Ďakujeme za návštevu stránky nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať najnovšiu verziu prehliadača (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, táto stránka nebude obsahovať štýly ani JavaScript.
Sírovodík (H2S) má viacero fyziologických a patologických účinkov na ľudské telo. Hydrogénsulfid sodný (NaHS) sa široko používa ako farmakologický nástroj na hodnotenie účinkov H2S v biologických experimentoch. Hoci strata H2S z roztokov NaHS trvá len niekoľko minút, roztoky NaHS sa v niektorých štúdiách na zvieratách použili ako donorové zlúčeniny pre H2S v pitnej vode. Táto štúdia skúmala, či pitná voda s koncentráciou NaHS 30 μM pripravená vo fľašiach pre potkany/myše môže zostať stabilná aspoň 12 – 24 hodín, ako navrhujú niektorí autori. Pripravte roztok NaHS (30 μM) v pitnej vode a ihneď ho nalejte do fliaš s vodou pre potkany/myše. Vzorky sa odobrali z hrotu a vnútra fľaše s vodou v čase 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 a 24 hodín na meranie obsahu sulfidov pomocou metódy s metylénovou modrou. Okrem toho boli samcom a samiciam potkanov injekčne podávané NaHS (30 μM) počas dvoch týždňov a koncentrácie sulfidov v sére sa merali každý druhý deň počas prvého týždňa a na konci druhého týždňa. Roztok NaHS vo vzorke získanej z hrotu fľaše na vodu bol nestabilný; po 12 a 24 hodinách sa znížil o 72 % a 75 %. Vo vzorkách získaných z vnútra fliaš na vodu nebol pokles NaHS do 2 hodín významný; po 12 a 24 hodinách sa však znížil o 47 % a 72 %. Injekcia NaHS neovplyvnila hladinu sulfidov v sére samcov a samíc potkanov. Záverom možno povedať, že roztoky NaHS pripravené z pitnej vody by sa nemali používať na darovanie H2S, pretože roztok je nestabilný. Táto cesta podávania vystaví zvieratá nepravidelným a menším množstvám NaHS, ako sa očakávalo.
Sírovodík (H2S) sa používa ako toxín už od roku 1700; jeho možnú úlohu ako endogénnej biosignálnej molekuly však opísali Abe a Kimura v roku 1996. Počas uplynulých troch desaťročí boli objasnené početné funkcie H2S v rôznych ľudských systémoch, čo viedlo k poznaniu, že donorové molekuly H2S môžu mať klinické uplatnenie pri liečbe alebo manažmente určitých ochorení; nedávny prehľad pozri v práci Chirino a kol.
Hydrosulfid sodný (NaHS) sa široko používa ako farmakologický nástroj na hodnotenie účinkov H2S v mnohých štúdiách na bunkových kultúrach a zvieratách5,6,7,8. NaHS však nie je ideálnym donorom H2S, pretože sa v roztoku rýchlo premieňa na H2S/HS-, ľahko sa kontaminuje polysulfidmi a ľahko sa oxiduje a odparuje4,9. V mnohých biologických experimentoch sa NaHS rozpúšťa vo vode, čo vedie k pasívnemu odparovaniu a strate H2S10,11,12, spontánnej oxidácii H2S11,12,13 a fotolýze14. Sulfid v pôvodnom roztoku sa veľmi rýchlo stráca v dôsledku odparovania H2S11. V otvorenej nádobe je polčas rozpadu (t1/2) H2S približne 5 minút a jeho koncentrácia klesá približne o 13 % za minútu10. Hoci strata sírovodíka z roztokov NaHS trvá len niekoľko minút, niektoré štúdie na zvieratách používali roztoky NaHS ako zdroj sírovodíka v pitnej vode počas 1 – 21 týždňov, pričom roztok obsahujúci NaHS sa nahrádzal každých 12 – 24 hodín.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Táto prax nie je v súlade so zásadami vedeckého výskumu, pretože dávkovanie liekov by malo byť založené na ich použití u iných druhov, najmä u ľudí.27
Predklinický výskum v biomedicíne sa zameriava na zlepšenie kvality starostlivosti o pacientov alebo výsledkov liečby. Výsledky väčšiny štúdií na zvieratách však ešte neboli prenesené na ľudí28,29,30. Jedným z dôvodov tohto zlyhania pri translácii je nedostatočná pozornosť venovaná metodologickej kvalite štúdií na zvieratách30. Cieľom tejto štúdie bolo preto preskúmať, či 30 μM roztoky NaHS pripravené vo fľašiach s vodou pre potkany/myše môžu zostať stabilné v pitnej vode počas 12 – 24 hodín, ako sa tvrdí alebo navrhuje v niektorých štúdiách.
