Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu pre CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku zobrazovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Na rozdiel od stavovcov sa všeobecne predpokladá, že hmyz nemá samčie pohlavné steroidné hormóny. U druhu Anopheles gambiae sa zdá, že ekdyzónový steroid 20-hydroxyekdyzón (20E) sa vyvinul tak, aby kontroloval vývoj vajíčok, keď ho syntetizujú samice2, a aby indukoval refraktérne obdobie párenia, keď ho samce prenášajú3. Keďže vývoj vajíčok a párenie sú základnými reprodukčnými vlastnosťami, pochopenie toho, ako samice komárov Anopheles integrujú tieto hormonálne signály, by mohlo uľahčiť návrh nových programov na kontrolu malárie. V tejto štúdii odhaľujeme, že tieto reprodukčné funkcie sú regulované odlišnými pohlavnými steroidmi prostredníctvom komplexnej siete enzýmov aktivujúcich/inaktivujúcich ekdysteroidy. Identifikovali sme samčie špecifický oxidovaný ekdyzón, 3-dehydro-20E (3D20E), ktorý chráni rodičovstvo tým, že po pohlavnom prenose a aktivácii defosforyláciou vypína samičiu sexuálnu receptivitu. Je pozoruhodné, že prenos 3D20E tiež indukoval expresiu reprodukčných génov, ktoré udržiavajú vývoj vajíčok počas infekcie Plasmodium, čím zabezpečuje zdravie infikovaných samíc. 20E odvodený od samíc nevyvoláva sexuálnu odpoveď. ale umožňuje páriacim sa jedincom klásť vajíčka po inhibícii kináz inhibujúcich 20E. Identifikácia tohto samčieho špecifického hmyzieho steroidného hormónu a jeho úloha v regulácii samičej sexuálnej receptivity, plodnosti a interakcie s Plasmodium naznačuje potenciál znížiť reprodukčný úspech komárov prenášajúcich maláriu.
Prípady malárie a úmrtia na ňu opäť stúpajú4 v dôsledku rozsiahlej rezistencie na insekticídy u komárov rodu Anopheles, jediného prenášača ľudských parazitov malárie. Páriaca biológia týchto komárov je obzvlášť atraktívnym cieľom pre nové intervencie v oblasti kontroly malárie, pretože samice sa pária iba raz5; sterilné dosiahnutie tohto jediného párenia by malo veľký potenciál na zníženie populácií komárov v teréne.
Ženy sa stávajú sexuálne nespôsobilými po prijatí vysokých titrov steroidných hormónov od mužov. Štúdie ukázali, že spúšťačom ťažkostí s ďalším párením je 20-hydroxyekdyzón (20E), steroidný hormón, ktorý je známejší ako regulátor cyklu pĺznutia v larválnom štádiu. Schopnosť samcov syntetizovať a prenášať 20E sa vyvinula špecificky u druhov Anopheles, ktoré patria do podrodu Cellia7, ktorý je rozšírený v Afrike a zahŕňa najnebezpečnejšie prenášače malárie vrátane Anopheles gambiae. Toto je obzvlášť pozoruhodné, pretože u týchto druhov samice tiež produkujú 20E po každom príjme krvi a 20E riadi cyklus oogenézy (pozri odkaz 8). Je však málo známe o spôsobe, akým samice integrujú signály z dvoch rôznych zdrojov ekdyzónu (prenos samcom a indukcia kŕmenia krvou) bez toho, aby ohrozili svoju vlastnú schopnosť páriť sa. V skutočnosti, ak 20E produkovaný samicami spustí sexuálnu intoleranciu, povedie to k neplodnosti u jedincov kŕmiacich sa pannou, čo je u týchto komárov veľmi bežné správanie5.
Možným vysvetlením je, že samce A. gambiae prenášajú modifikovaný samcovo-špecifický ekdyzón, ktorý aktivuje signálnu kaskádu v samičích reprodukčných cestách, čo vedie k nestabilite párenia. Hoci stavovce majú viacero steroidných hormónov, ako je estrogén a androgén (prehľad v odkaze 9), podľa našich vedomostí neboli u hmyzu identifikované androgénne ovplyvnené steroidy.
Naším cieľom bolo určiť repertoár steroidných hormónov v prídavnej žľaze samca (MAG) pohlavne zrelého A. gambiae s cieľom hľadať možné modifikujúce steroidy. Pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie spojenej s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (HPLC-MS/MS) namiesto menej špecifickej metódy používanej predtým sme v tomto tkanive detegovali ekdyzón (E) a 20E, čím sme potvrdili predchádzajúci výsledok. Vzorke však dominovali oxidované fosforylované steroidy, zodpovedajúce vzorcu 3-dehydro-20E-22-fosfát (3D20E22P)12 (obrázok 1). Medzi ďalšie formy patrí 3-dehydro-20E (3D20E) a 20E-22-fosfát (20E22P). Intenzita signálu HPLC-MS/MS 3D20E22P bola o dva rády vyššia ako jeho defosforylovaná forma 3D20E a o tri rády vyššia ako intenzita signálu E a 20E (obrázok 1). Hoci v iných častiach tela a dolných reprodukčných cestách... (LRT; Rozšírené údaje, obr. 1a). Analyzovali sme aj ekdysteroidy u novo uzavretých (<1 deň starých) samcov a samíc a detegovali sme 3D20E a 3D20E22P iba ​​v MAG; E, 20E a 20E22P boli prítomné u oboch pohlaví (Rozšírené údaje, obr. 1b). Tieto údaje naznačujú, že dospelí samci A. gambiae produkujú vysoké titre modifikujúcich hormónov vo svojich MAG, ktoré samice nesyntetizujú.
MAG a samičie LRT (vrátane predsiení, semenných vačkov a parovária) boli odobraté zo 4-dňových (4-dňových) panenských samcov a panenských a spárených samíc (0,5, 3 a 12 hpm). Ekdyzón v týchto tkanivách bol analyzovaný pomocou HPLC-MS/MS (priemer ± sem; nepárový t-test, obojstranný, korigovaný na mieru falošných objavov (FDR); NS, nevýznamné; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 hodiny oproti 0,5 hodiny, P = 0,035; 12 hodín oproti 3 hodinám, P = 0,0015; 12 hodín oproti 0,5 hodiny, P = 0,030. 3D20E22P: 3 hodiny oproti 0,5 hodiny, P = 0,25; 12 hodín oproti 3 hodinám, P = 0,0032; 12 hodín oproti 0,5 hodine, P = 0,015). Údaje pochádzajú z troch biologických replikátov. Plocha píku pre každý sledovaný ekdyzón bola vypočítaná a normalizovaná podľa počtu komárov. Ekdyzón je farebne znázornený nasledovne: E, zelená; 20E, oranžová; 20E22P, fialová; 3D20E, modrá; 3D20E22P, ružová. Vložka zväčšuje mierku na osi y, aby znázornila nižšie hladiny ekdyzónu.
