encyklopédie génov a genómov (KEGG), ktoré priradil eggNOG, aby sa porovnala abundancia génových dráh. Gény bez knockoutov alebo gény s viacerými knockoutmi boli pred analýzou odstránené. Následne sa vypočítala priemerná abundancia každého KO na vzorku a vykonala sa štatistická analýza. Gény metabolizmu PPA boli definované ako akýkoľvek gén, ktorému bol v stĺpci KEGG_Pathway priradený riadok ko00640, čo naznačuje úlohu v metabolizme propionátu podľa KEGG. Gény identifikované ako spojené s produkciou PPA sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1 (Reichardt a kol., 2014; Yang a kol., 2017). Na identifikáciu génov metabolizmu a produkcie PPA, ktoré boli v každom type vzorky významne hojnejšie, boli vykonané permutačné testy. Pre každý analyzovaný gén bolo vykonaných tisíc permutácií. Ako hraničná hodnota na určenie štatistickej významnosti bola použitá p-hodnota 0,05. Funkčné anotácie boli priradené jednotlivým génom v rámci klastra na základe anotácií reprezentatívnych génov v rámci klastra. Taxóny spojené s metabolizmom PPA a/alebo produkciou PPA bolo možné identifikovať porovnaním kontigových ID vo výstupných súboroch Kraken2 s rovnakými kontigovými ID zachovanými počas funkčnej anotácie pomocou eggNOG. Testovanie významnosti sa vykonalo pomocou Mann-Whitneyho U testu opísaného predtým. Korekcia pre viacnásobné testovanie sa vykonala pomocou Benjaminiho-Hochbergovho postupu. Ako hraničná hodnota na určenie štatistickej významnosti sa použila p-hodnota ≤ 0,05.
Rozmanitosť črevného mikrobiómu myší bola hodnotená pomocou Simpsonovho indexu diverzity. Medzi kontrolnými vzorkami a vzorkami PPA neboli pozorované žiadne významné rozdiely z hľadiska rodovej a druhovej diverzity (p-hodnota pre rod: 0,18, p-hodnota pre druh: 0,16) (Obrázok 1). Mikrobiálne zloženie bolo potom porovnané pomocou analýzy hlavných komponentov (PCA). Obrázok 2 zobrazuje zhlukovanie vzoriek podľa ich kmeňov, čo naznačuje, že medzi vzorkami PPA a kontrolnými vzorkami existovali rozdiely v druhovom zložení mikrobiómov. Toto zhlukovanie bolo menej výrazné na úrovni rodu, čo naznačuje, že PPA ovplyvňuje určité baktérie (Doplnkový obrázok 1).
Obrázok 1. Alfa diverzita rodov a druhové zloženie črevného mikrobiómu myši. Krabicové grafy znázorňujúce Simpsonove indexy diverzity rodov (A) a druhov (B) v PPA a kontrolných vzorkách. Významnosť bola stanovená pomocou Mann-Whitneyho U testu a viacnásobná korekcia bola vykonaná pomocou Benjaminiho-Hochbergovho postupu. ns, p-hodnota nebola významná (p>0,05).
Obrázok 2. Výsledky analýzy hlavných komponentov zloženia črevného mikrobiómu myši na úrovni druhu. Graf analýzy hlavných komponentov zobrazuje rozloženie vzoriek v rámci ich prvých dvoch hlavných komponentov. Farby označujú typ vzorky: myši vystavené PPA sú fialové a kontrolné myši sú žlté. Hlavné komponenty 1 a 2 sú vynesené na osi x a osi y a sú vyjadrené ako ich vysvetlený pomer rozptylu.
Použitím transformovaných údajov o počte RLE sa pozoroval významný pokles mediánu pomeru Bacteroidetes/Bacilli u kontrolných myší a myší PPA (kontrola: 9,66, PPA: 3,02; p-hodnota = 0,0011). Tento rozdiel bol spôsobený vyššou abundanciou Bacteroidetes u myší PPA v porovnaní s kontrolnými skupinami, hoci rozdiel nebol významný (priemerná CLR kontroly: 5,51, priemerná CLR PPA: 6,62; p-hodnota = 0,054), zatiaľ čo abundancia Bacteroidetes bola podobná (priemerná CLR kontroly: 7,76, priemerná CLR PPA: 7,60; p-hodnota = 0,18).
