Javascript je momentálne vo vašom prehliadači vypnutý. Niektoré funkcie tejto webovej stránky nebudú fungovať, keď je javascript vypnutý.
Zaregistrujte sa s vašimi konkrétnymi údajmi a konkrétnym liekom, o ktorý máte záujem, a my priradíme informácie, ktoré poskytnete, k článkom v našej rozsiahlej databáze a okamžite vám pošleme e-mailom kópiu vo formáte PDF.
Granule Ban-Lan-Gen zmierňujú chronickú recidivujúcu kolitídu vyvolanú dextránsulfátom sodným u myší moduláciou črevnej mikrobioty a obnovením produkcie črevného GLP-1 odvodeného z SCFA
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Pekinská univerzita, Nemocnica v Šen-čene, Katedra farmácie, Šen-čen, Čínska ľudová republika; 2Zdravotnícke vedecké centrum Univerzity v Šen-čene, Farmaceutická fakulta, Šen-čen, Čínska ľudová republika; 3Výskumné centrum inžinierskych technológií etnickej medicíny a tradičnej čínskej medicíny, Vývoj a aplikácia Lekárskej univerzity v Kuej-jang, Ministerstvo školstva, Kľúčové farmaceutické laboratórium provincie Kuej-jang, Lekárska univerzita v Kuej-jang, Čínska ľudová republika; 4 Gastroenterologické oddelenie, Nemocnica v Šen-čene Pekinskej univerzity, Šen-čen, Čínska ľudová republika; 5 Farmaceutická fakulta, Lekárska univerzita v Kuej-jang, Štátne kľúčové laboratórium funkcie a aplikácie liečivých rastlín, Kuej-jang; 6 Oddelenie laboratórnej medicíny, Nemocnica Pekinskej univerzity v Shenzhene, Shenzhen, Čína [email protected] Shen Xiangchun, Farmaceutická fakulta, Lekárska univerzita v Guizhou, Guizhou, Čínska ľudová republika, 550004, Email [email protected] Cieľ: Terapia založená na GLP-1 je novou možnosťou liečby zápalového ochorenia čriev. Granule Ban-Lan-Gen (BLG) sú známou antivírusovou TCM formuláciou, ktorá vykazuje potenciálnu protizápalovú aktivitu pri liečbe rôznych zápalových stavov. Jej protizápalový účinok na kolitídu a mechanizmus účinku však stále nie sú jasné. METÓDY: Stanoviť chronickú recidivujúcu kolitídu indukovanú dextránsulfátom sodným (DSS) u myší. Na posúdenie ochranného účinku BLG sa vykonali indexy aktivity ochorenia, histologické markery poškodenia a hladiny prozápalových cytokínov. Účinky BLG na črevnú mikrobiotu a črevo boli charakterizované hladinami GLP-1 v sére a expresiou Gcg, GPR41 a GRP43 v hrubom čreve, zložením črevnej mikrobioty, hladinami SCFA v stolici a uvoľňovaním GLP-1 z Primárne myšie epitelové bunky hrubého čreva produkujú GLP-1 odvodené z SCFA. Výsledky: Liečba BLG významne znížila úbytok telesnej hmotnosti, DAI, skrátenie hrubého čreva, poškodenie tkaniva hrubého čreva a hladiny prozápalových cytokínov TNF-α, IL-1β a IL-6 v tkanive hrubého čreva. Okrem toho môže liečba BLG významne obnoviť expresiu Gcg, GPR41 a GRP43 v hrubom čreve a hladiny GLP-1 v sére u myší s kolitídou, a to zvýšením baktérií produkujúcich SCFA, ako sú Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001, a znížením množstva baktérií, ako sú Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas a Oscillibacter. Okrem toho môže liečba BLG významne zvýšiť hladinu SCFA v stolici myší s kolitídou. Zároveň experimenty in vitro tiež ukázali, že fekálny extrakt myší liečených BLG môže výrazne stimulovať primárne malé myšie epitelové bunky hrubého čreva, ktoré vylučujú GLP-1. Závery: Tieto zistenia naznačujú, že BLG má antikolitídový účinok. BLG má potenciál byť vyvinutý ako terapia, aspoň čiastočne moduláciou črevnej mikrobioty a obnovením produkcie GLP-1 odvodenej z SCFA v črevách. Sľubné lieky na chronickú recidivujúcu kolitídu. Kľúčové slová: kolitída, granule Ban-Lan-Gen, črevná mikrobiota, mastné kyseliny s krátkym reťazcom, GLP-1
