Triedenie proteínov v sekrečnej dráhe je nevyhnutné pre udržanie kompartmentalizácie buniek a homeostázy. Okrem triedenia sprostredkovaného škrupinou je úloha lipidov v triedení kinezínom v procese sekrečného transportu dlhodobou základnou otázkou, ktorá ešte nebola zodpovedaná. V tejto štúdii vykonávame 3D simultánne viacfarebné zobrazovanie v reálnom čase s vysokým rozlíšením, aby sme in vivo dokázali, že novo syntetizované proteíny imobilizované glykozylfosfatidylinozitolom s veľmi dlhými ceramidovými lipidovými skupinami sú zhlukované a klasifikované do špecializovaných výstupných miest endoplazmatickej siete, ktoré sa líšia od miest používaných transmembránovými proteínmi. Okrem toho ukazujeme, že dĺžka reťazca ceramidu v membráne endoplazmatického retikula je kritická pre túto selektivitu triedenia. Naša štúdia poskytuje prvý priamy dôkaz in vivo na klasifikáciu proteínového nákladu na základe dĺžky lipidového reťazca do selektívnych exportných miest v sekrečnej dráhe.
V eukaryotických bunkách sú proteíny syntetizované v endoplazmatickom retikule (ER) počas transportu sekrečnou dráhou triedené, aby sa dostali do príslušného bunkového cieľa (1). Okrem triedenia sprostredkovaného plášťom sa dlho špekulovalo, že určité lipidy môžu slúžiť aj ako selektívne výstupné body tým, že sa zhlukujú do špecifických membránových domén, ktoré tvoria špecifické proteíny (2-5). Stále však chýbajú priame dôkazy in vivo, ktoré by preukázali tento možný mechanizmus založený na lipidoch. Aby sme tento základný problém vyriešili, študovali sme na kvasinkách, ako sú proteíny ukotvené glykozylfosfatidylinozitolom (GPI) (GPI-AP) diferencovane exportované z ER. GPI-AP sú rôzne povrchové proteíny buniek spojené s lipidmi (6, 7). GPI-AP je sekretovaný proteín pripojený k vonkajším cípom plazmatickej membrány prostredníctvom glykolipidovej časti (kotva GPI). Akceptujú kotvy GPI ako konzervatívne posttranslačné modifikácie v lúmene ER (8). Po pripojení prechádza GPI-AP cez Golgiho aparát (5, 9) z ER do plazmatickej membrány. Prítomnosť GPI kotiev spôsobuje, že GPI-AP je transportovaný oddelene od transmembránovo sekretovaných proteínov (vrátane iných proteínov plazmatickej membrány) pozdĺž sekrečnej dráhy (5, 9, 10). V kvasinkových bunkách sú GPI-AP oddelené od ostatných sekretovaných proteínov v endoplazmatickom retikule a potom zabalené do jedinečných vezikúl obalených komplexom obalových proteínov II (COPII) (6, 7). Determinanty tohto klasifikačného procesu v procese exportu ER nie sú jasné, ale predpokladá sa, že tento mechanizmus môže vyžadovať lipidy, najmä štrukturálna remodelácia lipidovej časti GPI kotvy (5, 8). V kvasinkách začína lipidová remodelácia GPI bezprostredne po pripojení GPI a v mnohých prípadoch spôsobuje väzbu ceramidu na 26-uhlíkovú nasýtenú mastnú kyselinu s dlhým reťazcom (C26:0) (11, 12). Ceramid C26 je doteraz hlavným ceramidom produkovaným kvasinkovými bunkami. Syntetizuje sa v ER a väčšina z neho sa exportuje do Golgiho aparátu cez vezikuly COPII (13). Export GPI-AP z ER si vyžaduje prebiehajúcu syntézu ceramidu (14, 15) a následne premena ceramidu na inozitolfosfátový ceramid (IPC) v Golgiho aparáte závisí od syntézy kotvy GPI (16). Biofyzikálne štúdie s umelými membránami ukázali, že ceramidy s veľmi dlhým acylovým reťazcom sa môžu spájať a tvoriť usporiadané domény s jedinečnými fyzikálnymi vlastnosťami (17, 18). Tieto údaje vedú k hypotéze, že ceramid C26 a GPI-AP s ceramidom C26 využívajú svoje fyzikálne vlastnosti na spájanie sa do usporiadaných oblastí alebo oblastí v relatívne neusporiadanom lipidovom prostredí membrány ER. Skladá sa prevažne z krátkych a nenasýtených glycerolipidov (C16:1 a C18:1) (19, 20). Tieto oblasti budú selektívne zamerané na špecifické výstupné miesta ER (ERES), kde môžu byť ceramid a GPI-AP na báze ceramidu spoločne transportované do Golgiho aparátu v tom istom vyhradenom vezikule COPII (5).
V tejto štúdii sme priamo testovali tento mechanizmus založený na lipidoch pomocou super-rozlišovacej konfokálnej zobrazovacej mikroskopie v reálnom čase (SCLIM), čo je špičková mikroskopická technika, ktorá dokáže súčasne pozorovať fluorescenčne značené proteíny. Trojfarebné a trojrozmerné (3D) obrazy majú v živých bunkách extrémne vysoké rozlíšenie a rýchlosť (21, 22).
Najprv sme použili technológiu SCLIM, aby sme ďalej definovali, ako bol normálny GPI-AP s ceramidovou skupinou C26 skrínovaný z transmembránovo sekretovaných proteínov po opustení ER u S. cerevisiae. Na overenie klasifikácie ER sme použili genetický systém, ktorý dokáže priamo vizualizovať novo syntetizovaný náklad vstupujúci do ERES in vivo (7, 23). Ako náklad sme zvolili GPI-AP Gas1 na báze ceramidu C26 značený zeleným fluorescenčným proteínom (GFP) a transmembránovo sekretovaný proteín Mid2 značený blízkym infračerveným fluorescenčným proteínom (iRFP), pričom oba cielia na plazmatickú membránu (24–26). V teplotne citlivom mutante sec31-1 sú tieto dva náklady exprimované pod galaktózou indukovateľným promótorom a konštitutívnym markerom ERES. Pri extrémnej teplote (37 °C), pretože mutácia sec31-1 ovplyvňuje funkciu zložky obalu COPII Sec31 inhibovať klíčenie COPII a export ER, novo syntetizovaný náklad sa akumuluje v ER (23). Po ochladení na nízku teplotu (24 °C) sa mutantné bunky sec31-1 zotavili zo sekrečnej oblasti a nahromadený nový syntetický náklad sa začal exportovať z ER. Vizualizácia CLIM ukázala, že väčšina novo syntetizovaných Gas1-GFP a Mid2-iRFP sa stále akumulovala v ER mutantných buniek sec31-1 po inkubácii pri 37 °C a potom sa uvoľňovala pri 24 °C počas 5 minút (obrázok 1). Keďže Mid2-iRFP je distribuovaný po celej membráne ER a Gas1-GFP je koncentrovaný a zhromažďovaný v nespojitej oblasti membrány ER, ich distribúcia je úplne odlišná (obrázok 1, A až C a film S1). Okrem toho, ako je znázornené na obrázku 1D, klaster Gas1-GFP nemá Mid2-iRFP. Tieto výsledky naznačujú, že GPI-AP a transmembránové proteíny boli v skorom štádiu oddelené do rôznych oblastí membrány ER. Klaster Gas1-GFP susedí so špecifickým ERES značeným plášťovým proteínom mCherry COPII Sec13 (obrázok 1, E a F a film S1) (23).