Analýza početnosti taxonomických členov črevného mikrobiómu ukázala, že 1 kmeň a 77 druhov sa medzi vzorkami PPA a kontrolnými vzorkami významne líšili (doplnková tabuľka 2). Početnosť 59 druhov vo vzorkách PPA bola významne vyššia ako v kontrolných vzorkách, zatiaľ čo početnosť iba 16 druhov v kontrolných vzorkách bola vyššia ako vo vzorkách PPA (obrázok 3).
Obrázok 3. Rozdielna abundancia taxónov v črevnom mikrobióme myší PPA a kontrolných myší. Volcano grafy zobrazujú rozdiely v abundancii rodov (A) alebo druhov (B) medzi vzorkami PPA a kontrolnými vzorkami. Sivé bodky označujú žiadny významný rozdiel v abundancii taxónov. Farebné bodky označujú významné rozdiely v abundancii (p-hodnota ≤ 0,05). 20 najvýznamnejších taxónov s najväčšími rozdielmi v abundancii medzi typmi vzoriek je zobrazených červenou a svetlomodrou farbou (kontrolné vzorky a vzorky PPA). Žlté a fialové bodky boli najmenej 2,7-krát hojnejšie v kontrolných vzorkách alebo vzorkách PPA ako v kontrolných vzorkách. Čierne bodky predstavujú taxóny s významne odlišnou abundanciou, s priemernými rozdielmi CLR medzi -1 a 1. Hodnoty P boli vypočítané pomocou Mann-Whitneyho U testu a korigované na viacnásobné testovanie pomocou Benjaminiho-Hochbergovho postupu. Tučné priemerné rozdiely CLR označujú významné rozdiely v abundancii.
Po analýze mikrobiálneho zloženia čreva sme vykonali funkčnú anotáciu mikrobiómu. Po odfiltrovaní génov nízkej kvality bolo vo všetkých vzorkách identifikovaných celkovo 378 355 unikátnych génov. Transformovaná abundancia týchto génov bola použitá na analýzu hlavných komponentov (PCA) a výsledky ukázali vysoký stupeň zhlukovania typov vzoriek na základe ich funkčných profilov (obrázok 4).
Obrázok 4. Výsledky PCA s použitím funkčného profilu črevného mikrobiómu myši. PCA graf zobrazuje rozloženie vzoriek v ich prvých dvoch hlavných zložkách. Farby označujú typ vzorky: myši vystavené PPA sú fialové a kontrolné myši žlté. Hlavné zložky 1 a 2 sú vynesené na osi x a osi y a sú vyjadrené ako ich vysvetlený pomer rozptylu.
Ďalej sme skúmali početnosť knockoutov KEGG v rôznych typoch vzoriek. Celkovo bolo identifikovaných 3648 unikátnych knockoutov, z ktorých 196 bolo významne početnejších v kontrolných vzorkách a 106 bolo viac vo vzorkách PPA (obrázok 5). V kontrolných vzorkách bolo detegovaných celkovo 145 génov a vo vzorkách PPA 61 génov s významne odlišnými zastúpeniami. Dráhy súvisiace s metabolizmom lipidov a aminocukrov boli vo vzorkách PPA významne bohatšie (doplnková tabuľka 3). Dráhy súvisiace s metabolizmom dusíka a systémami prenosu síry boli v kontrolných vzorkách významne bohatšie (doplnková tabuľka 3). Početnosť génov súvisiacich s metabolizmom aminocukrov/nukleotidov (ko:K21279) a metabolizmom inozitolfosfátu (ko:K07291) bola významne vyššia vo vzorkách PPA (obrázok 5). Kontrolné vzorky mali významne viac génov súvisiacich s metabolizmom benzoátu (ko:K22270), metabolizmom dusíka (ko:K00368) a glykolýzou/glukoneogenézou (ko:K00131) (obrázok 5).