Všetky experimenty v tejto štúdii boli vykonané v súlade s publikovanými smernicami pre starostlivosť o laboratórne zvieratá a ich používanie v Iráne31. Všetky experimentálne správy v tejto štúdii sa tiež riadili smernicami ARRIVE32. Etická komisia Inštitútu endokrinných vied Univerzity lekárskych vied Shahida Beheshtiho schválila všetky experimentálne postupy v tejto štúdii.
Dihydrát octanu zinočnatého (CAS: 5970-45-6) a bezvodý chlorid železitý (CAS: 7705-08-0) boli zakúpené od spoločnosti Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Francúzsko). Hydrát hydrogensulfidu sodného (CAS: 207683-19-0) a N,N-dimetyl-p-fenyléndiamín (DMPD) (CAS: 535-47-0) boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Izoflurán bol zakúpený od spoločnosti Piramal (Bethlehem, PA, USA). Kyselina chlorovodíková (HCl) bola zakúpená od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko).
Pripravte roztok NaHS (30 μM) v pitnej vode a ihneď ho nalejte do fliaš s vodou pre potkany/myši. Táto koncentrácia bola zvolená na základe početných publikácií používajúcich NaHS ako zdroj H2S; pozri časť Diskusia. NaHS je hydratovaná molekula, ktorá môže obsahovať rôzne množstvá hydratačnej vody (t. j. NaHS•xH2O); podľa výrobcu bolo percento NaHS použitého v našej štúdii 70,7 % (t. j. NaHS•1,3 H2O) a túto hodnotu sme zohľadnili v našich výpočtoch, kde sme použili molekulovú hmotnosť 56,06 g/mol, čo je molekulová hmotnosť bezvodého NaHS. Hydratačná voda (tiež nazývaná kryštalická voda) sú molekuly vody, ktoré tvoria kryštalickú štruktúru33. Hydráty majú v porovnaní s anhydrátmi odlišné fyzikálne a termodynamické vlastnosti34.
Pred pridaním NaHS do pitnej vody zmerajte pH a teplotu rozpúšťadla. Roztok NaHS ihneď nalejte do fľaše s vodou pre potkany/myši v klietke pre zvieratá. Vzorky sa odoberali z hrotu a z vnútra fľaše s vodou po 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 a 24 hodinách na meranie obsahu sulfidov. Merania sulfidov sa vykonávali bezprostredne po každom odbere vzorky. Vzorky sme získali z hrotu skúmavky, pretože niektoré štúdie ukázali, že malá veľkosť pórov vo vodnej skúmavke môže minimalizovať odparovanie H2S15,19. Zdá sa, že tento problém sa týka aj roztoku vo fľaši. To však neplatilo pre roztok v hrdle fľaše s vodou, ktorý mal vyššiu rýchlosť odparovania a autooxidoval; v skutočnosti zvieratá túto vodu vypili ako prvú.