Ulcerózna kolitída (UC) je dlhodobé zápalové ochorenie hrubého čreva a konečníka charakterizované opakujúcou sa hnačkou, bolesťami brucha, úbytkom hmotnosti a hlienohnisavou krvavou stolicou.1 V poslednom čase sa prevalencia UC zvyšuje v krajinách s predtým nízkou incidenciou vrátane Číny, a to s rastúcou popularitou západného životného štýlu.2 Tento nárast predstavuje závažné problémy pre verejné zdravie a má vážne dôsledky pre schopnosť pacientov pracovať a kvalitu života. Je potrebné poznamenať, že patogenéza UC zostáva do značnej miery nejasná, ale všeobecne sa uznáva, že genetika, faktory prostredia, črevná mikrobiota a imunitný systém prispievajú k rozvoju UC.3 Ani v súčasnosti neexistuje liek na UC a cieľom liečby je klinicky kontrolovať klinické príznaky, vyvolať a udržiavať remisiu, podporiť hojenie slizníc a znížiť recidívu. Klasická liečba zahŕňa aminosalicyláty, kortikosteroidy, imunosupresíva a biologické liečivá. Tieto lieky však nemôžu dosiahnuť požadovaný účinok kvôli svojim rôznym vedľajším účinkom.4 Nedávno mnoho prípadových štúdií ukázalo, že tradičná čínska medicína (TCM) preukázala veľký potenciál pri zmierňovaní UC. s nízkou toxicitou, čo naznačuje, že vývoj nových terapií TCM je sľubnou liečebnou stratégiou pre ulceróznu kolitídu.5-7
Granule Banlangen (BLG) sú prípravkom tradičnej čínskej medicíny vyrobeným z vodného extraktu z koreňa Banlangen.8 Okrem antivírusovej účinnosti vykazuje BLG potenciálnu protizápalovú aktivitu pri liečbe rôznych zápalových stavov.9,10 Okrem toho boli z vodných extraktov Radix isatidis izolované a identifikované glukozinoláty (R,S-goitrín, progoitrín, epiprorubín a glukozid) a nukleozidy (hypoxantín, adenozín, uridín a guanozín) a indigové alkaloidy, ako je indigo a indirubín.11,12 Predchádzajúce štúdie dobre zdokumentovali, že zlúčeniny adenozín, uridín a indirubín vykazujú silné účinky proti kolitíde v rôznych zvieracích modeloch kolitídy.13-17 Neboli však vykonané žiadne štúdie založené na dôkazoch na vyhodnotenie účinnosti BLG pri kolitíde. V tejto štúdii sme skúmali ochranný účinok BLG na chronickú recidivujúcu kolitídu vyvolanú dextránsulfátom sodným (DSS) u myší C57BL/6 a zistili sme že perorálne podávanie BLG významne zmiernilo DSS-indukovaný chronický recidivujúci zápal hrubého čreva u myší, jeho regulačné mechanizmy sú spojené s moduláciou črevnej mikrobioty a obnovou produkcie glukagónu podobného peptidu-1 (GLP-1) odvodeného z čriev.
Granule BLG (bez cukru, schválené NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Peking, Čína; číslo šarže: 20110966) boli zakúpené v lekárňach. DSS (molekulová hmotnosť: 36 000 – 50 000 daltonov) bol zakúpený od spoločnosti MP Biologicals (Santa Ana, USA). Sulfasalazín (SASP) (čistota ≥ 98 %), hematoxylín a eozín boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Súpravy na stanovenie myšieho TNF-α, IL-1β a IL-6 luminex Elisa boli zakúpené od spoločnosti R&D systems (Minneapolis, MN, USA). Kyselina octová, kyselina propiónová a kyselina maslová boli zakúpené od spoločnosti Aladdin Industries (Šanghaj, Čína). Kyselina 2-etylmaslová bola zakúpená od spoločnosti Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko).
6-8 týždňové samce myší C57BL/6 (telesná hmotnosť 18-22 g) boli zakúpené od spoločnosti Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Peking, Čína) a boli chované v prostredí s teplotou 22 ± 2 °C s 12-hodinovým cyklom svetlo/tma. Myši boli kŕmené štandardnou hlodavčími krmivami s voľným prístupom k pitnej vode počas jedného týždňa, aby si zvykli na nové prostredie. Myši boli potom náhodne rozdelené do štyroch skupín: kontrolná skupina, modelová skupina DSS, skupina liečená SASP (200 mg/kg, perorálne) a skupina liečená BLG (1 g/kg, perorálne). Ako je znázornené na obrázku 1A, podľa našej predchádzajúcej štúdie bola experimentálna chronická recidivujúca kolitída u myší indukovaná tromi cyklami 1,8 % DSS počas 5 dní, po ktorých nasledovala destilovaná voda počas 7 dní, podľa našej predchádzajúcej štúdie.18 Myši v skupinách liečených SASP a BLG boli liečené SASP a BLG každý deň od dňa 0. Podľa predbežných experimentov bola dávka BLG stanovená na 1 g/kg. Medzitým bola dávka SASP stanovená na 200 mg/kg podľa literatúry.4 Kontrolná skupina a skupina s modelom DSS dostávali počas celého experimentu rovnaký objem vody.
Obrázok 1 BLG zmierňuje chronickú recidivujúcu kolitídu indukovanú DSS u myší. (A) Experimentálny návrh chronickej recidivujúcej kolitídy a liečby, (B) zmena telesnej hmotnosti, (C) skóre indexu aktivity ochorenia (DAI), (D) dĺžka hrubého čreva, (E) reprezentatívny obraz hrubého čreva, (F) farbenie H&E hrubé črevo (zväčšenie, ×100) a (G) histologické skóre. Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM (n = 6).##p < 0,01 alebo ###p < 0,001 oproti kontrolnej (Con) skupine; *p < 0,05 alebo **p < 0,01 alebo ***p < 0,001 oproti skupine DSS.