Obr. 5. Rozdielna abundancia KO v črevnom mikrobióme myší PPA a kontrolných myší. Sopkový graf znázorňuje rozdiely v abundancii funkčných skupín (KO). Sivé bodky označujú KO, ktorých abundancia sa medzi typmi vzoriek významne nelíšila (p-hodnota > 0,05). Farebné bodky označujú významné rozdiely v abundancii (p-hodnota ≤ 0,05). 20 KO s najväčšími rozdielmi v abundancii medzi typmi vzoriek je zobrazených červenou a svetlomodrou farbou, čo zodpovedá kontrolným vzorkám a vzorkám PPA. Žlté a fialové bodky označujú KO, ktoré boli najmenej 2,7-krát hojnejšie v kontrolných vzorkách a vzorkách PPA. Čierne bodky označujú KO s významne odlišnou abundanciou, s priemernými rozdielmi CLR medzi -1 a 1. Hodnoty P boli vypočítané pomocou Mann-Whitneyho U testu a upravené pre viacnásobné porovnania pomocou Benjaminiho-Hochbergovho postupu. NaN označuje, že KO nepatrí do dráhy v KEGG. Tučné zvýraznené priemerné hodnoty rozdielu CLR označujú významné rozdiely v abundancii. Podrobné informácie o dráhach, ku ktorým patria uvedené KO, nájdete v doplnkovej tabuľke 3.
Spomedzi anotovaných génov malo 1601 génov významne odlišné zastúpenie medzi typmi vzoriek (p ≤ 0,05), pričom každý gén bol najmenej 2,7-krát hojnejší. Z týchto génov boli 4 gény hojnejšie v kontrolných vzorkách a 1597 génov bolo hojnejších vo vzorkách PPA. Keďže PPA má antimikrobiálne vlastnosti, skúmali sme zastúpenie génov metabolizmu a produkcie PPA medzi typmi vzoriek. Spomedzi 1332 génov súvisiacich s metabolizmom PPA bolo 27 génov významne hojnejších v kontrolných vzorkách a 12 génov bolo hojnejších vo vzorkách PPA. Spomedzi 223 génov súvisiacich s produkciou PPA bol 1 gén významne hojnejší vo vzorkách PPA. Obrázok 6A ďalej demonštruje vyššie zastúpenie génov zapojených do metabolizmu PPA s významne vyšším zastúpením v kontrolných vzorkách a veľkými veľkosťami účinku, zatiaľ čo obrázok 6B zvýrazňuje jednotlivé gény s významne vyšším zastúpením pozorovaným vo vzorkách PPA.
Obr. 6. Rozdielna abundancia génov súvisiacich s PPA v črevnom mikrobióme myši. Volcano grafy znázorňujú rozdiely v abundancii génov spojených s metabolizmom PPA (A) a produkciou PPA (B). Sivé bodky označujú gény, ktorých abundancia sa medzi typmi vzoriek významne nelíšila (p-hodnota > 0,05). Farebné bodky označujú významné rozdiely v abundancii (p-hodnota ≤ 0,05). 20 génov s najväčšími rozdielmi v abundancii je zobrazených červenou a svetlomodrou farbou (kontrolné vzorky a vzorky PPA). Abundancia žltých a fialových bodiek bola najmenej 2,7-krát vyššia v kontrolných vzorkách a vzorkách PPA ako v kontrolných vzorkách. Čierne bodky predstavujú gény s významne odlišnou abundanciou, s priemernými rozdielmi CLR medzi -1 a 1. Hodnoty P boli vypočítané pomocou Mann-Whitneyho U testu a korigované na viacnásobné porovnania pomocou Benjaminiho-Hochbergovho postupu. Gény zodpovedajú reprezentatívnym génom v neredundantnom katalógu génov. Názvy génov pozostávajú zo symbolu KEGG označujúceho gén KO. Tučné priemerné rozdiely CLR označujú významne odlišné abundancie. Pomlčka (-) označuje, že v databáze KEGG nie je pre daný gén žiadny symbol.