Aby sme zistili, či sa 3D20E22P a 3D20E prenášajú počas párenia, rozobrali sme samičie LRT v rôznych časových bodoch po párení. Hoci sa ekdyzón u panenských samíc nenašiel, pozorovali sme značné množstvo 3D20E22P v LRT bezprostredne po párení (0,5 hodiny po párení, hpm), ktoré sa časom znižovalo, zatiaľ čo hladiny 3D20E sa významne zvýšili (obr. 1). Použitím chemicky syntetizovaného 3D20E ako štandardu sme zistili, že hladiny tohto steroidného hormónu v páriacich sa LRT boli najmenej 100-krát vyššie ako 20E (Tabuľka rozšírených údajov 1). 3D20E22P je teda hlavný samčí ekdyzón, ktorý sa prenáša do samičích LRT počas párenia a jeho defosforylovaná forma, 3D20E, sa stáva vysoko hojnou krátko po párení. To naznačuje dôležitú úlohu tohto ekdyzónu v biológii samičiek po párení.
Po vygenerovaní nového súboru údajov RNA sekvenovania (RNA-seq) (obr. 2a) sme pomocou vlastného bioinformatického pipeline hľadali ekdyzónkinázu (EcK), ekdyzónoxidázu (EO) a ekdyzón kódujúci gén 20E-modifikovanej fosfatázy. EPP) sa exprimuje v reprodukčných tkanivách. Identifikovali sme jeden kandidátsky gén EPP a dva potenciálne gény EcK (EcK1 a EcK2), ale nepodarilo sa nám nájsť vhodný kandidátsky gén EO. Je pozoruhodné, že jednotlivé gény EPP boli exprimované vo vysokých hladinách (98,9. percentil) v gambijských MAG, ale nie v samičích LRT (obr. 2b), čo je v rozpore s našimi očakávaniami, pretože v tomto samičím tkanive došlo k defosforylácii 3D20E22P. Preto sa domnievame, že samčí EPP sa môže preniesť počas párenia. V skutočnosti sme použili in vivo značenie stabilnými izotopmi na maskovanie samičieho proteínu po párení, enzýmu identifikovaného MS v samičej predsieni (obr. 2c a doplnková tabuľka 1). Prítomnosť EPP u MAG a spárených (ale nie panenských) samičích LRT bol tiež potvrdený pomocou špecifických protilátok (obr. 2d).
a, Na mieru vytvorený bioinformatický kanál na vyhľadávanie génov kódujúcich EcK, EO a EPP v reprodukčných tkanivách každého pohlavia. Čísla vedľa šípok označujú počet kandidátov samcov a samíc v každom kroku. Táto analýza identifikovala jeden gén EPP (EPP) a jeden gén EcK (EcK1), ktoré sú exprimované u samcov, a jeden gén EcK (EcK2), ktorý je exprimovaný u oboch pohlaví, ale nevedie k identifikácii kandidátskeho génu EO.b, Teplotná mapa porovnávajúca expresiu kandidátskych génov v panenskom (V) a páriacom sa (M) tkanive Anopheles gambiae a Anopheles albicans. Spca, oplodnenie; MAG, prídavné žľazy u samcov; iné časti tela vrátane pŕs, krídel, nôh, tukových tiel a vnútorných orgánov u oboch pohlaví a vaječníkov u samíc. EcK2 je vysoko exprimovaný v MAG aj v predsieňach Gambie, zatiaľ čo EPP sa nachádza iba v MAG.c, Proteomická analýza translokácie skupiny mužského ejakulátu do samičích predsiení v čase 3, 12 a 24 hpm, ktorá ukazuje 67 najhojnejších proteínov. Samice boli chované na diéte obsahujúcej 15N na označenie (a maskovanie) všetkých proteínov. Neznačené samce boli spárené s označenými samicami a samičie LRT boli pitvané v čase 3, 12 a 24 hpm na proteomickú analýzu (úplný zoznam ejakulačných proteínov nájdete v doplnkovej tabuľke 1). Vložka, EPP, Eck1 a EcK2 boli detegované v MAG panenských samcov proteomickou analýzou týchto tkanív.d, EPP bol detegovaný Western blotom v MAG a LRT spárených samíc, ale nie u panenských samíc alebo samcov alebo zvyšku tela samice. Membrány boli súčasne sondované s anti-aktínovými (kontrola nanášania) a anti-EPP protilátkami. Všetci samci sú panini. Zdrojové údaje o géli nájdete v doplnkovom obrázku 1. Western bloty sa vykonali dvakrát s podobnými výsledkami.
Aktivita ekdysteroidnej fosfofosfatázy EPP bola overená po inkubácii pomocou HPLC-MS/MS s 3D20E22P izolovaným z MAG (rozšírené údaje, obr. 2a). Okrem toho, keď sme umlčali EPP pomocou RNA-sprostredkovanej interferencie (RNAi), zistili sme silné zníženie aktivity fosfatázy v reprodukčných tkanivách týchto samcov (obr. 3a) a samice párené so samcami s umlčaným EPP vykazovali významne nižší podiel defosforylovaného 3D20E (obr. 3b) napriek čiastočnému umlčaniu génov (rozšírené údaje, obr. 2b,c). Naproti tomu sme u tých istých komárov nezistili významné zmeny v pomere 20E22P/20E, čo by mohlo naznačovať, že enzým je špecifický pre 3D20E22P (obr. 3b).