V štúdii boli použité samce a samice potkanov kmeňa Wistar. Potkany boli chované v polypropylénových klietkach (2 – 3 potkany na klietku) za štandardných podmienok (teplota 21 – 26 °C, vlhkosť 32 – 40 %) s 12 hodinami svetla (7:00 – 19:00) a 12 hodinami tmy (19:00 – 7:00). Potkany mali voľný prístup k vode z vodovodu a boli kŕmené štandardným krmivom (Khorak Dam Pars Company, Teherán, Irán). Vekovo zodpovedajúce (6 mesiacov) samice (n = 10, telesná hmotnosť: 190 – 230 g) a samce (n = 10, telesná hmotnosť: 320 – 370 g) potkanov Wistar boli náhodne rozdelené do kontrolnej skupiny a skupiny ošetrenej NaHS (30 μM) (n = 5 na skupinu). Na určenie veľkosti vzorky sme použili prístup KISS (Keep It Simple, Stupid), ktorý kombinuje predchádzajúce skúsenosti a silovú analýzu35. Najprv sme vykonali pilotnú štúdiu na 3 potkanoch a stanovili sme priemernú hladinu celkového sulfidu v sére a štandardnú odchýlku (8,1 ± 0,81 μM). Následne sme, berúc do úvahy 80 % silu a predpokladajúc obojstrannú 5 % hladinu významnosti, určili predbežnú veľkosť vzorky (n = 5 na základe predchádzajúcej literatúry), ktorá zodpovedala štandardizovanej veľkosti účinku 2,02 s vopred definovanou hodnotou navrhnutou Festingom pre výpočet veľkosti vzorky experimentálnych zvierat35. Po vynásobení tejto hodnoty štandardnou odchýlkou ​​(2,02 × 0,81) bola predpokladaná detekovateľná veľkosť účinku (1,6 μM) 20 %, čo je prijateľné. To znamená, že n = 5/skupina je dostatočná na detekciu 20 % priemernej zmeny medzi skupinami. Potkany boli náhodne rozdelené do kontrolnej skupiny a skupiny ošetrenej NaSH pomocou náhodnej funkcie softvéru Excel36 (doplnkový obrázok 1). Zaslepenie sa vykonalo na úrovni výsledku a výskumníci vykonávajúci biochemické merania si neboli vedomí zaradenia do skupín.
Skupiny oboch pohlaví s NaHS boli liečené 30 μM roztokom NaHS pripraveným v pitnej vode počas 2 týždňov; čerstvý roztok bol podávaný každých 24 hodín, počas ktorých sa merala telesná hmotnosť. Vzorky krvi boli odobraté z končekov chvostov všetkých potkanov v izofluránovej anestézii každý druhý deň na konci prvého a druhého týždňa. Vzorky krvi boli centrifugované pri 3000 g počas 10 minút, sérum bolo oddelené a uskladnené pri teplote –80 °C na následné meranie močoviny v sére, kreatinínu (Cr) a celkového sulfidu. Močovina v sére bola stanovená enzymatickou ureázovou metódou a kreatinín v sére bol stanovený fotometrickou Jaffeho metódou s použitím komerčne dostupných súprav (Man Company, Teherán, Irán) a automatického analyzátora (Selectra E, sériové číslo 0-2124, Holandsko). Variačné koeficienty v rámci testu a medzi testami pre močovinu a Cr boli menšie ako 2,5 %.
Metóda s metylénovou modrou (MB) sa používa na meranie celkového množstva sulfidov v pitnej vode a sére obsahujúcom NaHS; MB je najčastejšie používanou metódou na meranie sulfidov v objemových roztokoch a biologických vzorkách11,37. Metóda MB sa môže použiť na odhad celkového množstva sulfidov38 a na meranie anorganických sulfidov vo forme H2S, HS- a S2 vo vodnej fáze39. Pri tejto metóde sa síra vyzráža ako sulfid zinočnatý (ZnS) v prítomnosti octanu zinočnatého11,38. Zrážanie octanom zinočnatým je najpoužívanejšou metódou na oddelenie sulfidov od iných chromoforov11. ZnS sa znovu rozpustil pomocou HCl11 za silne kyslých podmienok. Sulfid reaguje s DMPD v stechiometrickom pomere 1:2 v reakcii katalyzovanej chloridom železitým (Fe3+ pôsobí ako oxidačné činidlo) za vzniku farbiva MB, ktoré sa deteguje spektrofotometricky pri 670 nm40,41. Detekčný limit metódy MB je približne 1 μM11.