Bunky sec31-1 exprimujú galaktózou indukované sekréty, dlhý acylový reťazec (C26) ceramidu GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zelená) a transmembránový proteín Mid2-iRFP (TMP, modrá) a toto konštruktívne ERES značenie Sec13-mCherry (ERES, purpurová) bolo inkubované pri teplote 37 °C počas 30 minút, presunuté na 24 °C a zobrazené pomocou SCLIM o 5 minút neskôr. (A až C) zobrazuje reprezentatívny zlúčený alebo jeden 2D obraz roviny (A), 2D projekčný obraz 10 Z-rezov (B) alebo 3D obraz bunkovej hemisféry nákladu a ERES markerov (C). Mierka 1 μm (A a B). Jednotka mierky je 0,551 μm (C). Gas1-GFP bol detegovaný v diskrétnych oblastiach alebo zhlukoch ER, zatiaľ čo Mid2-iRFP bol detegovaný a distribuovaný po celej membráne ER (C). (D) Graf zobrazuje relatívnu intenzitu fluorescencie Gas1-GFP a Mid2-iRFP v klastri Gas1-GFP pozdĺž bielej šípky (vľavo). AU, ľubovoľná jednotka. (E a ​​F) predstavujú 3D obraz, ktorý kombinuje značku goods a ERES. Klastre Gas1-GFP boli detegované v blízkosti špecifického ERES. Jednotka mierky je 0,551 μm. (F) Biela plná šípka označuje klaster Gas1-GFP spojený s ERES. Stredný a pravý panel zobrazujú zlúčený zväčšený 3D obraz a otočený pohľad na vybraný klaster Gas1-GFP.
Úzky priestorový vzťah medzi klastrom Gas1-GFP a špecifickým ERES naznačuje, že Gas1-GFP môže vstúpiť do selektívneho ERES, čo sa líši od selektivity, ktorú Mid2-iRFP používa na opustenie ER. Aby sme túto možnosť riešili, kvantifikovali sme pomer ERES iba pre jeden alebo dva tovary (obrázok 2, A až C). Zistili sme, že väčšina ERES (70 %) obsahuje iba jeden typ nákladu. Spodný obrázok na obrázku 2C zobrazuje dva typické príklady ERES iba s Gas1-GFP (obrázok 1) alebo iba s Mid2-iRFP (obrázok 2). Naproti tomu približne 20 % ERES obsahuje dva náklady, ktoré sa prekrývajú v tej istej oblasti. Zistilo sa, že niektoré ERES (10 %) obsahovali dva typy nákladu, ale boli izolované v jasne odlišných oblastiach. Preto táto štatistická analýza ukazuje, že po exporte ER sú GPI-AP Gas1-GFP a transmembránový náklad Mid2-iRFP rozdelené do rôznych ERES (obrázok 2D). Táto účinnosť triedenia je veľmi konzistentná s predchádzajúcou biochemickou analýzou (6) a morfologickým určením (7). Môžeme tiež pozorovať správanie karanténneho nákladu vstupujúceho do ERES (obrázok 2E a film S2). Obrázok 2E ukazuje, že iba malá časť Gas1-GFP (panel 3) alebo Mid2-iRFP (panel 4) vstupuje do ERES z jednej strany a je obmedzená v samostatnej oblasti. Panel 5 na obrázku 2E ukazuje, že Gas1-GFP a Mid2-iRFP sa niekedy nachádzajú v tom istom ERES, ale vstupujú z rôznych strán a sú koncentrované v samostatných oblastiach, ktoré môžu predstavovať rôzne vezikuly COPII. Taktiež sme potvrdili, že pozorovaná separácia a klasifikácia Gas1 na báze ceramidu C26 GPI-AP ako selektívneho ERES je špecifická, pretože iný transmembránový sekrečný náklad, proteín plazmatickej membrány Axl2 (27) označený GFP, vykazuje podobné správanie ako Mid2-iRFP. (obrázok S1 a film S3). Novo syntetizovaný Axl2-GFP je distribuovaný cez membránu ER podobne ako Mid2-iRFP (obrázok S1, A a B) a je ko-lokalizovaný s Mid2-iRFP vo väčšine ERES (obrázok S1, B až D). Panely 1 a 2 na obrázku 1. S1C zobrazuje dva typické príklady ERES, kde sa dva transmembránové nákladné látky prekrývajú. V týchto prípadoch oba nákladné látky vstupujú do ERES spoločne (obrázok S1E, panel 3 a film S3).
Bunky sec31-1 exprimujúce galaktózou indukovateľné sekréty, Gas1-GFP (GPI-AP, zelená) a Mid2-iRFP (TMP, modrá) a konštitutívne ERES značenie Sec13-mCherry (ERES, purpurová) boli umiestnené do teploty 37 °C. Po 30 minútach inkubácie pri teplote 24 °C boli teploty premiestnené na 24 °C, aby sa uvoľnil sekrečný blok, a po 20 minútach boli snímky vykonané pomocou SCLIM. (A až C) Reprezentatívne 2D projekčné snímky (A; mierka, 1 μm) alebo 3D snímky bunkových hemisfér (B a C; jednotka mierky, 0,456 μm) nákladu a 10 Z-rezov označených ERES. Dolný panel v (B) a panel v (C) zobrazujú spracované snímky na zobrazenie iba tovaru prítomného v ERES (purpurová) [Gas1-GFP (sivá) a Mid2-iRFP (svetlomodrá)]. (C) Otvorená šípka: ERES nesie iba jeden kus nákladu (1 až 4). Sivá šípka: ERES obsahuje segregovaný náklad (5). Biela plná šípka: ERES obsahujúci ko-lokalizovaný náklad. Nižšie: Vybraný jeden ERES obsahuje iba Gas1-GFP (1) alebo Mid2-iRFP (2). Mierka, 100 nm. (D) Kvantifikácia mikrofotografie opísanej v (C). Priemerné percento ERES, ktoré obsahuje iba jeden náklad (Gas1-GFP alebo Mid2-iRFP), segregovaný náklad a prekrývajúci sa náklad. V troch nezávislých experimentoch, n=432 v 54 bunkách. Chybová úsečka = SD. Obojstranný nepárový t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D obraz vybraných ERES karanténneho nákladu označených (C). Gas1-GFP (zelená) (3) alebo Mid2-iRFP (modrá) (4) vstupuje do ERES (purpurová) z jednej strany a je obmedzený na malú oblasť v rámci ERES. Niekedy oba typy nákladu vstupujú do toho istého ERES (5) z tej istej strany a sú obmedzené na izolovanú oblasť v rámci ERES. Mierka, 100 nm.