Taxóny s génmi súvisiacimi s metabolizmom a/alebo produkciou PPA boli identifikované porovnaním taxonomickej identity kontigov s kontigovým ID génu. Na úrovni rodu sa zistilo, že 130 rodov malo gény súvisiace s metabolizmom PPA a 61 rodov malo gény súvisiace s produkciou PPA (doplnková tabuľka 4). Žiadny rod však nevykazoval významné rozdiely v početnosti (p > 0,05).
Na úrovni druhov sa zistilo, že 144 bakteriálnych druhov malo gény spojené s metabolizmom PPA a 68 bakteriálnych druhov malo gény spojené s produkciou PPA (doplnková tabuľka 5). Medzi metabolizátormi PPA osem baktérií vykazovalo významný nárast početnosti medzi typmi vzoriek a všetky vykazovali významné zmeny v účinku (doplnková tabuľka 6). Všetci identifikovaní metabolizátori PPA s významnými rozdielmi v početnosti boli početnejší vo vzorkách PPA. Klasifikácia na úrovni druhov odhalila zástupcov rodov, ktoré sa medzi typmi vzoriek významne nelíšili, vrátane niekoľkých druhov Bacteroides a Ruminococcus, ako aj Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus a Alcaligenes polymorpha. Medzi baktériami produkujúcimi PPA štyri baktérie vykazovali významné rozdiely v početnosti medzi typmi vzoriek. Medzi druhy s významnými rozdielmi v početnosti patrili Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis a Ruminococcus bovis.
V tejto štúdii sme skúmali účinky expozície PPA na črevnú mikrobiotu myší. PPA môže u baktérií vyvolať rôzne reakcie, pretože ju produkujú určité druhy, používajú ju ako zdroj potravy iné druhy alebo má antimikrobiálne účinky. Preto jej pridanie do črevného prostredia prostredníctvom doplnkov stravy môže mať rôzne účinky v závislosti od tolerancie, citlivosti a schopnosti využiť ju ako zdroj živín. Citlivé bakteriálne druhy môžu byť eliminované a nahradené tými, ktoré sú odolnejšie voči PPA alebo sú schopné ju využiť ako zdroj potravy, čo vedie k zmenám v zložení črevnej mikrobioty. Naše výsledky odhalili významné rozdiely v mikrobiálnom zložení, ale žiadny vplyv na celkovú mikrobiálnu diverzitu. Najväčšie účinky boli pozorované na úrovni druhov, pričom viac ako 70 taxónov sa medzi vzorkami PPA a kontrolnými vzorkami významne líšilo v početnosti (doplnková tabuľka 2). Ďalšie hodnotenie zloženia vzoriek vystavených PPA odhalilo väčšiu heterogenitu mikrobiálnych druhov v porovnaní s neexponovanými vzorkami, čo naznačuje, že PPA môže zlepšiť charakteristiky rastu baktérií a obmedziť bakteriálne populácie, ktoré môžu prežiť v prostredí bohatom na PPA. PPA teda môže selektívne indukovať zmeny, a nie spôsobovať rozsiahle narušenie diverzity črevnej mikrobioty.