V tejto štúdii sa do skúmavky pridalo 100 μl každej vzorky (roztok alebo sérum); potom sa pridalo 200 μl octanu zinočnatého (1 % hm./obj. v destilovanej vode), 100 μl DMPD (20 mM v 7,2 M HCl) a 133 μl FeCl3 (30 mM v 1,2 M HCl). Zmes sa inkubovala pri teplote 37 °C v tme počas 30 minút. Roztok sa centrifugoval pri 10 000 g počas 10 minút a absorbancia supernatantu sa odčítala pri 670 nm pomocou čítačky mikroplatničiek (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Koncentrácie sulfidov sa stanovili pomocou kalibračnej krivky NaHS (0–100 μM) v ddH2O (doplnkový obrázok 2). Všetky roztoky použité na merania boli čerstvo pripravené. Vnútroanalytické a medzianalytické variačné koeficienty pre merania sulfidov boli 2,8 % a 3,4 %. Celkové množstvo sulfidov získaných zo vzoriek pitnej vody a séra obsahujúcich tiosíran sodný sme tiež stanovili pomocou metódy obohatenej vzorky42. Výťažnosť vzoriek pitnej vody a séra obsahujúcich tiosíran sodný bola 91 ± 1,1 % (n = 6) a 93 ± 2,4 % (n = 6).
Štatistická analýza sa vykonala pomocou softvéru GraphPad Prism verzie 8.0.2 pre Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). Na porovnanie teploty a pH pitnej vody pred a po pridaní NaHS sa použil párový t-test. Strata H2S v roztoku obsahujúcom NaHS sa vypočítala ako percentuálny pokles oproti východiskovej hodnote príjmu a na posúdenie, či bola strata štatisticky významná, sme vykonali jednofaktorovú ANOVA s opakovanými meraniami, po ktorej nasledoval Dunnettov test viacnásobného porovnávania. Telesná hmotnosť, močovina v sére, kreatinín v sére a celkový sulfid v sére v priebehu času sa porovnávali medzi kontrolnými potkanmi a potkanmi rôzneho pohlavia liečenými NaHS pomocou dvojfaktorovej zmiešanej (medzi-v rámci) ANOVA, po ktorej nasledoval Bonferroniho post hoc test. Za štatisticky významné sa považovali obojstranné hodnoty P < 0,05.
Hodnota pH pitnej vody bola pred pridaním NaHS 7,60 ± 0,01 a po pridaní NaHS 7,71 ± 0,03 (n = 13, p = 0,0029). Teplota pitnej vody bola 26,5 ± 0,2 a po pridaní NaHS klesla na 26,2 ± 0,2 (n = 13, p = 0,0128). Pripravte 30 μM roztok NaHS v pitnej vode a uskladnite ho vo fľaši na vodu. Roztok NaHS je nestabilný a jeho koncentrácia časom klesá. Pri odbere vzoriek z hrdla fľaše na vodu sa pozoroval významný pokles (68,0 %) v priebehu prvej hodiny a obsah NaHS v roztoku sa po 12 a 24 hodinách znížil o 72 % a 75 %. Vo vzorkách odobratých z fliaš na vodu nebol pokles NaHS významný až do 2 hodín, ale po 12 a 24 hodinách sa znížil o 47 % a 72 %. Tieto údaje naznačujú, že percento NaHS v 30 μM roztoku pripravenom v pitnej vode sa po 24 hodinách znížilo približne na štvrtinu pôvodnej hodnoty, bez ohľadu na miesto odberu vzoriek (obrázok 1).
Stabilita roztoku NaHS (30 μM) v pitnej vode vo fľašiach pre potkany/myši. Po príprave roztoku boli odobraté vzorky z hrotu a vnútra fľaše na vodu. Údaje sú uvedené ako priemer ± SD (n = 6/skupina). * a #, P < 0,05 v porovnaní s časom 0. Fotografia fľaše na vodu zobrazuje hrot (s otvorom) a telo fľaše. Objem hrotu je približne 740 μl.
Koncentrácia NaHS v čerstvo pripravenom 30 μM roztoku bola 30,3 ± 0,4 μM (rozsah: 28,7 – 31,9 μM, n = 12). Po 24 hodinách sa však koncentrácia NaHS znížila na nižšiu hodnotu (priemer: 3,0 ± 0,6 μM). Ako je znázornené na obrázku 2, koncentrácie NaHS, ktorým boli potkany vystavené, neboli počas sledovaného obdobia konštantné.