Ďalej sme testovali hypotézu, že dlhý acylový reťazec ceramidu (C26) prítomný v membráne ER riadi špecifické zhlukovanie a triedenie Gas1 do selektívnych ERES. Na tento účel sme použili modifikovaný kvasinkový kmeň GhLag1, v ktorom boli dve endogénne ceramidové syntázy Lag1 a Lac1 nahradené GhLag1 (homológom Lag1 bavlny), čo viedlo ku kvasinkovému kmeňu s bunkovou membránou ceramidu kratšou ako u divokého typu (obrázok 3A) (28). Analýza hmotnostnou spektrometriou (MS) ukázala, že v kmeňoch divokého typu je 95 % celkového ceramidu ceramid s veľmi dlhým (C26) reťazcom, zatiaľ čo v GhLag1 je 85 % ceramidu veľmi dlhých (C18 a C16) ceramidov, iba 2 % ceramidu je ceramid s veľmi dlhým (C26) reťazcom. Hoci ceramidy C18 a C16 sú doteraz hlavnými ceramidmi detegovanými v membráne GhLag1, MS analýza tiež potvrdila, že GPI kotva Gas1-GFP exprimovaná v kmeni GhLag1 obsahuje ceramid C26, ktorý je porovnateľný s lipidmi divokého typu. Kvalita je rovnaká (Obr. 3A) (26). To znamená, že enzým Cwh43 remodelujúci ceramid je vysoko selektívny pre ceramid C26, ako je znázornené na Obrázku 26, prednostne začleňuje kotvu GPI z malého množstva ceramidu C26 v kmeni GhLag1. S2 (29). Napriek tomu bunková membrána GhLag1 v podstate obsahuje iba ceramid C18-C16, zatiaľ čo Gas1-GFP stále obsahuje ceramid C26. Táto skutočnosť robí z tohto kmeňa ideálny nástroj na špecifické riešenie problému dĺžky acylového reťazca membránového ceramidu v ER. Hypotetická úloha triedy a triedenia. Následne sme najprv skúmali schopnosť C26 Gas1-GFP akumulovať sa v zhlukoch v GhLag1 s teplotne citlivou mutantnou alelou sec31-1 pomocou konvenčnej fluorescenčnej mikroskopie, kde v ceramidovej membráne ER existuje iba dlhý reťazec (C18-C16) (Obr. 3). Zistili sme, že v sec31-1 bola väčšina Gas1-GFP koncentrovaná v zhlukoch, zatiaľ čo Gas1-GFP v sec31-1 GhLag1 s dlhou ceramidovou membránou (C18-C16) ER nebol prevažne zhlukovaný a distribuovaný v celej membráne ER. Presnejšie povedané, keďže zhlukovanie na báze ceramidu C26 úzko súvisí so špecifickým ERES (Obrázok 1), ďalej sme skúmali, či tento proces môže zahŕňať aj funkciu mechanizmu exportného proteínu ER. GPI-AP používa špeciálny systém COPII pre export ER, ktorý je aktívne regulovaný štrukturálnou remodeláciou glykánovej časti kotvy GPI proteínom Ted1 (30, 31). Rekombinantný GPI-glykán je potom rozpoznávaný transmembránovým komplexom cargo receptora p24, ktorý následne selektívne regrutuje Lst1, čo je špecifická izoforma hlavnej podjednotky Sec24 viažucej cargo gén COPII, čím vzniká vezikuly COPII bohaté na GPI-AP (31-33). Preto sme skonštruovali dvojitý mutant, ktorý kombinoval deléciu týchto jednotlivých proteínov (zložka komplexu p24 Emp24, enzým Ted1 remodelujúci GPI-glykán a špecifická podjednotka Lst1 COPII) s mutantným kmeňom sec31-1 a študovali sme ich. Je možné vytvoriť Gas1-klaster GFP (Obrázok 3). Zistili sme, že v sec31-1emp24Δ a sec31-1ted1Δ je Gas1-GFP prevažne neklastrovaný a distribuovaný po celej membráne ER, ako bolo predtým pozorované v sec31-1 GhLag1, zatiaľ čo v sec31-1lst1Δ je Gas1-GFP podobný sec31-1. Tieto výsledky naznačujú, že okrem prítomnosti ceramidu C26 v membráne ER sa zhlukovanie Gas1-GFP musí viazať aj na komplex p24 a nevyžaduje špecifický nábor Lst1. Následne sme skúmali možnosť, že dĺžka reťazca ceramidu v membráne ER môže regulovať väzbu Gas1-GFP na p24. Zistili sme však, že prítomnosť ceramidu C18-C16 v membráne neovplyvňuje GPI-glykány rekonštruované komplexom p24 (obrázky S3 a S4, A a B) ani väzbu na GPI-AP a schopnosť exportu GPI-AP. Nábor podtypu COPII Lst1 (obrázok S4C). Preto zhlukovanie závislé od ceramidu C26 nevyžaduje interakcie proteínov s rôznymi mechanizmami exportu proteínov ER, ale podporuje alternatívny mechanizmus triedenia riadený dĺžkou lipidov. Následne sme analyzovali, či je dĺžka acylového reťazca ceramidu v membráne ER dôležitá pre účinnú klasifikáciu Gas1-GFP ako selektívneho ERES. Keďže Gas1 v kmeni GhLag1 s krátkym reťazcom ceramidu opúšťa ER a vstupuje do plazmatickej membrány (obrázok S5), predpokladáme, že ak je triedenie riadené dĺžkou acylového reťazca ceramidu, Gas1 v kmeni GhLag1 môže byť presmerovaný a krížený. ERES tovary s rovnakou membránou.
(A) Bunková membrána GhLag1 obsahuje prevažne kratšie ceramidy C18-C16, zatiaľ čo GPI kotva Gas1-GFP má stále rovnakú C26 IPC ako bunky divokého typu. Hore: Analýza dĺžky acylového reťazca ceramidu v bunkovej membráne kmeňov divokého typu (Wt) a GhLag1p pomocou hmotnostnej spektrometrie (MS). Údaje predstavujú percento celkového ceramidu. Priemer z troch nezávislých experimentov. Chybová úsečka = SD. Dvojstranný nepárový t-test. **** P <0,0001. Spodný panel: MS analýza dĺžky acylového reťazca IPC prítomného v GPI kotve Gas1-GFP (GPI-IPC) exprimovanej v kmeňoch divokého typu a GhLag1p. Údaje predstavujú percento celkového signálu IPC. Priemer z piatich nezávislých experimentov. Chybová úsečka = SD. Dvojstranný nepárový t-test. ns, nie je dôležité. P = 0,9134. (B) Fluorescenčné mikrofotografie buniek sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ a sec31-1lst1Δ exprimujúcich galaktózou indukovaný Gas1-GFP boli inkubované pri teplote 37 °C počas 30 minút a následne boli prenesené na rutinnú fluorescenčnú mikroskopiu po teplote 24 °C. Biela šípka: Klaster ER Gas1-GFP. Otvorená šípka: Neklastrovaný Gas1-GFP je distribuovaný na celej membráne ER, čo ukazuje charakteristické farbenie jadrového kruhu ER. Mierka, 5 μm. (C) Kvantifikácia mikrofotografie opísanej v (B). Priemerné percento buniek s bodkovanou štruktúrou Gas1-GFP. V troch nezávislých experimentoch, n ≥ 300 buniek. Chybová úsečka = SD. Obojstranný nepárový t-test. **** P < 0,0001.