a, Znížená aktivita fosfatázy v MAG spôsobená umlčaním EPP pomocou kontrol s dvojvláknovou EPP RNA (dsEPP) alebo dvojvláknovou GFP RNA (dsGFP). V každom replikáte bolo použitých dvadsať MAG poolov (P = 0,0046, párový t-test, obojstranný), znázornených samostatnými bodkami.b, Samice spárené so samcami s umlčaným EPP mali významne nižší podiel defosforylovanej 3D20E pri 3 hpm (P = 0,0043, nepárový t-test, obojstranný), zatiaľ čo hladiny 20E neboli ovplyvnené (P = 0,063, nepárové). t-test, obojstranný). Údaje sú prezentované ako priemer ± sem z troch súborov po 13, 16 a 19 samiciach.c, Samice párené so samcami s umlčaným EPP mali významne vyššiu mieru opätovného párenia (P = 0,0002, Fisherov exaktný test, obojstranný). Samice boli najprv nútené páriť sa, aby sa zabezpečil ich páriaci status; O 2 dni neskôr boli kontaktované s inými samcami s transgénnymi spermiami, aby sa pomocou kvantitatívnej PCR detekcie transgénu stanovila miera opätovného párenia.d Samice kŕmené krvou a párené so samcami s umlčaným EPP mali významne zníženú plodnosť (P < 0,0001; Mann-Whitneyov test, obojstranný) a mierne znížený počet vajíčok (P = 0,088, Mann-Whitneyov test, obojstranný), zatiaľ čo miera trenia nebola ovplyvnená (P = 0,94, Fisherov exaktný test, obojstranný). Vo všetkých paneloch n predstavuje počet biologicky nezávislých vzoriek komárov.NS, nevýznamné.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Ďalej sme zhodnotili, či je defosforylácia ekdyzónu dôležitá pre vyvolanie rezistencie voči páreniu u samíc. Je pozoruhodné, že samice párené so samcami s depléciou EPP sa opätovne párili s oveľa vyššou frekvenciou (44,9 %) ako kontrolné samice (10,4 %), keď boli vystavené ďalším (transgénnym) samcom (obr. 3c). Taktiež sme pozorovali významný pokles plodnosti (obr. 3d, vľavo) a mierny pokles počtu vajíčok nakladených týmito samicami (obr. 3d, v strede), zatiaľ čo percento vajíčok nakladených samicami (ďalšia reakcia vyvolaná u samíc párením) nebolo ovplyvnené (obr. 3d, vpravo). Vzhľadom na pozorovanú špecifickosť EPP pre 3D20E22P tieto výsledky naznačujú, že aktivácia 3D20E prostredníctvom EPP preneseného počas párenia môže zohrávať dôležitú úlohu pri vypínaní receptivity samíc na ďalšie párenie, čo je správanie, ktoré sa predtým pripisovalo sexuálnemu prenosu 20E. Preto tento samec-špecifický hormón tiež silne ovplyvňuje plodnosť samíc.
Ďalej sme porovnali aktivity 20E a 3D20E v injekčných experimentoch u pohlavne zrelých panien s použitím chemicky syntetizovaného 3D20E (obr. 4a–c) a komerčne dostupného 20E. Zistili sme, že 3D20E bol pri oboch koncentráciách výrazne účinnejší ako 20E pri potlačení citlivosti samíc na párenie (obr. 4d). Je pozoruhodné, že polovičná fyziologická hladina 3D20E v LRT (1 066 pg po injekcii oproti 2 022 pg po párení) indukovala podiel refraktérnych samíc, ktorý bol 20-krát vyšší ako fyziologická hladina 20E (361 pg po injekcii) 24 hodín po injekcii pri najvyššej koncentrácii 18 pg po párení; Rozšírené údaje (Tabuľka 1). Tento výsledok je v súlade s predstavou, že sexuálny prenos 20E nespôsobuje refraktérne obdobia párenia, a ďalej poukazuje na 3D20E ako hlavný faktor pri zabezpečovaní vzťahu medzi rodičom a dieťaťom. 3D20E bol tiež výrazne aktívnejší ako 20E v testoch kladenia vajec u panenských samíc (Obr. 4e), čo naznačuje, že normálna miera kladenia vajec, ktorú sme pozorovali po čiastočnom umlčaní EPP, bola spôsobená prítomnosťou zvyškovej aktivity 3D20E, ktorá je stále produkovaná faktormi indukovanými párením u samičiek.
(a,b) 3D20E chemicky syntetizovaný z 20E (a) s veľmi vysokou konverziou/účinnosťou (údaje prezentované ako priemer ± sem z troch nezávislých syntetických reakcií) (b).c, Hmotnostné spektrum (dolná polovica) presne zodpovedá ekdyzónu nájdenému v spárených samičkách LRT (horná polovica).d, V porovnaní s 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherov presný test, obojstranný) a 10 % etanolom (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisherov presný test, obojstranný), zatiaľ čo 20E bol významne vyšší ako kontrola iba pri vyšších dávkach (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisherov presný test, obojstranný).e, Injekcia 3D20E indukovala významne vyššie miery trenia u panenských samíc ako u kontrol s 10 % etanolom (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisherov presný test, obojstranný), zatiaľ čo 20E v porovnaní s kontrolami iba pri vyšších dávkach (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisherov presný test, obojstranný). 3D20E indukoval významne vyššie miery trenia ako 20E pri vyšších dávkach (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisherov presný test, obojstranný). Vo všetkých paneloch n predstavuje počet biologicky nezávislých vzoriek komárov. NS, nie je štatisticky významné. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Údaje pochádzajú z troch... replikuje.
V predchádzajúcich štúdiách sme zistili, že sexuálny prenos steroidných hormónov indukuje expresiu MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), ženského reprodukčného génu, ktorý chráni samice A. gambiae pred infekciou P. falciparum. Zdravotné náklady spôsobené 13, najsmrteľnejším ľudským parazitom malárie. Vzhľadom na dôležitosť MISO pre reprodukčnú spôsobilosť Anopheles v oblastiach endemických s maláriou sme sa rozhodli určiť, ktorý hormón, 3D20E alebo 20E, spúšťa expresiu tohto génu. Zistili sme, že zatiaľ čo injekcia 20E špecificky alebo účinnejšie indukovala niektoré jadrové hormónové receptory (HR), ako sú HR3 a HR4, a typické downstream steroidné ciele, ako sú yolkogénne gény Vg14, 15, 16, MISO bol silnejšie indukovaný 3D20E (rozšírené údaje, obr. 3). Zdá sa teda, že sexuálny prenos tohto androgénneho steroidného hormónu indukuje mechanizmy, ktoré chránia samice pred nákladmi spôsobenými parazitárnou infekciou. Okrem toho 3D20E diferencovane ovplyvňuje obe izoformy E receptor EcR, indukujúci EcR-A a potláčajúci EcR-B, a silnejšie spúšťajúci ďalšie gény indukujúce párenie, vrátane HPX15, ktorý ovplyvňuje samičiu fertilitu. To by mohlo vysvetľovať významnú neplodnosť pozorovanú u samíc párených so samcami s umlčaným EPP (Rozšírené údaje, obr. 3). Tieto údaje naznačujú existenciu downstream dráh prednostne aktivovaných dvoma ekdyzónovými hormónmi, ktoré môžu byť základom pohlavne špecifickej funkcie.