Telesná hmotnosť samíc potkanov sa časom významne zvýšila (z 205,2 ± 5,2 g na 213,8 ​​± 7,0 g v kontrolnej skupine a z 204,0 ± 8,6 g na 211,8 ± 7,5 g v skupine liečenej NaHS); liečba NaHS však nemala žiadny vplyv na telesnú hmotnosť (Obr. 3). Telesná hmotnosť samcov potkanov sa časom významne zvýšila (z 338,6 ± 8,3 g na 352,4 ± 6,0 g v kontrolnej skupine a z 352,4 ± 5,9 g na 363,2 ± 4,3 g v skupine liečenej NaHS); liečba NaHS však nemala žiadny vplyv na telesnú hmotnosť (Obr. 3).
Zmeny telesnej hmotnosti u samíc a samcov potkanov po podaní NaHS (30 μM). Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM a boli porovnané pomocou obojsmernej zmiešanej (medzi-medzi) analýzy rozptylu s Bonferroniho post hoc testom. n = 5 každého pohlavia v každej skupine.
Koncentrácie močoviny a kreatínfosfátu v sére boli u kontrolných potkanov a potkanov liečených NaSH počas celej štúdie porovnateľné. Okrem toho liečba NaSH neovplyvnila koncentrácie močoviny a kreatínchrómu v sére (Tabuľka 1).
Východiskové koncentrácie celkového sulfidu v sére boli porovnateľné medzi kontrolnými samcami (8,1 ± 0,5 μM oproti 9,3 ± 0,2 μM) a samicami (9,1 ± 1,0 μM oproti 6,1 ± 1,1 μM) potkanov a samcami potkanov ošetrenými NaHS. Podávanie NaHS počas 14 dní nemalo žiadny vplyv na hladiny celkového sulfidu v sére ani u samcov, ani u samíc potkanov (obr. 4).
Zmeny v sérových koncentráciách celkových sulfidov u samcov a samíc potkanov po podaní NaHS (30 μM). Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM a boli porovnané pomocou obojsmernej zmiešanej (within-within) analýzy rozptylu s Bonferroniho post hoc testom. Každé pohlavie, n = 5/skupina.
Hlavným záverom tejto štúdie je, že pitná voda obsahujúca NaHS je nestabilná: 24 hodín po odbere vzorky z hrotu a vnútra fliaš na vodu pre potkany/myši je možné zistiť iba približne štvrtinu počiatočného celkového obsahu sulfidov. Okrem toho boli potkany vystavené nestabilným koncentráciám NaHS v dôsledku straty H2S v roztoku NaHS a pridanie NaHS do pitnej vody neovplyvnilo telesnú hmotnosť, hladinu močoviny a kreatínchrómu v sére ani celkový obsah sulfidov v sére.