Aby sme tento problém priamo vyriešili, vykonali sme SCLIM vizualizáciu Gas1-GFP a Mid2-iRFP v GhLag1 s teplotne citlivou mutantnou alelou sec31-1 (obrázok 4 a video S4). Po udržaní ER pri teplote 37 °C a následnom uvoľnení pri 24 °C sa väčšina novo syntetizovaného Gas1-GFP nezhlukovala a nedistribuovala v celej membráne ER, ako bolo pozorované konvenčnými mikroskopmi (obrázok 4, A a B). Okrem toho veľké percento ERES (67 %) obsahuje dva typy nákladu, ktoré sa v ňom nachádzajú spoločne (obrázok 4D). Panely 1 a 2 na obrázku 4C zobrazujú dva typické príklady ERES s prekrývajúcimi sa Gas1-GFP a Mid2-GFP. Okrem toho boli oba tovary zaradené do toho istého ERES (obrázok 4E, panel 3 a video S4). Naše výsledky preto naznačujú, že dĺžka acylového reťazca ceramidu v membráne ER je dôležitým determinantom agregácie a klasifikácie proteínov ER.
Bunky Sec31-1 GhLag1 exprimujúce galaktózou indukované sekréty, Gas1-GFP (GPI-AP, zelená) a Mid2-iRFP (TMP, modrá) a konštitutívny ERES-značený Sec13-mCherry (ERES, purpurová) Inkubujte pri teplote 37 °C. Pokračujte 30 minút, potom znížte teplotu na 24 °C, aby sa uvoľnili sekréty, a po 20 minútach nasnímajte pomocou SCLIM. (A až C) Reprezentatívne 2D projekčné snímky (A; mierka, 1 μm) alebo 3D snímky bunkových hemisfér (B a C; jednotka mierky, 0,45 μm) 10 Z-rezov označených nákladom a ERES. Dolný panel v (B) a panel v (C) zobrazujú spracované snímky, aby sa zobrazili iba položky prítomné v ERES (purpurová) [Gas1-GFP (sivá) a Mid2-iRFP (svetlomodrá)]. (C) Biela vyplnená šípka: ERES, položky sa prekrývajú. Otvorená šípka: ERES obsahuje iba jednu položku. Dolný panel: Vybraný ERES má prekrývajúce sa tovary (1 a 2) označené v (C). Mierka, 100 nm. (D) Kvantifikácia mikrofotografie opísanej v (C). V jednotkách sec31-1 a sec31-1 GhLag1 je zahrnutý iba jeden náklad (Gas1-GFP alebo Mid2-iRFP) a priemerné percento ERES pre izolovaný náklad a prekrývajúci sa náklad. V troch nezávislých experimentoch bolo n = 432 v 54 bunkách (sec31-1) a n = 430 v 47 bunkách (sec31-1 GhLag1). Chybová úsečka = SD. Obojstranný nepárový t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) a ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D obraz vybraného ERES s prekrývajúcim sa nákladom (3) označeným v (C). Gas1-GFP (zelená) a Mid2-iRFP (modrá) sa približujú k ERES (purpurová) z rovnakej strany a zostávajú v rovnakej obmedzenej oblasti ERES. Mierka, 100 nm.
Táto štúdia poskytuje priamy in vivo dôkaz o tom, že lipidové proteínové nákladné látky sú klasifikované do selektívnych exportných miest v sekrečnej dráhe a odhaľuje dôležitosť dĺžky acylového reťazca pre selektivitu klasifikácie. Pomocou výkonnej a špičkovej mikroskopickej techniky nazývanej SCLIM sme demonštrovali novo syntetizovaný Gas1-GFP (hlavný GPI-AP plazmatickej membrány s veľmi dlhou acylovou reťazcovou (C26) ceramidovou lipidovou časťou) v kvasinkách. Oblasti zoskupené v diskrétnych ER sú spojené so špecifickými ERES, zatiaľ čo transmembránovo sekretované proteíny sú distribuované po celej membráne ER (Obrázok 1). Okrem toho tieto dva typy tovarov selektívne vstupujú do rôznych ERES (Obrázok 2). Dĺžka acylového reťazca bunkového ceramidu v membráne sa skráti z C26 na C18-C16, klaster Gas1-GFP sa naruší do diskrétnej oblasti ER a Gas1-GFP sa presmeruje tak, aby opustil ER s transmembránovým proteínom cez ten istý ERES (Obrázok 3 a Obrázok 3). 4).
Hoci GPI-AP využíva špecializovaný proteínový mechanizmus na výstup z ER, zistili sme, že separácia závislá od ceramidu C26 sa nespolieha na diferenciálne proteínové interakcie, ktoré by mohli viesť k špecializácii ERES (obrázky S4 a S5). Naše zistenia namiesto toho podporujú alternatívny klasifikačný mechanizmus riadený zhlukovaním proteínov na báze lipidov a následným vylúčením iných nákladov. Naše pozorovania naznačujú, že oblasť Gas1-GFP alebo klaster spojený so špecifickým ERES neobsahuje transmembránovo sekretovaný proteín Mid2-iRFP, čo naznačuje, že klaster GPI-AP závislý od ceramidu C26 uľahčí ich vstup do príslušného ERES a zároveň vylúči transmembránové sekréty vstupujúce do tohto konkrétneho ERES (obrázky 1 a 2). Naproti tomu prítomnosť ceramidov C18-C16 v membráne ER nespôsobuje tvorbu oblastí alebo zhlukov GPI-AP, takže nevylučujú ani nenahrádzajú transmembránovo sekretované proteíny v tom istom ERES (obrázky 3 a 4). Preto navrhujeme, že ceramid C26 riadi separáciu a klasifikáciu uľahčením zhlukovania proteínov spojených so špecifickými ERES.