Telesná hmotnosť, konzistencia stolice a rektálne krvácanie sa zaznamenávali denne. Index aktivity ochorenia (DAI) sa stanovil kombináciou skóre telesnej hmotnosti, konzistencie stolice a rektálneho krvácania, ako bolo opísané predtým.19 Na konci experimentu boli všetky myši utratené a bola im odobratá krv, výkaly a hrubé črevo na ďalšie experimenty.
Tkanivo hrubého čreva bolo fixované formalínom a zaliate do parafínu. Boli vyrobené 5-mikrónové rezy a zafarbené hematoxylínom-eozínom (H&E), potom zaslepené a vyhodnotené podľa predtým opísaného postupu.19
Celková RNA tkaniva hrubého čreva bola extrahovaná pomocou činidla Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), po čom nasledovala extrakcia cDNA reverznou transkriptázou (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japonsko). Kvantitatívna PCR bola vykonaná pomocou systému PCR v reálnom čase so SYBR Green Master (Roche, Basel, Švajčiarsko). Cieľové génové transkripty boli normalizované na β-aktín a údaje boli analyzované metódou 2-ΔΔCT. Sekvencie génových primerov sú uvedené v tabuľke 1.
Primárna izolácia a kultivácia buniek hrubého čreva myší sa uskutočnila podľa predtým opísaného postupu.20 Stručne povedané, hrubé črevá 6-8 týždňov starých myší sa najprv vyrezali po usmrtení cervikálnou dislokáciou, potom sa pozdĺžne otvorili, ošetrili sa Hanksovým vyváženým soľným roztokom (HBSS, bez vápnika a horčíka) a narezali na malé kúsky s hrúbkou 0,5-1 mm. Následne sa tkanivá štiepili s 0,4 mg/ml kolagenázy XI (Sigma, Poole, Spojené kráľovstvo) vo voľnom médiu DMEM a centrifugovali sa pri 300 xg počas 5 minút pri izbovej teplote. Pelet sa resuspendoval v médiu DMEM (doplnenom o 10 % fetálne bovinné sérum, 100 jednotiek/ml penicilínu a 100 µg/ml streptomycínu) pri teplote 37 °C a nechal sa prejsť cez nylonovú sieťku (veľkosť pórov ~250 µm). Alikvóty buniek hrubého čreva sa umiestnili do misiek so skleneným dnom a inkubovali sa s kyselinou octovou, kyselinou propiónovou, kyselinou maslovou a extraktmi z myšieho trusu počas 2 hodín pri teplote... 37 °C, 5 % CO2.
Tkanivo hrubého čreva bolo homogenizované s PBS a hladiny cytokínov IL-6, TNF-α a IL-1β v tkanive hrubého čreva boli detegované pomocou testovacích súprav luminex ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). Podobne boli hladiny GLP-1 v sére a kultivačnom médiu primárnych myších epitelových buniek hrubého čreva stanovené pomocou súpravy ELISA (Bioswamp, Wuhan, Čína) podľa pokynov výrobcu.
Celková DNA z výkalov bola extrahovaná pomocou súpravy na extrakciu DNA (Tiangen, Čína). Kvalita a kvantita DNA boli merané v pomeroch 260 nm/280 nm a 260 nm/230 nm. Následne, s použitím každej extrahovanej DNA ako templátu, boli použité špecifické priméry 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) a 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) na amplifikáciu oblastí V3-V4 génu 16S rRNA v rôznych oblastiach. Produkty PCR boli purifikované pomocou súpravy QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Nemecko), kvantifikované pomocou PCR v reálnom čase a sekvenované pomocou sekvenčnej platformy IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, USA). Pre bioinformatickú analýzu bolo spracovanie údajov vykonané podľa predtým publikovaných protokolov.21,22 Stručne povedané, na filtrovanie surových expresných súborov použite Cutadapt (V1.9.1). OTU boli zoskupené pomocou UPARSE (verzia 7.0.1001) s hranicou podobnosti 97 % a na odstránenie chimérických sekvencií sa použil UCHIME. Analýza a klasifikácia zloženia spoločenstva sa vykonali pomocou klasifikátora RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) založeného na databáze génov ribozomálnej RNA SILVA.
Hladiny mastných kyselín s krátkym reťazcom (kyselina octová, kyselina propiónová a kyselina maslová) boli merané podľa predtým opísaného postupu Tao a kol. s niekoľkými úpravami.23 Stručne povedané, 100 mg výkalov bolo najprv suspendovaných v 0,4 ml deionizovanej vody, potom v 0,1 ml 50 % kyseliny sírovej a 0,5 ml kyseliny 2-etylmaslovej (vnútorný štandard), potom homogenizovaných a zahriatych na 4 °C. Centrifugujte pri 12 000 ot./min. počas 15 minút pri teplote °C. Supernatant sa extrahoval 0,5 ml éteru a vstrekol sa do plynového chromatografu na analýzu. Pre analýzu plynovou chromatografiou (GC) sa vzorky analyzovali pomocou plynového chromatografu GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) vybaveného plameňovo-ionizačným detektorom (FID). Separácia sa dosiahla pomocou kolóny ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Čína). Údaje sa získali pomocou softvéru GC solution (Shimadzu, Inc.). Deliaci pomer bol 10:1, nosným plynom bol dusík a prietok bol 6 ml/min. Vstrekovaný objem bol 1 μl. Teplota injektora a detektora bola 300 °C. Teplota pece sa udržiavala na 140 °C počas 13,5 minúty, potom sa zvýšila na 250 °C rýchlosťou 120 °C/min; teplota sa udržiavala 5 minút.
Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Významnosť údajov bola hodnotená jednofaktorovou ANOVA, po ktorej nasledoval Duncanov test viacerých rozsahov. Na všetky výpočty bol použitý softvér GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) a hodnota p < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.
Je dobre známe, že UC je chronické recidivujúce ochorenie kolitídy so silnými bolesťami brucha, hnačkou a krvácaním. Preto bola stanovená chronická recidivujúca kolitída vyvolaná DSS u myší na vyhodnotenie účinnosti BLG proti kolitíde (obr. 1A). V porovnaní s kontrolnou skupinou mali myši v modelovej skupine DSS významne zníženú telesnú hmotnosť a vyšší DAI a tieto zmeny sa významne zvrátili po 24 dňoch liečby BLG (obrázok 1B a C). Skrátenie hrubého čreva je dôležitým znakom UC. Ako je znázornené na obrázkoch 1D a E, dĺžka hrubého čreva myší, ktoré dostávali DSS, sa významne skrátila, ale liečba BLG ich zmiernila. Následne sa vykonala histopatologická analýza na posúdenie zápalu hrubého čreva. H&E farbené snímky a patologické skóre ukázali, že podávanie DSS významne narušilo architektúru hrubého čreva a viedlo k deštrukcii krypty, zatiaľ čo liečba BLG významne znížila deštrukciu krypty a patologické skóre (obrázok 1F a G). Je pozoruhodné, že ochranný účinok BLG v dávke 1 g/kg bol porovnateľný s ochranným účinkom SASP v dávke 200 mg/kg. Tieto zistenia spoločne naznačujú, že BLG je účinný pri znižovaní závažnosti chronickej recidivujúcej kolitídy vyvolanej DSS u myší.
TNF-α, IL-1β a IL-6 sú dôležité zápalové markery zápalu hrubého čreva. Ako je znázornené na obrázku 2A, DSS indukoval významný nárast génovej expresie TNF-α, IL-1β a IL-6 v hrubom čreve v porovnaní s kontrolnou skupinou. Podávanie BLG môže významne zvrátiť tieto zmeny sprostredkované DSS. Ďalej sme použili ELISA na stanovenie hladín zápalových cytokínov TNF-α, IL-1β a IL-6 v tkanive hrubého čreva. Výsledky tiež ukázali, že hladiny TNF-α, IL-1β a IL-6 v hrubom čreve boli u myší liečených DSS významne zvýšené, zatiaľ čo liečba BLG tieto zvýšenia zmiernila (obrázok 2B).
Obrázok 2 BLG inhibuje génovú expresiu a produkciu prozápalových cytokínov TNF-α, IL-1β a IL-6 v hrubom čreve myší liečených DSS. (A) Expresia génov TNF-α, IL-1β a IL-6 v hrubom čreve; (B) hladiny proteínov TNF-α, IL-1β a IL-6 v hrubom čreve. Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 alebo ##p < 0,01 alebo ###p < 0,001 oproti kontrolnej (Con) skupine; *p < 0,05 alebo **p < 0,01 oproti skupine DSS.
Črevná dysbióza je kritická v patogenéze ulceróznej kolitidy (UC).24 Aby sa zistilo, či BLG moduluje črevnú mikrobiotu myší liečených DSS, vykonalo sa sekvenovanie 16S rRNA na analýzu bakteriálnej komunity obsahu čriev. Vennov diagram ukazuje, že tri skupiny zdieľajú 385 OTU. Zároveň mala každá skupina jedinečné OTU (obr. 3A). Okrem toho index Chao1 a Shannonův index znázornené na obrázku 3B a C ukázali, že diverzita komunity črevnej mikrobioty bola u myší liečených BLG znížená, zatiaľ čo Shannonův index bol v skupine liečenej BLG významne znížený. Na určenie vzorcov zhlukovania medzi tromi skupinami sa použila analýza hlavných komponentov (PCA) a analýza hlavných súradníc (PCoA) a ukázali, že štruktúra komunity myší liečených DSS bola po liečbe BLG jasne oddelená (obrázok 3D a E). Tieto údaje naznačujú, že liečba BLG významne ovplyvnila štruktúru komunity myší s kolitídou vyvolanou DSS.
Obrázok 3 BLG mení diverzitu črevnej mikrobioty u myší s kolitídou indukovanou DSS. (A) Vennov diagram OTU, (B) index Chao1, (C) Shannonov index bohatosti, (D) graf skóre OTU pomocou analýzy hlavných komponentov (PCA), (E) obrázok so skóre analýzy hlavných súradníc (PCoA) OTU. Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM (n = 6).**p < 0,01 vs skupina DSS.