V tejto štúdii bola rýchlosť straty H2S z 30 μM roztokov NaHS pripravených v pitnej vode približne 3 % za hodinu. V pufrovanom roztoku (100 μM sulfid sodný v 10 mM PBS, pH 7,4) sa koncentrácia sulfidu v priebehu 8 hodín znížila o 7 %11. Predtým sme obhajovali intraperitoneálne podávanie NaHS hlásením, že rýchlosť straty sulfidu z 54 μM roztoku NaHS v pitnej vode bola približne 2,3 % za hodinu (4 %/hodinu počas prvých 12 hodín a 1,4 %/hodinu počas posledných 12 hodín po príprave)8. Skoršie štúdie43 zistili konštantnú stratu H2S z roztokov NaHS, predovšetkým v dôsledku odparovania a oxidácie. Aj bez pridania bublín sa sulfid v zásobnom roztoku rýchlo stráca v dôsledku odparovania H2S11. Štúdie ukázali, že počas procesu riedenia, ktorý trvá približne 30 – 60 sekúnd, sa v dôsledku odparovania stráca približne 5 – 10 % H2S6. Aby sa zabránilo odparovaniu H2S z roztoku, výskumníci prijali niekoľko opatrení vrátane jemného miešania roztoku12, prikrytia zásobného roztoku plastovou fóliou6 a minimalizácie vystavenia roztoku vzduchu, pretože rýchlosť odparovania H2S závisí od rozhrania vzduch-kvapalina.13 K spontánnej oxidácii H2S dochádza hlavne v dôsledku iónov prechodných kovov, najmä železitého železa, ktoré sú nečistotami vo vode.13 Oxidácia H2S vedie k tvorbe polysulfidov (atómy síry spojené kovalentnými väzbami)11. Aby sa zabránilo jeho oxidácii, roztoky obsahujúce H2S sa pripravujú v deoxygenovaných rozpúšťadlách44,45 a potom sa preplachujú argónom alebo dusíkom počas 20 – 30 minút, aby sa zabezpečila deoxygenácia.11,12,37,44,45,46 Kyselina dietyléntriamínpentaoctová (DTPA) je chelátor kovov (10–4 M), ktorý zabraňuje autooxidácii HS v aeróbnych roztokoch. V neprítomnosti DTPA je rýchlosť autooxidácie HS- približne 50 % počas približne 3 hodín pri teplote 25 °C37,47. Okrem toho, keďže oxidáciu 1e-sulfidu katalyzuje ultrafialové svetlo, roztok by sa mal skladovať na ľade a chrániť pred svetlom11.
Ako je znázornené na obrázku 5, NaHS sa po rozpustení vo vode disociuje na Na+ a HS-6; táto disociácia je určená hodnotou pK1 reakcie, ktorá závisí od teploty: pK1 = 3,122 + 1132/T, kde T sa pohybuje od 5 do 30 °C a meria sa v stupňoch Kelvina (K), K = °C + 273,1548. HS- má vysokú hodnotu pK2 (pK2 = 19), takže pri pH < 96,49 sa S2- netvorí alebo sa tvorí vo veľmi malých množstvách. Naproti tomu HS- pôsobí ako báza a prijíma H+ z molekuly H2O a H2O pôsobí ako kyselina a premieňa sa na H2S a OH-.
Tvorba rozpusteného plynu H2S v roztoku NaHS (30 µM). aq, vodný roztok; g, plyn; l, kvapalina. Všetky výpočty predpokladajú, že pH vody = 7,0 a teplota vody = 20 °C. Vytvorené pomocou BioRender.com.
Napriek dôkazom o nestabilnosti roztokov NaHS, niekoľko štúdií na zvieratách použilo roztoky NaHS v pitnej vode ako donor H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 s trvaním intervencie od 1 do 21 týždňov (Tabuľka 2). Počas týchto štúdií sa roztok NaHS obnovoval každých 12 hodín, 15, 17, 18, 24, 25 hodín alebo 24 hodín, 19, 20, 21, 22, 23 hodín. Naše výsledky ukázali, že potkany boli vystavené nestabilným koncentráciám liečiva v dôsledku straty H2S z roztoku NaHS a obsah NaHS v pitnej vode potkanov významne kolísal počas 12 alebo 24 hodín (pozri obrázok 2). Dve z týchto štúdií uviedli, že hladiny H2S vo vode zostali stabilné počas 24 hodín22 alebo že počas 12 hodín15 boli pozorované iba 2 – 3 % straty H2S, ale neposkytli podporné údaje ani podrobnosti o meraní. Dve štúdie ukázali, že malý priemer fliaš na vodu môže minimalizovať odparovanie H2S15,19. Naše výsledky však ukázali, že to môže oddialiť stratu H2S z fľaše na vodu iba o 2 hodiny namiesto 12 – 24 hodín. Obe štúdie poznamenávajú, že predpokladáme, že hladina NaHS v pitnej vode sa nezmenila, pretože sme nepozorovali zmenu farby vody; preto oxidácia H2S vzduchom nebola významná19,20. Prekvapivo táto subjektívna metóda hodnotí stabilitu NaHS vo vode, a nie meria zmenu jeho koncentrácie v priebehu času.