Ďalej sme testovali funkciu dvoch génov EcK identifikovaných v našom bioinformatickom pipeline. Umlčanie EcK1 alebo EcK2 viedlo k významnej úmrtnosti u samcov (rozšírené údaje, obr. 4a), čo naznačuje, že fosforylácia ekdyzónu, a teda jeho inaktivácia, je dôležitá pre prežitie. Keďže EcK2 bol exprimovaný na vyšších úrovniach ako EcK1 a bol detegovaný v MAG pomocou proteomiky (obr. 2b, c a doplnková tabuľka 2), overili sme jeho aktivitu ekdysteroidnej kinázy inkubáciou s 20E, čo viedlo k fosforylácii 20E22P (rozšírené údaje, obrázok 2).4b). Pri použití 3D20E ako substrátu sme neboli schopní detegovať fosforylovaný produkt 3D20E22P (rozšírené údaje, obr. 4c), čo naznačuje, že preferovaným cieľom EcK2 môže byť 20E namiesto 3D20E.
Podľa našej analýzy RNA-seq bol EcK2 tiež vysoko exprimovaný v LRT panenských samíc, kde bol po párení vypnutý (Obr. 2b). Tieto údaje sme potvrdili a zistili sme, že expresia EcK2 nebola ovplyvnená kŕmením krvou (Rozšírené údaje, Obr. 5a). Rozšírením našich počiatočných MS experimentov sme zistili, že vrchol 20E22P úzko súvisel s vrcholom 20E (22 – 26 hodín po konzumácii krvi; Rozšírené údaje, Obr. 5b). Utlmenie EcK2 u panenských samíc viedlo k 3-násobnému zvýšeniu relatívneho pomeru 20E k 20E22P 26 hodín po konzumácii krvi (Rozšírené údaje, Obrázky 2c a 5c), čo potvrdzuje, že EcK2 tiež fosforyluje 20E u samíc. Je pozoruhodné, že panenské samice s depléciou EcK2 si zachovali plnú sexuálnu receptivitu (Rozšírené údaje, Obr. 5d,e), čo ďalej naznačuje, že produkcia 20E u samíc neindukuje refraktérne obdobia párenia. Tieto samice však mali významne... zvýšené miery kladenia vajec v porovnaní s kontrolami, pričom viac ako 30 % paneniev kládlo vajíčka (rozšírené údaje, obr. 5f). Ak boli injekcie dvojvláknovej Eck2 RNA (dsEcK2) vykonané po kŕmení krvou, k treniu nedošlo a v tomto bode vrchol 20E spôsobený požitím krvi poklesol. Celkovo tieto výsledky podporujú model, že 20E produkovaná po saní krvi môže vyvolať trenie, ale iba vtedy, keď je blok trenia (EcK2 a prípadne ďalšie faktory) vypnutý párením. Ani injekcie 20E, ani 3D20E neinhibovali expresiu EcK2 u paneniev (rozšírené údaje, obr. 5g), čo naznačuje, že inhibíciu tejto kinázy sprostredkovávajú iné faktory. Hladiny 20E po kŕmení krvou však neboli dostatočné na vyvolanie párovacích ťažkostí, ale boli účinne spúšťané vysokými titrami sexuálne prenesenej 3D20E.
Naše výsledky poskytujú dôležité poznatky o mechanizmoch regulujúcich reprodukčný úspech A. gambiae. Objavil sa model, v ktorom sa samce vyvinuli tak, aby syntetizovali vysoké titre 3D20E, samcovo špecifického modifikovaného ekdyzónu, ktorý zaisťuje rodičovstvo desenzibilizáciou samíc na ďalšie párenie. Zároveň si tieto vektory malárie vyvinuli aj účinný systém na aktiváciu 3D20E u samíc v reakcii na sexuálny prenos samcovo špecifického EPP. Podľa našich vedomostí je to prvý príklad steroidného hormónového systému dominovaného samcami a samicami, ktorý vykonáva jedinečnú a kritickú funkciu u hmyzu. Samcovo špecifická funkcia ekdyzónu bola postulovaná, ale nebola definitívne preukázaná. Napríklad do značnej miery vyvrátená hypotéza 18 je, že tieto funkcie môže vykonávať prekurzor 20E E1. Je dobre známe, že u Drosophily je monandria spúšťaná sexuálnym prenosom malých pohlavných peptidov 19,20, ktoré interagujú s neurónmi inervujúcimi samičí reprodukčný trakt prostredníctvom špecifických receptorov pohlavných peptidov 21,22. Na určenie následných signálnych kaskád je potrebná ďalšia práca. kontrolované 3D20E u samíc A. gambiae a určiť, či tieto kaskády môžu byť konzervované medzi komármi a Drosophilou.
Vzhľadom na dôležitú úlohu 3D20E na plodnosť a správanie samíc identifikovanú v našej štúdii, dráhy vedúce k syntéze a aktivácii 3D20E ponúkajú nové príležitosti pre budúce stratégie kontroly komárov, ako je napríklad generovanie konkurencieschopných sterilných samcov v stratégiách sterilnej technológie hmyzu, ktoré sa používajú na vypustenie do voľnej prírody alebo na napodobňovanie 3D20E v panenskej hre. Funkcia 3D20E špecifická pre samcov sa mohla vyvinúť, keď A. gambiae a iné druhy Cellia získali schopnosť koagulovať svoje spermie do páriacich zátok, pretože to umožňuje efektívny prenos veľkého množstva hormónov a enzýmov aktivujúcich hormóny. Evolúcia 3D20E implementujúca monandriu zase poskytuje mechanizmus pre samice (prostredníctvom vysokej expresie MISO) na podporu ich reprodukčnej zdatnosti v oblastiach s vysokým výskytom malárie, čo nepriamo prispieva k prenosu Plasmodium. Vzhľadom na to, že sa preukázalo, že samičí 20E má výrazný vplyv na prežitie a rast P. falciparum u samíc komárov Anopheles,24 dráhy steroidných hormónov samcov aj samíc sú teraz kľúčovými aspektmi interakcií medzi komármi a parazitmi.
Kmene A. gambiae G3 boli chované za štandardných hmyzích podmienok (26 – 28 °C, relatívna vlhkosť 65 – 80 %, fotoperióda 12:12 h svetlo/tma). Larvy boli kŕmené práškovým krmivom pre ryby (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets a Tetra Pond Sticks v pomere 7:7:2). Dospelé komáre boli kŕmené ad libitum 10 % roztokom dextrózy a týždenne ľudskou krvou (študované krvné zložky). Panenské komáre boli získané oddelením pohlaví v štádiu kukly po vyšetrení koncov mikroskopiou. Samce nesúce transgén DsRed boli opísané už skôr.