Ako dosiahnuť toto zhlukovanie závislé od ceramidu C26 do špecifickej oblasti ER? Tendencia membránového ceramidu oddeľovať sa laterálne môže spôsobiť, že GPI-AP a ceramid C26 tvoria malé a okamžite usporiadané lipidy v nepravidelnejšom lipidovom prostredí membrány ER, ktoré obsahuje kratšie a nenasýtené glycerolipidy. Kvalitné zhluky (17, 18). Tieto malé dočasné zhluky sa môžu po naviazaní na komplex p24 ďalej fúzovať do väčších a stabilnejších zhlukov (34). V súlade s tým sme ukázali, že C26 Gas1-GFP musí interagovať s komplexom p24, aby vytvoril väčšie viditeľné zhluky (obrázok 3). Komplex p24 je heterozygotný oligomér zložený zo štyroch rôznych transmembránových proteínov p24 v kvasinkách (35), ktorý zabezpečuje multivalentnú väzbu, ktorá môže viesť k zosieťovaniu malých zhlukov GPI-AP, čím sa vytvára väčší stabilný zhluk (34). Interakcia medzi proteínovými ektodoménami GPI-AP môže tiež prispievať k ich agregácii, ako je ukázané počas ich Golgiho transportu v polarizovaných epitelových bunkách cicavcov (36). Avšak, keď je v membráne ER prítomný ceramid C18-C16 a komplex p24 sa viaže na Gas1-GFP, netvoria sa veľké samostatné zhluky. Základný mechanizmus môže závisieť od špecifických fyzikálnych a chemických vlastností ceramidu s dlhým acylovým reťazcom. Biofyzikálne štúdie umelých membrán ukazujú, že hoci ceramidy s dlhým (C24) aj krátkym (C18-C16) acylovým reťazcom môžu spôsobiť fázovú separáciu, iba ceramidy s dlhým acylovým reťazcom (C24) môžu podporovať vysoké zakrivenie a ohýbanie filmu, aby sa film zmenil. Vzájomnou referenciou (17, 37, 38) sa ukázalo, že transmembránová špirála TMED2, ľudského homológu Emp24, selektívne interaguje so sfingomyelínom na báze ceramidu C18 v cytoplazmatických lalokoch (39). Pomocou molekulárno-dynamických (MD) simulácií sme zistili, že ceramidy C18 aj C26 sa akumulujú okolo cytoplazmatických lalokov transmembránovej špirály Emp24 a majú podobné preferencie (obrázok S6). Stojí za zmienku, že to naznačuje, že transmembránová špirála Emp24 môže viesť k asymetrickému rozloženiu lipidov v membráne. Ide o nedávny výsledok založený na cicavčích bunkách. Podobné MD simulácie tiež ukazujú prítomnosť éterových lipidov (40). Preto predpokladáme, že ceramid C26 v dvoch lalokoch ER26 je lokálne obohatený. Keď sa GPI-AP v luminálnych lalokoch priamo viaže na multivalentný p24 a dochádza k akumulácii ceramidu C26 okolo p24 v cytoplazmatických lalokoch, môže to podporiť sprievodnú agregáciu proteínov a zakrivenie membrány, ktoré sa vytvára prostredníctvom prstov (41), čo spôsobuje oddelenie GPI-AP do diskrétnych oblastí susediacich s ERES, čo tiež uprednostňuje vysoko zakrivené oblasti membrány ER (42). Predchádzajúce správy podporili navrhovaný mechanizmus (43, 44). Multivalentná väzba oligolektínov, patogénov alebo protilátok na glykosfingolipidy na báze ceramidu (GSL) na plazmatickej membráne spúšťa rozsiahlu agregáciu GSL, zvyšuje fázovú separáciu a spôsobuje deformáciu a internalizáciu membrány (44). Iwabuchi a ďalší (43). Zistilo sa, že v prítomnosti dlhých (C24), ale nie krátkych (C16) acylových reťazcov, multivalentný ligand viazaný na laktozylceramid GSL indukoval tvorbu veľkých zhlukov a invagináciu membrány a cytoplazmatická Lyn-sprostredkovaná signálna transdukcia na cípľach je prepojená acylovými reťazcami v spojených neutrofiloch.
V cicavčích polarizovaných epitelových bunkách riadi koncentrácia anti-Golgiho siete (TGN) na úrovni apikálnej plazmatickej membrány separáciu a triedenie GPI-AP (10, 45). Táto agregácia je riadená oligomerizáciou GPI-AP (36), ale môže tiež závisieť od dĺžky ceramidového reťazca, ktorú nachádzame v kvasinkách. Hoci cicavčí GPI-AP má kotvu na báze éterového lipidu a jeho chemická štruktúra sa veľmi líši od ceramidu s veľmi dlhým acylovým reťazcom, nedávna štúdia zistila, že oba lipidy majú evolučne podobné fyzikálne a chemické vlastnosti a funkciu (40). Preto môže byť éterová lipidová časť v cicavčích bunkách podobná ceramidu C26 v kvasinkách a jej úlohou je spojiť sa s ceramidom s dlhým reťazcom v membráne, aby podporila agregáciu a triedenie GPI-AP. Hoci túto možnosť je ešte potrebné priamo otestovať, predchádzajúce zistenia podporujú, že transport ceramidu s dlhým acylovým reťazcom do Golgiho telieska sa neuskutočňuje cytoplazmatickými transferovými proteínmi, ale závisí od syntézy GPI kotiev ako v kvasinkách. Zdá sa teda, že evolučný konzervatívny mechanizmus je schopný selektívne kotransportovať ceramid s veľmi dlhým acylovým reťazcom a GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) v tom istom transportnom vezikule.
V kvasinkových a cicavčích polarizovaných epitelových bunkových systémoch dochádza k agregácii a separácii GPI-AP od ostatných proteínov plazmatickej membrány ešte pred dosiahnutím povrchu bunky. Paladino a kol. (48) zistili, že na TGN cicavčích polarizovaných epitelových buniek je zhlukovanie GPI-AP nevyhnutné nielen pre selektívnu klasifikáciu GPI-AP na apikálnu plazmatickú membránu, ale tiež reguluje organizáciu zhlukovania GPI-AP a ich biologickú aktivitu. Bunkový povrch. V kvasinkách táto štúdia ukázala, že klaster GPI-AP závislý od ceramidu C26 na ER môže regulovať organizáciu zhlukov a funkčnú aktivitu GPI-AP na plazmatickej membráne (24, 49). V súlade s týmto modelom sú bunky GhLag1 alergické na inhibítory GPI alebo lieky, ktoré ovplyvňujú integritu bunkovej steny (28), a potreba funkčných zhlukov Gas1-GFP (49) hrotového ceramidu premietaného pri párení kvasinkových buniek naznačuje možné fyziologické dôsledky buniek hLag1. Chyba GPI-AP. Ďalšie testovanie, či bola funkčná organizácia bunkového povrchu naprogramovaná z ER metódou triedenia založenou na dĺžke lipidov, však bude predmetom nášho budúceho výskumu.