Strata H2S v roztoku NaHS súvisí s pH a teplotou. Ako je uvedené v našej štúdii, rozpúšťanie NaHS vo vode vedie k tvorbe alkalického roztoku50. Keď sa NaHS rozpustí vo vode, tvorba rozpusteného plynu H2S závisí od hodnoty pH6. Čím nižšie je pH roztoku, tým väčší je podiel NaHS prítomného ako molekúl plynu H2S a tým viac sulfidu sa stráca z vodného roztoku11. Žiadna z týchto štúdií neuviedla pH pitnej vody použitej ako rozpúšťadlo pre NaHS. Podľa odporúčaní WHO, ktoré prijala väčšina krajín, by pH pitnej vody malo byť v rozmedzí 6,5 – 8,551. V tomto rozsahu pH sa rýchlosť spontánnej oxidácie H2S zvyšuje približne desaťnásobne13. Rozpúšťanie NaHS vo vode v tomto rozsahu pH bude mať za následok koncentráciu rozpusteného plynu H2S 1 až 22,5 μM, čo zdôrazňuje dôležitosť monitorovania pH vody pred rozpustením NaHS. Okrem toho, teplotný rozsah uvedený vo vyššie uvedenej štúdii (18 – 26 °C) by viedol k zmene koncentrácie rozpusteného plynu H2S v roztoku približne o 10 %, pretože zmeny teploty menia pK1 a malé zmeny pK1 môžu mať významný vplyv na koncentráciu rozpusteného plynu H2S48. Okrem toho tento problém zhoršuje aj dlhé trvanie niektorých štúdií (5 mesiacov)22, počas ktorého sa očakáva veľká variabilita teploty.
Všetky štúdie okrem jednej21 použili 30 μM roztok NaHS v pitnej vode. Na vysvetlenie použitej dávky (t. j. 30 μM) niektorí autori poukázali na to, že NaHS vo vodnej fáze produkuje presne rovnakú koncentráciu plynu H2S a že fyziologický rozsah H2S je 10 až 100 μM, takže táto dávka je vo fyziologickom rozsahu15,16. Iní vysvetlili, že 30 μM NaHS dokáže udržať hladinu H2S v plazme vo fyziologickom rozsahu, t. j. 5 – 300 μM19,20. Uvažujeme koncentráciu NaHS vo vode 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), ktorá bola použitá v niektorých štúdiách na štúdium účinkov H2S. Môžeme vypočítať, že koncentrácia rozpusteného plynu H2S je 14,7 μM, čo je približne 50 % počiatočnej koncentrácie NaHS. Táto hodnota je podobná hodnote vypočítanej inými autormi za rovnakých podmienok13,48.
V našej štúdii podávanie NaHS nezmenilo telesnú hmotnosť; tento výsledok je v súlade s výsledkami iných štúdií u samcov myší22,23 a samcov potkanov18; Dve štúdie však uviedli, že NaSH obnovil zníženú telesnú hmotnosť u nefrektomizovaných potkanov24,26, zatiaľ čo iné štúdie neuviedli vplyv podávania NaSH na telesnú hmotnosť15,16,17,19,20,21,25. Okrem toho v našej štúdii podávanie NaSH neovplyvnilo hladiny močoviny a kreatínchrómu v sére, čo je v súlade s výsledkami inej správy25.
Štúdia zistila, že pridanie NaHS do pitnej vody počas 2 týždňov neovplyvnilo celkové koncentrácie sulfidov v sére u samcov a samíc potkanov. Toto zistenie je v súlade s výsledkami Sen a kol. (16): 8 týždňov liečby 30 μM NaHS v pitnej vode neovplyvnilo hladiny sulfidov v plazme u kontrolných potkanov; uviedli však, že tento zásah obnovil znížené hladiny H2S v plazme myší po nefrektomii. Li a kol. (22) tiež uviedli, že liečba 30 μM NaHS v pitnej vode počas 5 mesiacov zvýšila hladiny voľných sulfidov v plazme u starnúcich myší približne o 26 %. Iné štúdie nezaznamenali zmeny v cirkulujúcej koncentrácii sulfidov po pridaní NaHS do pitnej vody.