Ukázalo sa, že konzervačné látky v potravinách, ako je PPA, menia množstvo zložiek črevného mikrobiómu bez ovplyvnenia celkovej diverzity (Nagpal a kol., 2021). V tejto štúdii sme pozorovali najvýraznejšie rozdiely medzi druhmi Bacteroidetes v rámci kmeňa Bacteroidetes (predtým známych ako Bacteroidetes), ktoré boli významne obohatené u myší vystavených PPA. Zvýšené množstvo druhov Bacteroides je spojené so zvýšenou degradáciou hlienu, čo môže zvýšiť riziko infekcie a podporovať zápal (Cornick a kol., 2015; Desai a kol., 2016; Penzol a kol., 2019). Jedna štúdia zistila, že novorodené samce myší liečené Bacteroides fragilis vykazovali sociálne správanie pripomínajúce poruchu autistického spektra (PAS) (Carmel a kol., 2023) a ďalšie štúdie ukázali, že druhy Bacteroides môžu zmeniť imunitnú aktivitu a viesť k autoimunitnej zápalovej kardiomyopatii (Gil-Cruz a kol., 2019). Druhy patriace do rodov Ruminococcus, Prevotella a Parabacteroides boli tiež významne zvýšené u myší vystavených PPA (Coretti a kol., 2018). Niektoré druhy Ruminococcus sú spojené s ochoreniami, ako je Crohnova choroba, prostredníctvom produkcie prozápalových cytokínov (Henke a kol., 2019), zatiaľ čo druhy Prevotella, ako napríklad Prevotella humani, sú spojené s metabolickými ochoreniami, ako je hypertenzia a citlivosť na inzulín (Pedersen a kol., 2016; Li a kol., 2017). Nakoniec sme zistili, že pomer Bacteroidetes (predtým známych ako Firmicutes) k Bacteroidetes bol u myší vystavených PPA významne nižší ako u kontrolných myší v dôsledku vyššej celkovej abundancie druhov Bacteroidetes. Tento pomer sa už predtým ukázal ako dôležitý ukazovateľ črevnej homeostázy a poruchy tohto pomeru sa spájajú s rôznymi chorobnými stavmi (Turpin a kol., 2016; Takezawa a kol., 2021; An a kol., 2023), vrátane zápalových ochorení čriev (Stojanov a kol., 2020). Zdá sa, že druhy kmeňa Bacteroidetes sú kolektívne najviac ovplyvnené zvýšenou hladinou PPA v strave. Môže to byť spôsobené vyššou toleranciou voči PPA alebo schopnosťou využívať PPA ako zdroj energie, čo sa preukázalo aspoň u jedného druhu, Hoylesella enocea (Hitch a kol., 2022). Alternatívne môže vystavenie matky PPA zlepšiť vývoj plodu tým, že urobí črevo myšacieho potomstva náchylnejším na kolonizáciu Bacteroidetes; dizajn našej štúdie však takéto posúdenie neumožnil.
Metagenomické hodnotenie obsahu odhalilo významné rozdiely v množstve génov spojených s metabolizmom a produkciou PPA, pričom myši vystavené PPA vykazovali vyššie množstvo génov zodpovedných za produkciu PPA, zatiaľ čo myši vystavené PPA vykazovali vyššie množstvo génov zodpovedných za metabolizmus PAA (obrázok 6). Tieto výsledky naznačujú, že vplyv PPA na mikrobiálne zloženie nemusí byť spôsobený výlučne jej použitím, inak by množstvo génov spojených s metabolizmom PPA malo vykazovať vyššie množstvo v črevnom mikrobióme myší vystavených PPA. Jedným z vysvetlení je, že PPA sprostredkováva bakteriálnu hojnosť primárne prostredníctvom svojich antimikrobiálnych účinkov, a nie prostredníctvom jej využitia baktériami ako živiny. Predchádzajúce štúdie ukázali, že PPA inhibuje rast Salmonella Typhimurium spôsobom závislým od dávky (Jacobson a kol., 2018). Expozícia vyšším koncentráciám PPA môže selektovať baktérie, ktoré sú rezistentné voči jej antimikrobiálnym vlastnostiam a nemusia byť nevyhnutne schopné ju metabolizovať alebo produkovať. Napríklad niekoľko druhov Parabacteroides