Experimenty s núteným párením sa uskutočnili podľa predtým opísaných protokolov. Pri prirodzenom párení sa 4-dňové panenské samice držali v pomere 1:3 so pohlavne dospelými panenskými samcami počas dvoch nocí. V experimentoch, v ktorých sa samcom injekčne podal dsEPP, sa spoločné umiestnenie v klietke zhodovalo s 3. až 4. dňom po injekcii, keď bola aktivita fosfatázy maximálne utlmená (Rozšírené údaje, obr. 2b).
Tkanivá komárov, zvyšné kadávery (zvyšok tela) alebo celé telo boli preparované do 100 % metanolu a homogenizované pomocou guľôčkového odstredivého prístroja (2 mm sklenené guľôčky, 2 400 ot./min., 90 sekúnd). Množstvo tkaniva a objemy metanolu boli nasledovné: zvyšok tela, 50 v 1 000 µl; MAG, 50 – 100 80 µl; samičie LRT, 25 – 50 80 µl. Zrazenina bola podrobená druhej metanolovej extrakcii s rovnakým objemom metanolu. Bunkový odpad bol odstránený centrifugáciou. Metanol z oboch extrakcií bol spojený a vysušený pod prúdom dusíka, potom resuspendovaný v nasledujúcich objemoch 80 % metanolu vo vode: zvyšok tela, 50 µl; MAG a samičie LRT, 30 µl.
Vzorky boli analyzované na hmotnostnom spektrometri (ID-X, Thermo Fisher) spojenom s LC prístrojom (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl vzorky bolo vstreknutých na 3 µm kolónu s rozmermi 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) udržiavanú pri teplote 25 °C. Mobilné fázy pre LC boli A (voda, 0,1 % kyselina mravčia) a B (acetonitril, 0,1 % kyselina mravčia). LC gradient bol nasledovný: 5 % B počas 1 minúty, potom zvýšený na 100 % B počas 11 minút. Po 8 minútach pri 100 % sa kolóna znovu vyvážila pri 5 % B počas 4 minút. Prietok bol 0,3 ml min-1. Ionizácia v MS zdroji sa dosahuje zahrievanou elektrosprejovou ionizáciou v pozitívnom a negatívnom režime.
Hmotnostný spektrometer meria údaje v rozsahu m/z od 350 do 680 s rozlíšením 60 000 v plnom MS režime. Údaje MS/MS boli získané pre [M + H]+ (všetky ciele), [M - H2O + H]+ (všetky ciele) a [M - H]- (fosforylované ciele). Údaje MS/MS boli použité na potvrdenie ekdyzónových vlastností cieľov, pre ktoré nebol k dispozícii žiadny štandard. Na identifikáciu necieľových ekdysteroidov boli analyzované údaje MS/MS pre všetky píky HPLC s relatívnym výskytom > 15 %. Kvantifikácia sa vykonala pomocou štandardných kriviek vytvorených z čistých štandardov (20E, 3D20E) na výpočet absolútnych množstiev alebo riedení jednej špecifickej vzorky (všetky ostatné ciele) na výpočet ich ekvivalencie s množstvami zistenými u jedného samca. Pre 3D20E bola kvantifikácia vykonaná pomocou súčtu nasledujúcich aduktov: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Dáta boli extrahované a kvantifikované pomocou programu Tracefinder (verzia 4.1). Dáta MS/MS boli analyzované pomocou programu Xcalibur (verzia 4.4). MS spektrá E, 20E a 3D20E boli porovnané s príslušnými štandardmi. 3D20E22P bol analyzovaný derivatizáciou s Girardovým činidlom. 20E22P bol analyzovaný pomerom m/z.
3D20E22P bol purifikovaný z MAG. Purifikácia sa uskutočnila v analytickom meradle s použitím ultravýkonného kvapalinového chromatografu (Acquity, Waters) s kvadrupólovým hmotnostným detektorom (QDa, Acquity, Waters) za rovnakých podmienok LC ako pri analýze HPLC-MS/MS. Zber frakcií sa spustil, keď sa m/z zodpovedajúce 3D20E22P detegovalo v rovnakom retenčnom čase, ako bolo predtým stanovené. Čistota extrahovaných zlúčenín sa potom skontrolovala pomocou HPLC-MS/MS, ako je opísané vyššie.
Celková RNA bola extrahovaná z 10 – 12 reprodukčných tkanív alebo iných častí tela (bez hláv) pomocou činidla TRI (Thermo Fisher) podľa pokynov výrobcu. RNA bola ošetrená TURBO DNázou (Thermo Fisher). cDNA bola syntetizovaná pomocou reverznej transkriptázy vírusu myšej leukémie Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) podľa pokynov výrobcu. Priméry pre kvantitatívnu PCR s reverznou transkripciou (RT-qPCR; Extended Data Table 2) boli predtým publikované24 alebo navrhnuté pomocou Primer-BLAST26, pričom sa uprednostňovali produkty s veľkosťou 70 – 150 bp a preklenujúce exón-exónové spojenia alebo párové priméry oddeľujúce exóny. Vzorky cDNA z troch až štyroch biologických replikátov boli štvornásobne zriedené vodou pre RT-qPCR. Kvantifikácia sa uskutočnila v 15 µl replikačných reakciách obsahujúcich 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), priméry a 5 µl zriedenej cDNA. Reakcie boli vykonané na systéme QuantStudio 6 Pro real-time PCR (Thermo Fisher) a údaje boli zozbierané a analyzované pomocou programu Design and Analysis (verzia 2.4.3). Ako bolo preukázané v tejto štúdii, relatívne množstvá boli normalizované na ribozomálny gén RpL19 (AGAP004422), ktorého expresia sa významne nemenila pri kŕmení krvou 27 alebo párení 3.
Kvalita RNA bola kontrolovaná pomocou Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Knižnice párových koncov Illumina boli pripravené a spracované v Broad Institute of MIT a Harvard. Sekvenčné čítania boli zarovnané s genómom A. gambiae (kmeň PEST, verzia 4.12) pomocou HISAT2 (verzia 2.0.5) s predvolenými parametrami. Čítania so skóre mapovacej kvality (MAPQ) <30 boli odstránené pomocou Samtools (verzia 1.3.1). Počet čítaní mapovaných na gény bol spočítaný pomocou htseq-count (verzia 0.9.1) s predvolenými parametrami. Normalizované počty čítaní boli vypočítané a diferenciálna génová expresia analyzovaná pomocou balíka DESeq2 (verzia 1.28.1) v R (verzia 4.0.3).