Kmene Saccharomyces cerevisiae použité v tejto práci sú uvedené v tabuľke S1. Kmene MMY1583 a MMY1635 génu SCLIM pre zobrazovanie živých buniek boli skonštruované na pozadí W303. Tieto kmene exprimujúce Sec13-mCherry s fluorescenčnou proteínovou značkou boli skonštruované pomocou metódy založenej na polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) s plazmidom pFA6a ako templátom (23). Kmeň exprimujúci Mid2-iRFP značený fluorescenčným proteínom pod kontrolou promótora GAL1 bol skonštruovaný nasledovne. PCR amplifikácia sekvencie iRFP-KanMx z vektora pKTiRFP-KAN (dar od E. O'Shea, plazmid Addgene číslo 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikátor výskumného zdroja (RRID): Addgene_64687) a vložená do C-konca endogénneho Mid2. Po amplifikácii a klonovaní genómovej sekvencie Mid2-iRFP do promótora GAL1 bola táto sekvencia integrovaná do miesta Not I-Sac I integračného plazmidu pRS306. Výsledný plazmid pRGS7 bol linearizovaný pomocou Pst I, aby sa integroval do lokusu URA3.
Fúzny gén Gas1-GFP je exprimovaný pod kontrolou promótora GAL1 v plazmide centroméry (CEN), ktorý je skonštruovaný nasledovne. Sekvencia Gas1-GFP bola amplifikovaná pomocou PCR z plazmidu pRS416-GAS1-GFP (24) (dar od L. Popolo) a klonovaná do miesta Xma I–Xho I plazmidu CEN pBEVY-GL LEU2 (dar od C). Miller; číslo plazmidu Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Výsledný plazmid bol pomenovaný pRGS6. Fúzny gén Axl2-GFP je tiež exprimovaný pod kontrolou promótora GAL1 vektora pBEVY-GL LEU2 a jeho konštrukcia je nasledovná. Sekvencia Axl2-GFP bola amplifikovaná z plazmidu pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) pomocou PCR a klonovaná do miesta Bam HI-Pst I vektora pBEVY-GL LEU2. Výsledný plazmid bol pomenovaný pRGS12. Sekvencia oligonukleotidov použitých v tejto štúdii je uvedená v tabuľke S2.
Kmeň bol doplnený o 0,2 % adenínu a 2 % glukózy [YP-dextróza (YPD)], 2 % rafinózy [YP-rafinóza], proteínového p (YP) média bohatého na kvasničný extrakt (1 % kvasničného extraktu a 2 % proteínového ept). (YPR)] alebo 2 % galaktózy [YP-galaktózy (YPG)] ako zdroja uhlíka, alebo v syntetickom minimálnom médiu (0,15 % kvasničnej dusíkatej bázy a 0,5 % síranu amónneho) na doplnenie vhodných aminokyselín a báz potrebných pre výživu a obsahujúcom 2 % glukózy (syntetické glukózové minimálne médium) alebo 2 % galaktózy (syntetické galaktózové minimálne médium) ako zdroja uhlíka.
Pre zobrazovanie v reálnom čase boli teplotne citlivé mutantné bunky sec31-1 exprimujúce konštrukt pod promótorom GAL1 pestované v médiu YPR pri teplote 24 °C cez noc do strednej logaritmickej fázy. Po indukcii v YPG pri teplote 24 °C počas 1 hodiny boli bunky inkubované v SG pri teplote 37 °C počas 30 minút a potom prenesené do teploty 24 °C, aby sa uvoľnili zo sekrečného bloku. Konkanavalín A bol použitý na fixáciu buniek na sklenenom podložnom sklíčku a zobrazený pomocou SCLIM. SCLIM je kombináciou inverzného fluorescenčného mikroskopu Olympus IX-71 a olejovej šošovky UPlanSApo 100×1,4 (Olympus), vysokorýchlostného konfokálneho skenera s rotačným diskom a vysokým pomerom signálu k šumu (Yokogawa Electric), vlastného spektrometra a vlastného chladenia. Zosilňovač obrazu systému (Hamamatsu Photonics) dokáže poskytnúť systém zväčšovacích šošoviek s konečným zväčšením ×266,7 a kameru s nábojovo viazaným zariadením, ktorá násobí elektróny (Hamamatsu Photonics) (21). Získanie obrazu sa vykonáva pomocou vlastného softvéru (Yokogawa Electric). Pre 3D obrazy sme použili na mieru vyrobený piezoelektrický aktuátor na vertikálne vibrovanie objektívu a optické časti vzdialené od seba 100 nm sme zhromaždili do vrstvy. Z-vrstvený obraz sa prevedie na 3D voxelové dáta a teoretická funkcia rozptylu bodov použitá pre konfokálny mikroskop s rotačným diskom sa použije na dekonvolučné spracovanie softvérom Volocity (PerkinElmer). Pomocou softvéru Volocity na automatické stanovenie prahových hodnôt pre analýzu kolokácie sa meral ERES vrátane nákladu. Analýza líniovým skenovaním sa vykonala pomocou softvéru MetaMorph (Molecular Devices).
Na určenie štatistickej významnosti použite softvér GraphPad Prism. V prípade obojstranného Studentovho t-testu a bežného jednofaktorového testu analýzy rozptylu (ANOVA) sa rozdiely medzi skupinami považujú za rozdiely s významným vplyvom na P < 0,05 (*).
Pre fluorescenčnú mikroskopiu Gas1-GFP boli bunky v logaritmickej fáze pestované cez noc v YPD a zozbierané centrifugáciou, dvakrát premyté fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom a inkubované na ľade aspoň 15 minút a potom spracované pod mikroskopom podľa predtým opísaného postupu (24). Na akvizíciu bol použitý mikroskop Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) vybavený objektívom, filtrom L5 (GFP), kamerou Hamamatsu a softvérom Application Suite X (LAS X).