vykazovalo významne vyššiu abundanciu vo vzorkách PPA, ale neboli zistené žiadne gény súvisiace s metabolizmom alebo produkciou PPA (doplnkové tabuľky 2, 4 a 5). Okrem toho je produkcia PPA ako vedľajší produkt fermentácie široko rozšírená medzi rôznymi baktériami (Gonzalez-Garcia a kol., 2017). Vyššia bakteriálna diverzita môže byť dôvodom vyššej abundancie génov súvisiacich s metabolizmom PPA v kontrolných vzorkách (Averina a kol., 2020). Okrem toho sa predpokladalo, že iba 27 (2,14 %) z 1332 génov sú gény spojené výlučne s metabolizmom PPA. Mnohé gény spojené s metabolizmom PPA sú zapojené aj do iných metabolických dráh. To ďalej dokazuje, že abundancia génov zapojených do metabolizmu PPA bola vyššia v kontrolných vzorkách; tieto gény môžu fungovať v dráhach, ktoré nevedú k využitiu alebo tvorbe PPA ako vedľajšieho produktu. V tomto prípade iba jeden gén spojený s tvorbou PPA vykazoval významné rozdiely v abundancii medzi typmi vzoriek. Na rozdiel od génov spojených s metabolizmom PPA boli markerové gény pre produkciu PPA vybrané, pretože sú priamo zapojené do bakteriálnej dráhy produkcie PPA. U myší vystavených PPA sa zistilo, že všetky druhy mali významne zvýšenú početnosť a schopnosť produkovať PPA. To podporuje predpoveď, že PPA by vyberali producentov PPA, a preto predpovedajú, že produkčná kapacita PPA by sa mala zvýšiť. Početnosť génov však nemusí nevyhnutne korelovať s expresiou génov; preto, hoci je početnosť génov spojených s metabolizmom PPA v kontrolných vzorkách vyššia, miera expresie sa môže líšiť (Shi a kol., 2014). Na potvrdenie vzťahu medzi prevalenciou génov produkujúcich PPA a produkciou PPA sú potrebné štúdie expresie génov zapojených do produkcie PPA.
Funkčná anotácia metagenómov PPA a kontrolných metagenómov odhalila určité rozdiely. PCA analýza obsahu génov odhalila diskrétne zhluky medzi vzorkami PPA a kontrolnými vzorkami (obrázok 5). Zhlukovanie v rámci vzorky ukázalo, že obsah kontrolných génov bol rozmanitejší, zatiaľ čo vzorky PPA sa zhlukovali. Zhlukovanie podľa obsahu génov bolo porovnateľné so zhlukovaním podľa druhového zloženia. Rozdiely v početnosti dráh sú teda v súlade so zmenami v početnosti špecifických druhov a kmeňov v nich. Vo vzorkách PPA boli dve dráhy s významne vyššou početnosťou spojené s metabolizmom aminocukrov/nukleotidov (ko:K21279) a viacerými dráhami metabolizmu lipidov (ko:K00647, ko:K03801; doplnková tabuľka 3). Je známe, že gény spojené s ko:K21279 sú spojené s rodom Bacteroides, jedným z rodov s významne vyšším počtom druhov vo vzorkách PPA. Tento enzým sa dokáže vyhnúť imunitnej odpovedi expresiou kapsulárnych polysacharidov (Wang a kol., 2008). To môže vysvetľovať nárast Bacteroidetes pozorovaný u myší vystavených PPA. Toto dopĺňa zvýšenú syntézu mastných kyselín pozorovanú v mikrobióme PPA. Baktérie využívajú dráhu FASIIko:K00647 (fabB) na produkciu mastných kyselín, ktoré môžu ovplyvniť metabolické dráhy hostiteľa (Yao a Rock, 2015; Johnson a kol., 2020) a zmeny v metabolizme lipidov môžu zohrávať úlohu v neurovývoji (Yu a kol., 2020). Ďalšou dráhou, ktorá vykazuje zvýšenú hojnosť vo vzorkách PPA, bola biosyntéza steroidných hormónov (ko:K12343). Existuje stále viac dôkazov o tom, že existuje inverzný vzťah medzi schopnosťou črevnej mikrobioty ovplyvňovať hladiny hormónov a byť nimi ovplyvnená, takže zvýšené hladiny steroidov môžu mať následné zdravotné následky (Tetel a kol., 2018).