Na posúdenie špecifických zmien v fekálnej mikrobiote sme analyzovali zloženie črevnej mikrobioty na všetkých taxonomických úrovniach. Ako je znázornené na obrázku 4A, hlavnými kmeňmi vo všetkých skupinách boli Firmicutes a Bacteroidetes, nasledované Verrucomicrobia. Relatívna abundancia Firmicutes a pomery Firmicutes/Bacteroidetes boli signifikantne zvýšené v fekálnych mikrobiálnych spoločenstvách myší liečených DSS v porovnaní s kontrolnými myšami a tieto zmeny sa signifikantne zvrátili po liečbe BLG. Najmä liečba BLG signifikantne zvýšila relatívnu abundanciu Verrucobacterium v ​​fekálnych mikrobiálnych spoločenstvách myší s kolitídou vyvolanou DSS. Na úrovni domácností boli fekálne mikrobiálne spoločenstvá obsadené Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae a Prevotellaceae (obr. 4B). V porovnaní so skupinou DSS, deplécia BLG zvýšila abundanciu Akkermansiaceae, ale znížila abundanciu Lachnospiraceae a Ruminococcaceae. Je pozoruhodné, že na úrovni rodu... Fekálna mikrobiota bola obsadená baktériami Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001 (Obr. 4C). Toto zistenie tiež preukázalo, že liečba BLG účinne zvrátila nerovnováhu mikrobioty v reakcii na DSS, ktorá sa vyznačovala poklesom Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas a Oscillibacter a nárastom Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001.
Obrázok 4 BLG mení početnosť črevnej mikrobioty u myší s kolitídou indukovanou DSS. (A) Početnosť črevnej mikrobioty na úrovni kmeňa; (B) Početnosť črevnej mikrobioty na úrovni čeľade; (C) Početnosť črevnej mikrobioty na úrovni rodu. Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM (n = 6). #p < 0,05 alebo ###p < 0,001 oproti kontrolnej (Con) skupine; *p < 0,05 alebo **p < 0,01 alebo ***p < 0,001 oproti skupine DSS.
Vzhľadom na to, že mastné kyseliny s krátkym reťazcom (SCFA) sú hlavnými metabolitmi Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001, zatiaľ čo acetát, propionát a butyrát sú najhojnejšie SCFA v črevnom lúmene,25-27 stále sme v našej štúdii. Ako je znázornené na obrázku 5, koncentrácie acetátu, propionátu a butyrátu v stolici boli v skupine liečenej DSS významne znížené, zatiaľ čo liečba BLG mohla toto zníženie do značnej miery potlačiť.
Obrázok 5. BLG zvyšuje hladiny SCFA v stolici myší s kolitídou vyvolanou DSS. (A) Obsah kyseliny octovej v stolici; (B) obsah kyseliny propiónovej v stolici; (C) obsah kyseliny maslovej v stolici. Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM (n = 6). #p < 0,05 alebo ##p < 0,01 oproti kontrolnej (Con) skupine; *p < 0,05 alebo **p < 0,01 oproti skupine DSS.
Ďalej sme vypočítali Pearsonov korelačný koeficient medzi diferenciálnymi SCFA na úrovni rodu a fekálnou mikrobiotou. Ako je znázornené na obrázku 6, Akkermansia pozitívne korelovala s produkciou kyseliny propiónovej (Pearson = 0,4866) a kyseliny maslovej (Pearson = 0,6192). Naproti tomu Enteromonas aj Oscillobacter negatívne korelovali s produkciou acetátu s Pearsonovými koeficientmi 0,4709 a 0,5104. Podobne aj Ruminococcaceae_UCG-014 negatívne koreloval s produkciou kyseliny propiónovej (Pearson = 0,4508) a kyseliny maslovej (Pearson = 0,5842).
Obrázok 6 Pearsonova korelačná analýza medzi diferenciálnymi SCFA a mikróbmi hrubého čreva. (A) Enteromonas s kyselinou octovou; (B) Bacil otrasu mozgu s kyselinou octovou; (C) Akkermansia vs. kyselina propiónová; (D) Ruminococcus_UCG-014 s kyselinou propiónovou; (E) Akkermansia s kyselinou maslovou; (F) Ruminococcus_UCG-014 s kyselinou maslovou.
Glukagónu podobný peptid-1 (GLP-1) je bunkovo-špecifický posttranslačný produkt proglukagónu (Gcg) s protizápalovými vlastnosťami.28 Ako je znázornené na obrázku 7, DSS indukovala významný pokles expresie mRNA Gcg. Liečba hrubým črevom a BLG mohla významne zvrátiť zníženie Gcg indukované DSS v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr. 7A). Zároveň bola hladina GLP-1 v sére v skupine liečenej DSS významne znížená a liečba BLG mohla tomuto zníženiu do značnej miery zabrániť (obr. 7B). Keďže mastné kyseliny s krátkym reťazcom môžu stimulovať sekréciu GLP-1 prostredníctvom aktivácie receptora 43 spojeného s G-proteínom (GRP43) a receptora 41 spojeného s G-proteínom (GRP41), skúmali sme aj GPR41 a GRP43 v hrubom čreve myší s kolitídou a zistili sme, že expresia mRNA GRP43 a GPR41 v hrubom čreve bola po expozícii DSS významne znížená a liečba BLG mohla tieto poklesy účinne zachrániť (obrázok 7C a D).