Kandidáti na gény modifikujúce ekdyzón boli identifikovaní najprv prehľadaním genómu A. gambiae pomocou algoritmu PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) s použitím predvolených hodnôt parametrov s nasledujúcimi sekvenciami dotazovaných proteínov: z Bombyx mori (prístupové číslo NP_001038956.1), Musca domestica (prístupové číslo XP_005182020.1, XP_005175332.1 a XP_011294434.1) a Microplitis demolitor (prístupové číslo XP_008552646.1 a XP_008552645.1) EcK z B. mori (prístupové číslo NP_001036900), Drosophila melanogaster (prístupové číslo NP_651202), Apis mellifera (prístupové číslo XP_394838) a Acyrthosiphon pisum (prístupové číslo XP_001947166); a EPP z B. mori (prístupové číslo XP_001947166) NP_001177919.1 a NP_001243996.1) a EO z D. melanogaster (prístupové číslo NP_572986.1) (krok 1). Ďalej sa filtrujú zhody na základe vysokej expresie mRNA (> 100 fragmentov/kilobázových exónov na milión mapovaných čítaní (FPKM) alebo > 85 %) v reprodukčnom tkanive (samičie LRT alebo MAG) v Gambii (krok 2). Na zlepšenie špecificity sme vybrali kandidátske enzýmy, ktoré sú exprimované aj v reprodukčnom tkanive A. albimanus, druhu Anopheles, ktorý počas párenia nesyntetizuje ani neprenáša ekdyzón. Kandidátske gény boli filtrované na základe nízkej expresie (<100 FPKM alebo <85. percentil) v reprodukčnom tkanive A. albimanus (krok 3). Ako finálny filter (krok 4) museli kandidátske gény spĺňať aspoň jednu z nasledujúcich podmienok: (1) signifikantne zvýšená expresia po párení (P < 0,05) podľa analýzy diferencovane exprimovaných génov a (2) v nereprodukčných tkanivách (< 85 % alebo <100 FPKM).
Predtým opísané metódy 28, 29, 30 sme upravili, aby sme dosiahli izotopové značenie celého organizmu. Stručne povedané, divoký typ Saccharomyces cerevisiae typu II (YSC2, Sigma) bol testovaný v kvasinkovej dusíkatej báze (BD Difco, DF0335) obsahujúcej (hm./obj.) 2 % glukózy (G7528, Sigma), 1,7 % kultivačného média bez aminokyselín a síranu amónneho) a 5 % 15N síranu amónneho (NLM-713, > 99 %, Cambridge Isotope Laboratories) ako jediný zdroj dusíka. Kvasinky boli získané centrifugáciou a larvy komárov boli kŕmené ad libitum až do zakuklenia. Doplnok s rybou múčkou (0,5 mg na 300 lariev) zabránil úmrtnosti v štvrtom instare. V párovacích experimentoch s neznačenými samcami boli potom použité iba samice na analýzu samčieho proteómu preneseného počas párenia.
4-6 dní staré panenské samice s označením 15N boli nútené páriť sa s vekovo zodpovedajúcimi neoznačenými panenskými samcami. Úspešné párenie bolo overené detekciou páriacich zátok pod epifluorescenčnou mikroskopiou. Po 3, 12 a 24 hodinách za minútu boli predsiene 45-55 spárených samíc preparované do 50 µl pufru s hydrogénuhličitanom amónnym (pH 7,8) a homogenizované tĺčikom. Homogenát bol centrifugovaný a supernatant zmiešaný s 50 µl 0,1% RapiGestu (186001860, Waters) v 50 mM hydrogénuhličitanu amónneho. Supernatant a peleta z každej vzorky boli rýchlo zmrazené na suchom ľade a cez noc odoslané do laboratória MacCoss na Washingtonskej univerzite, kde bola dokončená príprava vzorky pre LC-MS/MS. Peletu resuspendujte v 50 µl 0,1% RapiGestu v 50 mM hydrogénuhličitanu amónneho a sonikujte vo vodnom kúpeli. Koncentrácia proteínu v pelete a supernatante bola meraná pomocou BCA. V teste boli vzorky redukované 5 mM ditiotreitolom (DTT; Sigma), alkylované 15 mM jódacetamidom (Sigma) a inkubované pri 37 °C (1:0,50) počas 1 hodiny s pomerom trypsinizácia:trypsín:substrát). RapiGest bol lyzovaný pridaním 200 mM HCl, po čom nasledovala inkubácia pri 37 °C počas 45 minút a centrifugácia pri 14 000 ot./min počas 10 minút pri 4 °C, aby sa odstránili zvyšky. Vzorky boli premyté duálnou extrakciou na pevnej fáze (kartráže Oasis MCX, Waters) a resuspendované v 0,1 % kyseline mravčej na konečnú koncentráciu proteínu 0,33 µg µl-1. Neznačené MAG proteómy boli podobne analyzované z panenských samcov. Pre každú vzorku boli analyzované dva analytické replikáty. Následne bol 1 µg každého z nich analyzovaný pomocou 25 cm oxidu kremičitého 75 μm kolóny so 4 cm... lapač frit z taveného oxidu kremičitého Kasil1 (PQ) naplnený reverznou fázovou živicou Jupiter C12 (Phenomenex) a 180-minútová kvapalinová chromatografia. Trávenie vzoriek – MS/MS sa uskutočnilo na hmotnostnom spektrometri Q-Exactive HF (Thermo Fisher) so systémom nanoACQUITY UPLC (Waters). Údaje súvisiace s akvizíciou generované pre každý beh boli prevedené do formátu mzML pomocou Proteowizard (verzia 3.0.20287) a pomocou Comet31 (verzia 3.2) oproti databáze FASTA obsahujúcej proteínové sekvencie z Anopheles gambiae (VectorBase verzia 54), Anopheles coluzzi. Vyhľadávanie sa uskutočnilo na Mali-NIH (VectorBase verzia 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marec 2021), A. gambiae RNA-seq a trojrámcových transláciách známych ľudských kontaminantov. FDR zodpovedajúce peptidovej mape boli stanovené pomocou Percolator32 (verzia 3.05) s prahom 0,01 a peptidy boli zostavené do proteínových identifikátorov pomocou proteínovej parsimony v Limelight33 (verzia 2.2.0). Relatívna abundancia proteínov bola odhadnutá pomocou normalizovaného faktora spektrálnej abundancie (NSAF) vypočítaného pre každý proteín v každom cykle, ako bolo opísané predtým. NSAF vzhľadom na každý proteín bol spriemerovaný medzi vzorkami z dvoch rôznych biologických replikátov. Značenie 15N úspešne maskovalo samičí proteóm, hoci malé množstvo neznačeného proteínu bolo možné detegovať z označených panenských vzoriek. Detekciu redukcie samčích proteínov (1-5 spektier) v samičích surových vzorkách sme zaznamenali iba v technických cykloch, kde surové vzorky boli analyzované po samčích/páriacich sa vzorkách, ako výsledok „prenosu“ HPLC. Príležitostné proteíny nájdené ako „kontaminanty“ zo označených panenských vzoriek sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1.