Vzorky boli denaturované SDS vzorkovým pufrom pri teplote 65 °C počas 10 minút a potom separované SDS-polyakrylamidovou gélovou elektroforézou (PAGE). Na imunoblotovú analýzu bolo do každej dráhy nanesených 10 μl vzorky. Primárna protilátka: Použite králičiu polyklonálnu protilátku anti-Gas1 v riedení 1:3000, králičiu polyklonálnu protilátku anti-Emp24 v riedení 1:500 a králičiu polyklonálnu protilátku anti-GFP (dar od H. Riezmana) v riedení 1:3000. Myšia monoklonálna protilátka anti-Pgk1 bola použitá v riedení 1:5000 (dar od J. de la Cruz). Sekundárna protilátka: Kozí anti-králičí imunoglobulín G (IgG) konjugovaný s chrenovou peroxidázou (HRP) v riedení 1:3000 (Pierce). Kozí anti-myší IgG konjugovaný s HRP bol použitý v riedení 1:3000 (Pierce). Zóna imunitnej odpovede bola pozorovaná chemiluminiscenčnou metódou s použitím činidla SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Ako je opísané v (31), na obohatenej ER frakcii sa vykonal experiment s prirodzenou imunoprecipitáciou. Stručne povedané, kvasinkové bunky sa dvakrát premyli TNE pufrom [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluoridu a zmesou inhibítorov proteáz) pri 600 nm (OD600) pri optickej hustote 100. Potom sa rozdrvili sklenenými guľôčkami a potom sa bunkové zvyšky a sklenené guľôčky odstránili centrifugáciou. Supernatant sa potom centrifugoval pri 17 000 g počas 15 minút pri 4 °C. Peleta sa resuspendovala v TNE a pridal sa digitalisový saponín do konečnej koncentrácie 1 %. Suspenzia sa inkubovala 1 hodinu s rotáciou pri 4 °C a potom sa nerozpustné zložky odstránili centrifugáciou pri 13 000 g pri 4 °C počas 60 minút. Pre imunoprecipitáciu Gas1-GFP najskôr preinkubujte vzorku s prázdnymi agarózovými guľôčkami (ChromoTek) pri teplote 4 °C počas 1 hodiny a potom inkubujte s GFP-Trap_A (ChromoTek) pri teplote 4 °C počas 3 hodín. Imunoprecipitované guľôčky boli päťkrát premyté TNE obsahujúcim 0,2 % digoxigenínu, eluované SDS vzorkovacím pufrom, separované na SDS-PAGE a analyzované imunoblottingom.
Ako je opísané v (31), stanovenie zosieťovania sa vykonalo na obohatenej frakcii ER. Stručne povedané, obohatená frakcia ER sa inkubovala s 0,5 mM ditiobis(sukcínimidylpropionátom) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 °C, 20 min). Reakcia zosieťovania sa zastavila pridaním glycínu (konečná koncentrácia 50 mM, 5 minút, 20 °C).
Ako bolo predtým opísané (50), bola vykonaná MS analýza ceramidu v kmeňoch divokého typu a GhLag1. Stručne povedané, bunky boli pestované do exponenciálnej fázy (3 až 4 OD600 jednotiek/ml) v YPD pri 30 °C a bolo zozbieraných 25 × 107 buniek. Ich metabolizmus bol zastavený kyselinou trichlóroctovou. Použite extrakčné rozpúšťadlo [etanol, voda, éter, pyridín a 4,2 N hydroxid amónny (15:15:5:1:0,018 obj./obj.)] a 1,2 nmol interného štandardu C17 ceramidu (860517, Avanti polárny lipid)). Použite monometylamínové činidlo [metanol, voda, n-butanol a roztok metylamínu (4:3:1:5 obj./obj.)] na vykonanie miernej alkalickej hydrolýzy extraktu a potom použite vodou nasýtený n-butanol na odsolenie. Nakoniec bol extrakt resuspendovaný v rozpúšťadle s pozitívnym režimom [chloroform/metanol/voda (2:7:1) + 5 mM octan amónny] a vstreknutý do hmotnostného spektrometra. Na identifikáciu a kvantifikáciu molekúl sfingolipidov sa vykonalo monitorovanie viacerých reakcií (MRM). Terciárny kvadrupólový hmotnostný spektrometer TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) je vybavený robotickým nanoflow iónovým zdrojom Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) na analýzu lipidov. Energia zrážky je optimalizovaná pre každú kategóriu ceramidov. MS dáta boli získané v pozitívnom režime. Pre každý biologický replikát je lipidový signál mediánom troch nezávislých meraní.
Ako je opísané v (31), bunky (800 × 107) exprimujúce Gas1-GFP boli podrobené prirodzenej imunoprecipitácii. Purifikovaný Gas1-GFP bol separovaný pomocou SDS-PAGE a prenesený na polyvinylidénfluoridovú (PVDF) membránu. Proteín bol vizualizovaný farbením PVDF amidovou čiernou. Pás Gas1-GFP bol odrezaný z PVDF a 5-krát premytý metanolom a raz vodou s kvalitou vhodnou pre kvapalinovú chromatografiu-MS (LC-MS). Inkubáciou membránového prúžku s 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), pufrom a 500 μl čerstvo rozpustenej 1 M zmesi dusitanu sodného pri teplote 37 °C počas 3 hodín sa lipidová frakcia uvoľnila z Gas1-GFP a lyzovala sa uvoľnenie inozínfosfátového ceramidu medzi glukozamínom a inozitolom (51). Potom bol membránový prúžok štyrikrát premytý vodou s kvalitou vhodnou pre LC-MS, vysušený pri izbovej teplote a skladovaný v dusíkovej atmosfére pri teplote -80 °C až do analýzy. Ako kontrola sa pre každý experiment použila slepá vzorka PVDF membrány. Lipid extrahovaný z Gas1-GFP sa potom analyzoval MS, ako je opísané (50). Stručne povedané, PVDF prúžky obsahujúce GPI-lipid sa resuspendovali v 75 μl negatívneho rozpúšťadla pre formy [chloroform/metanol (1:2) + 5 mM octan amónny] a prešli analýzou sfingolipidových druhov elektrosprejovou ionizáciou (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). V tomto prípade sa MS údaje získali v režime negatívnych iónov.
Ako už bolo spomenuté, lipidová časť GPI kotvy bola oddelená od [3H]-inozitolom značeného GPI-AP (16). Lipidy boli oddelené tenkovrstvovou chromatografiou s použitím systému rozpúšťadiel (55:45:10 chloroform-metanol-0,25 % KCl) a vizualizované pomocou FLA-7000 (Fujifilm).