Obrázok 7 BLG zvyšuje hladiny GLP-1 v sére a expresiu mRNA Gcg, GPR41 a GRP43 v hrubom čreve u myší liečených DSS. (A) Expresia mRNA Gcg v tkanive hrubého čreva; (B) Hladina GLP-1 v sére; (C) Expresia mRNA GPR41 v tkanive hrubého čreva; (D) Expresia mRNA GPR43 v tkanive hrubého čreva. Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 alebo ##p < 0,01 oproti kontrolnej (Con) skupine; *p < 0,05 oproti skupine DSS.
Keďže liečba BLG mohla zvýšiť hladiny GLP-1 v sére, expresiu mRNA Gcg v hrubom čreve a hladiny SCFA v stolici u myší liečených DSS, ďalej sme skúmali acetát, propionát a butyrát, ako aj u kontrolných myší (F-Con), myší s kolitídou DSS (F-Con) (DSS) a myší s kolitídou liečenou BLG (F-BLG) na uvoľňovanie GLP-1 z primárnych myších epitelových buniek hrubého čreva. Ako je znázornené na obrázku 8A, primárne myšie epitelové bunky hrubého čreva ošetrené 2 mM kyselinou octovou, kyselinou propiónovou a kyselinou maslovou významne stimulovali uvoľňovanie GLP-1, čo je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami.29,30 Podobne všetky F-Con, F-DSS a F-BLG (ekvivalent 0,25 g stolice) výrazne stimulovali uvoľňovanie GLP-1 z primárnych myších epitelových buniek hrubého čreva. Je pozoruhodné, že množstvo GLP-1 uvoľneného primárnymi myšími epitelovými bunkami hrubého čreva ošetrenými F-DSS bolo oveľa nižšie ako u primárnych myší liečených F-Con a F-BLG. epitelové bunky hrubého čreva (obrázok 8B). Tieto údaje naznačujú, že liečba BLG významne obnovila produkciu GLP-1 odvodeného z SCFA v črevách.
Obrázok 8 SCFA odvodené z BLG stimulujú uvoľňovanie GLP-1 z primárnych myších buniek hrubého čreva. (A) Kyselina octová, kyselina propiónová a kyselina maslová stimulovali uvoľňovanie GLP-1 z primárnych myších buniek hrubého čreva; (B) fekálne extrakty F-Con, F-DSS a F-BLG stimulovali primárne myšie bunky hrubého čreva Množstvo uvoľneného GLP-1. Alikvóty buniek hrubého čreva boli umiestnené do Petriho misiek so skleneným dnom a ošetrené 2 mM kyselinou octovou, kyselinou propiónovou, kyselinou maslovou a fekálnymi extraktmi F-Con, F-DSS a F-BLG (ekvivalent 0,25 g stolice). 2 hodiny pri 37 °C, 5 % CO2. Množstvo GLP-1 uvoľneného z primárnych myších buniek hrubého čreva bolo detegované pomocou ELISA. Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM (n = 3). #p < 0,05 alebo ##p < 0,01 oproti slepej vzorke alebo F-Con; *p < 0,05 oproti F-DSS.
Skratky: Ace, kyselina octová; Pro, kyselina propiónová; avšak kyselina maslová; F-Con, fekálny extrakt z kontrolných myší; F-DSS, fekálny extrakt z myší s kolitídou; F-BLG, z hrubého čreva ošetreného BLG. Fekálne extrakty zápalových myší.
Ulcerózna kolitída, ktorú Svetová zdravotnícka organizácia zaradila medzi refraktérne ochorenia, sa stáva globálnym nebezpečenstvom; Účinné metódy na predpovedanie, prevenciu a liečbu tohto ochorenia sú však stále obmedzené. Preto je naliehavo potrebné preskúmať a vyvinúť nové bezpečné a účinné terapeutické stratégie pre ulceróznu kolitidu (UC). Prípravky tradičnej čínskej medicíny sú sľubnou možnosťou, pretože mnohé prípravky tradičnej čínskej medicíny sa v priebehu storočí ukázali ako účinné pri liečbe UC u čínskej populácie a všetky sú to biologické organické látky a prírodné materiály, ktoré sú väčšinou neškodné pre ľudí a zvieratá.31,32 Cieľom tejto štúdie bolo nájsť bezpečný a účinný prípravok tradičnej čínskej medicíny na liečbu UC a preskúmať jeho mechanizmus účinku. BLG je známy čínsky bylinný prípravok používaný na liečbu chrípky.8,33 Práca v našom laboratóriu a iných ukázala, že indigo, spracovaný produkt tradičnej čínskej medicíny z rovnakej suroviny ako BLG, vykazuje významnú účinnosť pri liečbe UC u ľudí a zvierat.4,34 Účinky BLG proti kolitíde a jeho mechanizmus však nie sú jasné. V súčasnej štúdii naše výsledky ukazujú, že BLG účinne zmierňuje zápal hrubého čreva vyvolaný DSS, ktorý je spojený s moduláciou črevnej mikrobioty. a obnovenie produkcie GLP-1 pochádzajúceho z čreva.