Dva antigénne peptidy, QTTDRVAPAPDQQQ (v rámci izotypu PA) a MESDGTTPSGDSEQ (v rámci izotypu PA a PB) v Genscripte. Tieto dva peptidy boli skombinované, potom konjugované s nosičovým proteínom KLH a injekčne podané novozélandským králikom. Králiky boli po štvrtej injekcii usmrtené a celkový IgG bol izolovaný afinitnou purifikáciou. IgG z králika s najvyššou špecifickosťou pre EPP bol použitý na ďalší Western blotting.
Pre Western bloty sa samostatne pridal MAG (n = 10, kde n predstavuje počet biologicky nezávislých vzoriek komárov) a samičie LRT (n = 30) od 4-dňových panenských samcov a panenských alebo násilne spárených samíc (<10 po párení). Extrakčný pufor na proteíny (50 mM Tris, pH 8,0; 1 % NP-40; 0,25 % deoxycholátu sodného; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× kokteil inhibítorov proteáz (Roche)). Vzorky sa homogenizovali ihneď po disekcii pomocou guľôčkového odstredivého prístroja (2 mm sklenené guľôčky, 2 400 ot./min., 90 sekúnd). Nerozpustné zvyšky sa odstránili centrifugáciou pri 20 000 g pri 4 °C. Bielkoviny sa kvantifikovali Bradfordovou analýzou (Bio-Rad). Potom sa denaturovalo 20 µg proteínu MAG, 40 µg proteínu LRT a 20 µg zvyškového objemového proteínu a oddelilo sa 10 %... Bis-Tris NuPAGE s použitím MOPS pufra. Proteíny boli prenesené na polyvinylidénfluoridové membrány pomocou prenosového systému iBlot2 (Thermo Fisher). Membrány boli dvakrát premyté v 1× PBS-T (0,1 % Tween-20 v PBS) a potom blokované v blokovacom pufri Odyssey (Li-Cor) počas 1 hodiny pri teplote 22 °C. Membrány boli trepané cez noc pri teplote 4 °C s vlastnou králičou polyklonálnou primárnou protilátkou anti-EPP (1:700 v blokovacom pufri) a potkaňou monoklonálnou primárnou protilátkou anti-aktín MAC237 (Abeam; 1:4 000). Membrány boli premyté PBS-T a potom inkubované so sekundárnymi protilátkami (oslia anti-králičia 800CW a kozia anti-potkania 680LT (Li-Cor), obe 1:20 000) v blokovacom pufri obsahujúcom 0,01 % SDS a 0,2 % Tween -20 počas 1 hodiny pri teplote 22 °C. Membrány boli premyté PBS-T. a zobrazené skenerom Odyssey CLx. Snímky boli zozbierané a spracované v programe Image Studio (verzia 5.2). Špecifický pás zodpovedajúci izoforme EPP-RA (82 kDa) nebol detegovaný.
Kódujúce oblasti EPP (ako izoforma AGAP002463-RB obsahujúca histidínfosfatázovú doménu, NCBI konzervované vyhľadávanie domén 34) a EcK2 (AGAP002181) boli klonované do plazmidu pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); priméry sú uvedené v tabuľke 2 s rozšírenými údajmi. Osem linkerov GS4 (v tandeme) bolo vložených pred C-terminálnu značku 6xHis konštruktu pET-21a(+)-EcK2. Rekombinantné proteíny boli vyrobené pomocou reakcie syntézy proteínov E. coli bez buniek NEBExpress (New England BioLabs). Rekombinantné proteíny boli purifikované pomocou spinových kolón NEBExpress Ni (New England BioLabs). Kontrolný proteín dihydrofolátreduktázy (DHFR) bol vyrobený pomocou DNA templátu zo súpravy na syntézu proteínov E. coli bez buniek NEBExpress. Bielkoviny boli skladované v 50 % glycerole v PBS pri teplote -20 °C až 3 mesiace.
Fosfatázová aktivita EPP a tkanivových extraktov sa merala pomocou 4-nitrofenylfosfátu (pNPP; Sigma-Aldrich). Reakčný pufor obsahoval 25 mM Tris, 50 mM kyselinu octovú, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA a 1 mM DTT. Tkanivo sa homogenizovalo v reakčnom pufri a bunkové zvyšky sa odstránili centrifugáciou. Reakciu iniciujte pridaním enzýmu alebo tkanivového extraktu do reakčného pufra obsahujúceho 2,5 mg ml-1 pNPP. Reakčná zmes sa inkubovala pri izbovej teplote v tme a množstvo pNP premeneného z pNPP sa kvantifikovalo meraním absorbancie pri 405 nm v rôznych časoch.
Pre stanovenie aktivity EcK in vitro bol proteín inkubovaný s 0,2 mg 20E alebo 3D20E v 200 µl pufra (pH 7,5) obsahujúceho 10 mM HEPES-NaOH, 0,1 % BSA, 2 mM ATP a 10 mM MgCl2 počas 2 hodín pri teplote 27 °C. Reakcia bola zastavená pridaním 800 µl metanolu, potom ochladená na -20 °C počas 1 hodiny a následne centrifugovaná pri 20 000 g počas 10 minút pri 4 °C. Supernatant bol potom analyzovaný pomocou HPLC-MS/MS. Na tepelnú inaktiváciu proteínov použitých v kontrolnej skupine boli proteíny inkubované v 50 % glycerole v PBS počas 20 minút pri 95 °C.
Pre stanovenie aktivity EPP in vitro bol proteín inkubovaný s 3D20E22P (ekvivalentom množstva nájdeného v 18 pároch MAG, purifikovaných pomocou HPLC-MS/MS) v 100 µl pufru (pH 7,5) obsahujúcom 25 mM Tris, 50 mM kyselinu octovú, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA a 1 mM DTT počas 3 hodín pri teplote 27 °C. Reakcia bola zastavená pridaním 400 µl metanolu a ochladená na -20 °C počas 1 hodiny, potom centrifugovaná pri 20 000 g počas 10 minút pri 4 °C. Supernatant bol analyzovaný pomocou HPLC-MS/MS.