Táto štúdia nie je bez obmedzení a úvah. Dôležitým rozdielom je, že sme nevykonali fyziologické hodnotenia zvierat. Preto nie je možné priamo dospieť k záveru, či zmeny v mikrobióme súvisia s nejakým ochorením. Ďalším úvahou je, že myši v tejto štúdii boli kŕmené rovnakou stravou ako ich matky. Budúce štúdie môžu určiť, či prechod z diéty bohatej na PPA na diétu bez PPA zlepšuje jej účinky na mikrobióm. Jedným z obmedzení našej štúdie, podobne ako mnohých iných, je obmedzená veľkosť vzorky. Hoci možno vyvodiť platné závery, väčšia veľkosť vzorky by poskytla väčšiu štatistickú silu pri analýze výsledkov. Sme tiež opatrní pri vyvodzovaní záverov o súvislosti medzi zmenami v črevnom mikrobióme a akýmkoľvek ochorením (Yap a kol., 2021). Mätúce faktory vrátane veku, pohlavia a stravy môžu významne ovplyvniť zloženie mikroorganizmov. Tieto faktory môžu vysvetliť nezrovnalosti pozorované v literatúre, pokiaľ ide o súvislosť črevného mikrobiómu s komplexnými ochoreniami (Johnson a kol., 2019; Lagod a Naser, 2023). Napríklad sa ukázalo, že členovia rodu Bacteroidetes majú u zvierat a ľudí s ASD buď zvýšený, alebo znížený počet (Angelis a kol., 2013; Kushak a kol., 2017). Podobne štúdie zloženia čriev u pacientov so zápalovými ochoreniami čriev zistili zvýšenie aj zníženie počtu rovnakých taxónov (Walters a kol., 2014; Forbes a kol., 2018; Upadhyay a kol., 2023). Aby sme obmedzili vplyv rodovej skreslenia, snažili sme sa zabezpečiť rovnaké zastúpenie pohlaví, aby rozdiely boli s najväčšou pravdepodobnosťou spôsobené stravou. Jednou z výziev funkčnej anotácie je odstránenie redundantných génových sekvencií. Naša metóda zhlukovania génov vyžaduje 95 % sekvenčnú identitu a 85 % podobnosť dĺžky, ako aj 90 % pokrytie zarovnaním, aby sa eliminovalo falošné zhlukovanie. V niektorých prípadoch sme však pozorovali COG s rovnakými anotáciami (napr. MUT) (Obr. 6). Na určenie, či sú tieto ortológy odlišné, spojené so špecifickými rodmi, alebo či ide o obmedzenie prístupu zhlukovania génov, sú potrebné ďalšie štúdie. Ďalším obmedzením funkčnej anotácie je potenciálna nesprávna klasifikácia; bakteriálny gén mmdA je známy enzým zapojený do syntézy propionátu, ale KEGG ho nespája s metabolickou dráhou propionátu. Naproti tomu ortológy scpB a mmcD sú príbuzné. Veľký počet génov bez určených knockoutov môže viesť k neschopnosti identifikovať gény súvisiace s PPA pri hodnotení génovej abundancie. Budúce štúdie budú profitovať z analýzy metatranskriptómov, ktorá môže poskytnúť hlbšie pochopenie funkčných charakteristík črevnej mikrobioty a prepojiť génovú expresiu s potenciálnymi následnými účinkami. Pre štúdie zahŕňajúce špecifické neurovývojové poruchy alebo zápalové ochorenia čriev sú potrebné fyziologické a behaviorálne hodnotenia zvierat, aby sa prepojili zmeny v zložení mikrobiómu s týmito poruchami. Ďalšie štúdie transplantujúce črevný mikrobióm do myší bez baktérií by boli tiež užitočné na určenie, či je mikrobióm hnacou silou alebo charakteristikou ochorenia.