Bunky exprimujúce Gas1-GFP (600×107) boli dvakrát premyté TNE pufrom, rozdrvené sklenenými guľôčkami a potom centrifugované, aby sa odstránili bunkové zvyšky a sklenené guľôčky. Supernatant bol potom centrifugovaný pri 17 000 g počas 1 hodiny pri 4 °C. Peleta bola premytá v TNE a inkubovaná s 1 U PI-PLC (Invitrogen) v TNE obsahujúcom 0,2 % digitalisového saponínu počas 1 hodiny pri 37 °C. Po enzymatickej úprave bola membrána odstránená centrifugáciou pri 17 000 g pri 4 °C počas 1 hodiny. Na imunoprecipitáciu Gas1-GFP bol supernatant inkubovaný s GFP-Trap_A (ChromoTek) pri 4 °C cez noc. Purifikovaný Gas1-GFP separovaný pomocou SDS-PAGE bol zafarbený Coomassie brilantnou modrou. Farbiaci pás Gas1-GFP bol odrezaný od sivej farby okolo akvaduktu a po alkylácii jódacetamidom a redukcii ditiotreitolom sa uskutočnilo štiepenie v géli trypsínom. Tryptické peptidy a peptidy s GPI-glykánmi sa extrahovali a vysušili. Vysušený peptid sa rozpustil v 20 μl vody. Časť (8 μl) sa vstrekla do LC. Na separáciu peptidov za špecifických gradientových podmienok sa použila oktadecylsilánová (ODS) kolóna (Develosil 300ODS-HG-5; vnútorný priemer 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, prefektúra Aichi, Japonsko). Mobilnou fázou bolo rozpúšťadlo A (0,08 % kyselina mravčia) a rozpúšťadlo B (0,15 % kyselina mravčia v 80 % acetonitrile). Na eluovanie kolóny rozpúšťadlom A počas 55 minút pri prietoku 50 μl min-1 počas 5 minút sa použil systém Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) a potom sa koncentrácia rozpúšťadla B zvýšila na 40 %. (Spojené štáty). Eluát sa kontinuálne zavádzal do iónového zdroja ESI a tryptické peptidy a peptidy s GPI-glykánmi sa analyzovali pomocou LTQ Orbitrap XL (hybridný hmotnostný spektrometer s lineárnou iónovou pascou a orbitrapou; Thermo Fisher Scientific). V MS nastavení bolo napätie kapilárneho zdroja nastavené na 4,5 kV a teplota prenosovej kapiláry sa udržiavala na 300 °C. Napätie kapiláry a napätie šošovky trubice boli nastavené na 15 V a 50 V. MS dáta boli získané v režime kladných iónov (rozlíšenie 60 000; presnosť hmotnosti 10 častíc na milión) v hmotnostnom rozsahu 300/m/z s pomerom hmotnosti a náboja (m/z) 3000. MS/MS dáta sa získavajú cez iónovú pascu v LTQ Orbitrap XL [prvé 3 číslice, od ktorých závisia dáta, disociácia indukovaná kolíziou (CID)].
MD simulácie boli vykonané pomocou softvéru GROMACS (52) a silového poľa MARTINI 2 (53-55). Na vytvorenie dvojvrstvy obsahujúcej dioleoylfosfatidylcholín (DOPC) a Cer C18 alebo DOPC a Cer C26 bol potom použitý Membrane Builder v rozhraní CHARMM GUI (56, 57). Topológia a súradnice Cer C26 sú odvodené z DXCE odstránením prebytočných guľôčok zo sfingozínového chvosta. Na vyváženie dvojvrstvy a jej spustenie použite nižšie opísaný postup a potom použite posledné súradnice systému na vytvorenie systému obsahujúceho Emp24. Transmembránová doména kvasinky Emp24 (zvyšky 173 až 193) bola skonštruovaná ako α-helix pomocou nástroja Visual MD (VMD) na analýzu molekulárnej štruktúry (58). Po odstránení prekrývajúcich sa lipidov bol proteín hrubo granulovaný a vložený do dvojvrstvy pomocou grafického používateľského rozhrania CHARMM. Finálny systém obsahuje 1202 DOPC a 302 Cer C26 alebo 1197 DOPC a 295 Cer C18 a Emp24. Systém sa ionizuje na koncentráciu 0,150 M. Pre dve dvojvrstvové kompozície sa uskutočnili štyri nezávislé replikáty.
Lipidová dvojvrstva je vyvážená pomocou procesu CHARMM GUI, ktorý zahŕňa minimalizáciu a následné vyváženie 405 000 krokov, kde sa obmedzenia polohy postupne znižujú a eliminujú a časový krok sa zvyšuje z 0,005 ps na 0,02 ps. Po vyvážení produkuje 6 µs s časovým krokom 0,02 ps. Po vložení Emp24 použite rovnaký proces CHARMM GUI na minimalizáciu a vyváženie systému a potom ho spustite 8 sekúnd v produkčnom režime.
Pre všetky systémy je tlak počas procesu vyvažovania riadený Berendsenovým barostatom (59) a počas výrobného procesu je tlak riadený Parrinello-Rahmanovým barostatom (60). Vo všetkých prípadoch je priemerný tlak 1 bar a používa sa semiizotropná schéma tlakového spojenia. V procese vyvažovania a výroby sa používa termostat (61) s rekalibráciou rýchlosti na spojenie teploty častíc proteínu, lipidu a rozpúšťadla. Počas celej operácie je cieľová teplota 310 K. Neväzbová interakcia sa vypočíta vygenerovaním párovacieho zoznamu pomocou Verletovej schémy s toleranciou pufra 0,005. Coulombov člen sa vypočíta pomocou reakčného poľa a medznej vzdialenosti 1,1 nm. Vander-Waalsov člen používa medznú schému s medznou vzdialenosťou 1,1 nm a Verletova medzná schéma sa používa pre potenciálny drift (62).
Pomocou VMD je medzná vlnová dĺžka medzi fosfátovými guľôčkami DOPC alebo ceramidovými guľôčkami AM1 a proteínom 0,7 nm a vypočíta sa počet lipidov, ktoré interagujú s proteínom. Podľa nasledujúceho vzorca vypočítajte faktor deplecie-obohatenia (DE) ako v (63): Faktor DE = (množstvo celkových lipidov v proteíne 0,7) v proteíne 0,7 (množstvo Cer v celkových lipidoch)
Uvedená hodnota sa získa ako priemer a chybové úsečky predstavujú štyri nezávislé kópie SE. Štatistická významnosť faktora DE sa vypočíta t-testom [(priemerná DE-faktor-1)/SE]. Vypočítajte hodnotu P z jednostranného rozdelenia.
Na výpočet 2D laterálnej mapy hustoty systému obsahujúceho Emp24 v priebehu posledných 250 ns záznamu bol použitý nástroj GROMACS. Na získanie mapy obohatenia/deplécie ceramidu sa mapa hustoty Cer vydelí súčtom mapy Cer a DOPC a potom sa vydelí koncentráciou Cer v tele. Používa sa rovnaká farebná škála mapy.
Doplňujúce materiály k tomuto článku nájdete na stránke http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný podľa podmienok licencie Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ktorá umožňuje použitie, distribúciu a reprodukciu v akomkoľvek médiu, pokiaľ konečné použitie nie je na komerčný zisk a predpokladom je, že pôvodné dielo je správne. Zdroj.
Poznámka: Žiadame vás o poskytnutie vašej e-mailovej adresy iba preto, aby osoba, ktorú odporúčate stránke, vedela, že chcete, aby videla daný e-mail a že nejde o spam. Nebudeme zaznamenávať žiadne e-mailové adresy.
Táto otázka sa používa na overenie, či ste návštevník, a na zabránenie automatického odosielania spamu.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Lopez Maria Perez, Miga Serezho-Wagio (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D zobrazovanie v reálnom čase s vysokým rozlíšením odhaľuje dôležitosť dĺžky ceramidového reťazca pre triedenie proteínov v selektívnych výstupných miestach.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Lopez Maria Perez, Miga Serezho-Wagio (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D zobrazovanie v reálnom čase s vysokým rozlíšením odhaľuje dôležitosť dĺžky ceramidového reťazca pre triedenie proteínov v selektívnych výstupných miestach.
©2020 American Association for the Advancement of Science. všetky práva vyhradené. AAAS je partnerom HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.