Je dobre známe, že ulcerózna kolitída sa vyznačuje relapsujúcimi obdobiami s typickými klinickými príznakmi, ako je úbytok hmotnosti, hnačka, krvácanie z konečníka a rozsiahle poškodenie sliznice hrubého čreva.35 Chronická relapsujúca kolitída sa teda liečila podávaním troch cyklov 1,8 % DSS počas piatich dní, po ktorých nasledovalo sedemdňové pitie vody. Ako je znázornené na obrázku 1B, kolísavý úbytok hmotnosti a skóre DAI naznačovali úspešnú indukciu chronickej relapsujúcej kolitídy. Myši v skupine liečenej BLG vykazovali zotavenie sa z postupu nahor od 8. dňa, čo sa významne líšilo od 24. dňa. Rovnaké zmeny sa pozorovali aj v skóre DAI, čo naznačuje zlepšenie klinického zlepšenia kolitídy. Pokiaľ ide o poškodenie hrubého čreva a zápalový stav, dĺžka hrubého čreva, poškodenie tkaniva hrubého čreva a génová expresia a produkcia prozápalových cytokínov TNF-α, IL-1β a IL-6 v tkanive hrubého čreva sa po liečbe BLG tiež výrazne zlepšili. Tieto výsledky spoločne jasne ukazujú, že BLG je účinný pri liečbe chronickej relapsujúcej kolitídy u myší.
Ako BLG uplatňuje svoje farmakologické účinky? Početné predchádzajúce štúdie ukázali, že črevná mikrobiota hrá kľúčovú úlohu v patogenéze ulceróznej kolitidy (UC) a terapie založené na mikrobióme a cielené na mikrobióm sa ukázali ako veľmi atraktívna stratégia liečby UC. V tejto štúdii sme preukázali, že liečba BLG viedla k významným zmenám v zložení črevnej mikrobioty, čo naznačuje, že ochranný účinok BLG proti kolitíde vyvolanej DSS súvisí s moduláciou črevnej mikrobioty. Toto pozorovanie je v súlade s predstavou, že preprogramovanie homeostázy črevnej mikrobioty je dôležitým prístupom k pochopeniu účinnosti prípravkov TCM.36,37 Je pozoruhodné, že Akkermansia je gramnegatívna a striktne anaeróbna baktéria, ktorá žije v hlienovej vrstve čreva, degraduje mucíny, produkuje kyselinu propiónovú, stimuluje diferenciáciu pohárikovitých buniek a udržiava funkciu integrity slizničnej bariéry.26 Viaceré klinické a zvieracie údaje naznačujú, že Akkermansia je silne spojená so zdravou sliznicou38 a perorálne podávanie Akkermansia spp. môže významne zlepšiť zápal sliznice.39 Naše súčasné údaje naznačujú, že relatívna abundancia Akkermansia sa po liečbe BLG významne zvyšuje. Okrem toho je Prevotellaceae_UCG-001 baktéria produkujúca SCFA.27 Viaceré štúdie ukázali, že Prevotellaceae_UCG-001 sa nachádza v nízkej relatívnej abundancii vo výkaloch zvierat s kolitídou.40,41 Naše súčasné údaje tiež ukazujú, že liečba BLG môže významne zvýšiť relatívnu abundanciu Prevotellaceae_UCG-001 v hrubom čreve myší liečených DSS. Naproti tomu Oscillibacter je mezofilná, striktne anaeróbna baktéria.42 uvádza, že relatívna abundancia Oscillibacter sa významne zvýšila u myší s UC a bola významne pozitívne korelovaná s hladinami IL-6 a IL-1β a patologickými skóre.43,44 Je pozoruhodné, že liečba BLG významne znížila relatívnu abundanciu Oscillibacter vo výkaloch myší liečených DSS. Je pozoruhodné, že tieto baktérie pozmenené BLG boli baktériami produkujúcimi najviac SCFA. Početné predchádzajúce štúdie preukázali potenciálne priaznivé účinky SCFA. na zápal hrubého čreva a ochranu integrity črevného epitelu.45,46 Naše súčasné údaje tiež pozorovali, že koncentrácie acetátu, propionátu a butyrátu SCFA vo výkaloch ošetrených DSS boli u myší liečených BLG výrazne zvýšené. Tieto zistenia spoločne jasne ukazujú, že liečba BLG môže účinne zvýšiť baktérie produkujúce SCFA indukované DSS u myší s chronickou relapsujúcou kolitídou.
GLP-1 je inkretín produkovaný hlavne v ileu a hrubom čreve a hrá dôležitú úlohu pri oddialení vyprázdňovania žalúdka a znižovaní postprandiálnej hladiny glukózy v krvi.47 Dôkazy naznačujú, že dipeptidylpeptidáza (DPP)-4, agonista receptora GLP-1 a nanoliečivo GLP-1 môžu účinne zmierniť zápal čriev u myší.48-51 Ako sa uvádza v predchádzajúcich štúdiách, vysoké koncentrácie SCFA boli spojené s plazmatickými hladinami GLP-1 u ľudí a myší.52 Naše súčasné údaje ukazujú, že po liečbe BLG sa hladiny GLP-1 v sére a expresia mRNA Gcg významne zvýšili. Podobne sa sekrécia GLP-1 významne zvýšila v kultúrach hrubého čreva po stimulácii fekálnymi extraktmi z myší s kolitídou liečených BLG v porovnaní so stimuláciou fekálnymi extraktmi z myší s kolitídou liečených DSS. Ako SCFA ovplyvňujú uvoľňovanie GLP-1?Gwen Tolhurst a kol. uviedli, že SCFA môžu stimulovať sekréciu GLP-1 prostredníctvom GRP43 a GPR41.29 Naše súčasné údaje tiež ukazujú, že liečba BLG významne zvyšuje expresiu mRNA GRP43 a GPR41 v hrubom čreve myší liečených DSS. Tieto údaje naznačujú, že liečba BLG môže obnoviť produkciu GLP-1 podporovanú SCFA aktiváciou GRP43 a GPR41.