V súhrne sme preukázali, že PPA v strave pôsobí ako faktor pri zmene zloženia črevnej mikrobioty. PPA je konzervačná látka schválená FDA, ktorá sa bežne vyskytuje v rôznych potravinách a pri dlhodobej expozícii môže viesť k narušeniu normálnej črevnej flóry. Zistili sme zmeny v množstve niekoľkých baktérií, čo naznačuje, že PPA môže ovplyvniť zloženie črevnej mikrobioty. Zmeny v mikrobiote môžu viesť k zmenám v hladinách určitých metabolických dráh, čo môže viesť k fyziologickým zmenám, ktoré sú relevantné pre zdravie hostiteľa. Na určenie, či účinky PPA v strave na mikrobiálne zloženie môžu viesť k dysbióze alebo iným ochoreniam, sú potrebné ďalšie štúdie. Táto štúdia kladie základy pre budúce štúdie o tom, ako môžu účinky PPA na zloženie čriev ovplyvniť ľudské zdravie.
Súbory údajov prezentované v tejto štúdii sú dostupné v online repozitároch. Názov repozitára a jeho prístupové číslo sú: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Túto štúdiu na zvieratách schválil Výbor pre inštitucionálnu starostlivosť o zvieratá a ich používanie na University of Central Florida (UCF-IACUC) (číslo povolenia na používanie zvierat: PROTO202000002). Táto štúdia je v súlade s miestnymi zákonmi, predpismi a inštitucionálnymi požiadavkami.
NG: Konceptualizácia, kurátorstvo dát, formálna analýza, skúmanie, metodika, softvér, vizualizácia, písanie (pôvodný návrh), písanie (kontrola a úprava). LA: Konceptualizácia, kurátorstvo dát, metodika, zdroje, písanie (kontrola a úprava). SH: Formálna analýza, softvér, písanie (kontrola a úprava). SA: Vyšetrovanie, písanie (kontrola a úprava). Hlavný rozhodca: Vyšetrovanie, písanie (kontrola a úprava). SN: Konceptualizácia, administrácia projektu, zdroje, dohľad, písanie (kontrola a úprava). TA: Konceptualizácia, administrácia projektu, dohľad, písanie (kontrola a úprava).
Autori vyhlasujú, že na výskum, autorstvo a/alebo publikovanie tohto článku nedostali žiadnu finančnú podporu.
Autori vyhlasujú, že výskum bol vykonaný bez akýchkoľvek obchodných alebo finančných vzťahov, ktoré by sa mohli interpretovať ako potenciálny konflikt záujmov. neuplatňuje sa.
Všetky názory vyjadrené v tomto článku sú výlučne názormi autorov a nemusia nevyhnutne odrážať názory ich inštitúcií, vydavateľov, redaktorov alebo recenzentov. Žiadne produkty hodnotené v tomto článku ani žiadne tvrdenia ich výrobcov nie sú vydavateľom zaručené ani schválené.
Doplnkový materiál k tomuto článku nájdete online: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Kyselina propiónová indukuje gliózu a neurozápal reguláciou dráhy PTEN/AKT pri poruchách autistického spektra. Vedecké správy 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Štatistická analýza údajov o zložení. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Pomer Firmicutes/Bacteroidetes ako rizikový faktor rakoviny prsníka. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analýza diferenciálnej expresie údajov o počte sekvencií. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI a kol. (2013). Fekálna mikrobiota a metabolóm u detí s autizmom a pervazívnou vývinovou poruchou inak nešpecifikovanou. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakteriálne neurometabolické charakteristiky črevnej mikrobioty u malých detí s poruchami autistického spektra. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobióm ako ľudský orgán. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Nové poznatky o fyziológii baktérií produkujúcich kyselinu propiónovú: Anaerotignum propionicum a Anaerotignum neopropionicum (predtým Clostridium propionicum a Clostridium neopropionicum). Mikroorganizmy 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Výživa matky a vývoj plodu. J Nutr. 134, 2169-2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. a Hochberg, J. (1995). Kontrola miery falošne pozitívnych výsledkov: Praktický a efektívny prístup k viacnásobnému testovaniu. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Čas uverejnenia: 18. apríla 2025