PCR fragmenty pre EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) a EcK2 (556 bp) boli amplifikované z cDNA pripravenej z kadáverov bezhlavých komárov zmiešaného pohlavia. PCR fragment kontroly eGFP (495 bp) bol amplifikovaný z predtým opísaného pCR2.1-eGFP; PCR priméry sú uvedené v rozšírenej tabuľke údajov 2. PCR fragment bol vložený medzi invertované T7 promótory na plazmide pL4440. Plazmidové konštrukty boli získané z NEB 5-α kompetentnej E. coli (New England Biolabs) a pred použitím overené sekvenovaním DNA (sekvenciu inzertu pozri v doplnkových údajoch 1). Priméry zodpovedajúce T7 promótoru (rozšírená tabuľka údajov 2) boli použité na amplifikáciu inzertu z plazmidu založeného na pL4440. Veľkosť PCR produktu bola potvrdená elektroforézou na agarózovom géli. dsRNA bola transkribovaná z PCR templátov pomocou transkripčnej súpravy Megascript T7 (Thermo Fisher) a purifikovaná podľa pokynov výrobcu s predtým opísanými úpravami.
Na injekciu dsRNA sa do 1 dňa po eklózii injektovalo 1 380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) v koncentrácii 10 ng nl-1 do hrudníka dospelých samcov alebo samíc (Nanoject III, Drummond). Hladiny génového knockdownu sa stanovili v najmenej troch biologických replikátoch extrakciou RNA, syntézou cDNA a RT-qPCR. Na injekciu ekdyzónu sa 4-dňovým panenským alebo 6-dňovým panenským samiciam kŕmeným krvou injektovalo 0,13, 0,21 alebo 0,63 µg 20E alebo 3D20E (Nanoject III, Drummond) v koncentráciách 1,3, 2,1 v závislosti od experimentálneho dizajnu alebo 6,3 ng nl-1. Injektovalo sa 100 nl 10 % (obj./obj.) etanolu vo vode; 100 nl 3D20E22P v 10 % etanole (čo zodpovedá 75 % množstva zisteného v dvojici MAG). Komáre boli náhodne rozdelené do injekčnej skupiny.
Pre testy trenia boli 3-dňové samice kŕmené ad libitum ľudskou krvou. Odstráňte čiastočne kŕmené alebo nekŕmené komáre. V závislosti od ošetrenia boli samice umiestnené do samostatných triacich pohárov na štyri noci najmenej 48 hodín po konzumácii krvi. Vajíčka boli počítané pod stereoskopom (Stemi 508, Zeiss); u spárených samíc boli vajíčka, z ktorých sa vyliahli larvy, považované za plodné.
Pri párovacích pokusoch sa samiciam ponechal aspoň 2 dni v závislosti od ošetrenia, aby sa vyvinula rezistencia voči páreniu, a samce divokého typu zodpovedajúceho veku boli následne zavedené do tej istej klietky. O dve noci neskôr boli oplodnené vezikuly samičiek vypreparované a genomická DNA bola uvoľnená zmrazením a rozmrazením a sonikáciou v pufri obsahujúcom 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA a 25 mM NaCl (pH 8,2). Vzorky boli inkubované s proteinázou K (0,86 µg µl-1) počas 15 minút pri 55 °C, potom 10 minút pri 95 °C. Preparáty surovej genomickej DNA boli 10-násobne zriedené a podrobené detekcii sekvencií chromozómu Y pomocou qPCR; priméry sú uvedené v rozšírenej tabuľke údajov 2. Absencia sekvencie chromozómu Y naznačuje, že nedošlo k páreniu.
Pri testoch opakovaného párenia boli samice podrobené nútenému páreniu vyšetrené na prítomnosť párovacích zátok, aby sa potvrdil stav párenia, a nechali sa 2 dni na rozvoj odolnosti voči páreniu v neprítomnosti samcov, ako bolo predtým opísané 36. Samce s transgénnymi spermiami DsRed boli potom zavedené do klietok samíc. O dve noci neskôr boli zo samíc vypreparované fertilizačné vezikuly a genomická DNA bola pripravená podľa vyššie uvedeného opisu a podrobená detekcii transgénu DsRed pomocou qPCR; priméry sú uvedené v tabuľke 2 s rozšírenými údajmi. Absencia transgénu DsRed naznačovala, že k opakovanému páreniu nedošlo.
3D20E bol syntetizovaný podľa predtým opísaného postupu 37. Stručne povedané, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) bolo rozpustených v 10 ml vody, po čom nasledovalo pridanie 30 mg platinovej čiernej (vo forme prášku, Sigma-Aldrich). Do reakčnej zmesi, ktorá bola miešaná pri izbovej teplote, bol kontinuálne prebublávan mierny prúd O2. Po 6 hodinách bolo pridaných 30 ml metanolu na zastavenie reakcie. Zmes bola centrifugovaná, aby sa odstránili častice katalyzátora. Supernatant bol odparený do sucha vo vákuu pri izbovej teplote. Vysušený reakčný produkt bol rozpustený v 10 % etanole a metanole na injekciu pre HPLC-MS/MS analýzu. Miera konverzie (z 20E na 3D20E) bola približne 97 % (obr. 4b) a MS spektrum syntetizovaného 3D20E zodpovedalo spektru zistenému u spárených samíc (obr. 4c).
Legenda obsahuje špecifické podrobnosti o vykonaných štatistických testoch. Na vykonanie Fisherovho exaktného testu, Mantel-Coxovho testu a Studentovho t-testu bol použitý GraphPad (verzia 9.0). Cochran-Mantel-Haenszelove testy boli vykonané pomocou vlastného R skriptu (dostupného na https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Rozloženie údajov bolo testované na normalitu pomocou Shapiro-Wilkovho testu s prahom významnosti 0,05. Ak údaje neprešli testom normality, bol vykonaný Mann-Whitneyov test. Údaje o prežití boli analyzované pomocou Mantel-Coxovho testu. Na vykonanie analýzy diferenciálnej expresie na úrovni génov RNA-seq bol použitý balík DESeq2 (verzia 1.28.1). Vodorovný pruh na grafe predstavuje medián. Ako prahová hodnota pre všetky testy bola použitá hodnota významnosti P = 0,05.
Viac informácií o dizajne štúdie nájdete v abstrakte správy o výskume prírody, na ktorý odkazuje tento článok.
Dáta z MS proteomiky boli uložené do konzorcia ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) prostredníctvom partnerského repozitára PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) s identifikátorom súboru údajov PXD032157.
Súbor údajov RNA-seq je uložený v knižnici Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pod sériovým záznamom GSE198665.
Ďalšie súbory údajov vygenerované a/alebo analyzované počas aktuálnej štúdie je možné získať od príslušných autorov na základe odôvodnenej žiadosti. Tento článok poskytuje zdrojové údaje.
De Loof, A. Ekdysteroidy: Zanedbávané pohlavné steroidy hmyzu? Muž: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyekdyzón a vývoj vaječníkov u Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).