BLG je dlhodobo voľne predajný (OTC) liek v Číne. Maximálna tolerovaná dávka BLG u myší z kmeňa Kunming je 80 g/kg a nebola pozorovaná žiadna akútna toxicita.53 V súčasnosti je odporúčaná dávka BLG (bez cukru) u ľudí 9 – 15 g/deň (3-krát denne). Naša štúdia ukázala, že BLG v dávke 1 g/kg zmiernil chronickú recidivujúcu kolitídu vyvolanú DSS u myší. Táto dávka sa blíži dávke BLG používanej klinicky. Naša štúdia tiež zistila, že jeho mechanizmus účinku je sprostredkovaný, aspoň čiastočne, zmenami v črevnej mikrobiote, konkrétne baktériami produkujúcimi SCFA, ako sú Akkermansia a Prevotellaceae_UCG-001, s cieľom obnoviť produkciu GLP-1 z čriev. Tieto zistenia naznačujú, že BLG si zaslúži ďalšie zváženie ako potenciálny terapeutický prostriedok na liečbu klinickej kolitídy. Presný mechanizmus, ktorým moduluje črevnú mikrobiotu, však ešte len treba potvrdiť pomocou myší s deficitom mikrobioty a transplantáciou fekálnych baktérií.
Ace, kyselina octová; but, kyselina maslová; BLG, pandán; DSS, dextránsulfát sodný; DAI, index aktivity ochorenia; DPP, dipeptidylpeptidáza; FID, plameňový ionizačný detektor; F-Con, kontrola; Extrakty stolice myší; F-DSS, extrakty stolice myší s kolitídou DSS; F-BLG, extrakty stolice myší s kolitídou liečených BLG; GLP-1, glukagónu podobný peptid-1; Gcg, glukagón; plynová chromatografia, plynová chromatografia; GRP43, receptor spriahnutý s G proteínom 43; GRP41, receptor spriahnutý s G proteínom 41; H&E, hematoxylín-eozín; HBSS, Hanksov vyvážený soľný roztok; OTC, OTC; PCA, analýza hlavných komponentov; PCoA, analýza hlavných súradníc; Pro, kyselina propiónová; SASP, sulfasalazín; SCFA, mastné kyseliny s krátkym reťazcom; čínska medicína, tradičná čínska medicína; UC, ulcerózna kolitída.
Všetky experimentálne protokoly boli schválené Etickou komisiou pre zvieratá Pekinskej univerzity Shenzhen-Hongkonskej univerzity vedy a techniky (Shenzhen, Čína) v súlade s Inštitucionálnymi smernicami a predpismi o zvieratách (etické číslo A2020157).
Všetci autori významne prispeli ku koncepcii a dizajnu, získavaniu údajov alebo analýze a interpretácii údajov; podieľali sa na písaní článku alebo kritickej revízii dôležitého intelektuálneho obsahu; súhlasili s odoslaním rukopisu do aktuálneho časopisu; nakoniec schválili verziu na publikovanie; boli zodpovední za všetky aspekty práce.
Túto prácu podporila Národná nadácia pre prírodné vedy Číny (81560676 a 81660479), prvotriedny projekt Univerzity v Shenzhene (86000000210), Fond výboru pre inovácie v oblasti vedy a techniky v Shenzhene (JCYJ20210324093810026) a Fond pre výskum v oblasti medicínskych vied a technológií provincie Guangdong (A2020157 a A2020272), Farmaceutický fond Lekárskej univerzity v Guizhou, financovaný spoločnosťou Key Laboratory (YWZJ2020-01) a Nemocnica Pekinskej univerzity v Shenzhene (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B a kol. Terapeutický potenciál triptolidu ako protizápalového činidla pri experimentálnej kolitíde vyvolanej dextránsulfátom sodným u myší. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Globálna záťaž IBD: od roku 2015 do roku 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue a kol. Rastlinné alkaloidy: sľubné modifikátory ochorenia pri zápalových ochoreniach čriev. Prepharmacology. 2019; 10: 351. doi: 10. 3389/fphar. 2019. 00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B a kol. Indigo Naturalis inhibuje oxidačný stres hrubého čreva a reakcie Th1/Th17 pri kolitíde vyvolanej DSS u myší. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019: 9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Účinnosť a bezpečnosť čínskej bylinnej medicíny Sophora flavescens (Sophora flavescens) pri liečbe ulceróznej kolitídy: klinické dôkazy a potenciálne mechanizmy. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Prírodné produkty: experimentálne účinné lieky na liečbu zápalového ochorenia čriev. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Úvahy o adjuvantnej liečbe ulceróznej kolitídy tradičnou čínskou medicínou. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT a kol. Účinnosť a bezpečnosť granúl Banlangen pri liečbe sezónnej chrípky: protokol štúdie pre randomizovanú kontrolovanú štúdiu. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x