Sedem štúdií uviedlo použitie Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, ale neposkytlo ďalšie podrobnosti o hydratačnej vode a päť štúdií neuviedlo zdroj NaHS použitého v ich metódach prípravy17,18,24,25,26. NaHS je hydratovaná molekula a jej obsah hydratačnej vody sa môže líšiť, čo ovplyvňuje množstvo NaHS potrebné na prípravu roztoku danej molarity. Napríklad obsah NaHS v našej štúdii bol NaHS•1,3 H2O. Skutočné koncentrácie NaHS v týchto štúdiách teda môžu byť nižšie ako tie, ktoré boli uvedené.
„Ako môže mať takáto krátkodobá zlúčenina taký dlhotrvajúci účinok?“ položili túto otázku Pozgay a kol.21 pri hodnotení účinkov NaHS na kolitídu u myší. Dúfajú, že budúce štúdie budú schopné odpovedať na túto otázku a špekulujú, že roztoky NaHS môžu obsahovať stabilnejšie polysulfidy okrem H2S a disulfidov, ktoré sprostredkúvajú účinok NaHS21. Ďalšou možnosťou je, že veľmi nízke koncentrácie NaHS zostávajúce v roztoku môžu mať tiež priaznivý účinok. V skutočnosti Olson a kol. poskytli dôkazy o tom, že mikromolárne hladiny H2S v krvi nie sú fyziologické a mali by byť v nanomolárnom rozsahu alebo úplne chýbať13. H2S môže pôsobiť prostredníctvom sulfatácie proteínov, čo je reverzibilná posttranslačná modifikácia, ktorá ovplyvňuje funkciu, stabilitu a lokalizáciu mnohých proteínov52,53,54. V skutočnosti je za fyziologických podmienok približne 10 % až 25 % mnohých pečeňových proteínov sulfylovaných53. Obe štúdie uznávajú rýchlu deštrukciu NaHS19,23, ale prekvapivo uvádzajú, že „koncentráciu NaHS v pitnej vode sme kontrolovali jeho dennou výmenou“.23 Jedna štúdia náhodne uviedla, že „NaHS je štandardný donor H2S a v klinickej praxi sa bežne používa ako náhrada samotného H2S“.18
Vyššie uvedená diskusia ukazuje, že NaHS sa z roztoku stráca prchaním, oxidáciou a fotolýzou, a preto sa predkladajú určité návrhy na zníženie strát H2S z roztoku. Po prvé, odparovanie H2S závisí od rozhrania plyn-kvapalina13 a pH roztoku11; preto, aby sa minimalizovali straty odparovaním, hrdlo fľaše na vodu môže byť čo najmenšie, ako bolo opísané predtým15,19, a pH vody sa môže upraviť na prijateľnú hornú hranicu (t. j. 6,5 – 8,551), aby sa minimalizovali straty odparovaním11. Po druhé, k spontánnej oxidácii H2S dochádza v dôsledku účinkov kyslíka a prítomnosti iónov prechodných kovov v pitnej vode13, takže deoxygenácia pitnej vody argónom alebo dusíkom44,45 a použitie chelátorov kovov37,47 môže znížiť oxidáciu sulfidov. Po tretie, aby sa zabránilo fotorozkladu H2S, fľaše na vodu môžu byť zabalené do hliníkovej fólie; Táto prax platí aj pre materiály citlivé na svetlo, ako je streptozotocín55. Anorganické sulfidové soli (NaHS, Na2S a CaS) sa nakoniec môžu podávať sondou, a nie rozpustené v pitnej vode, ako sa uvádzalo predtým56,57,58; štúdie ukázali, že rádioaktívny sulfid sodný podávaný sondou potkanom sa dobre vstrebáva a distribuuje prakticky do všetkých tkanív59. Doteraz sa vo väčšine štúdií anorganické sulfidové soli podávali intraperitoneálne; táto cesta sa však v klinických podmienkach používa zriedkavo60. Na druhej strane, perorálna cesta je najbežnejšou a preferovanou cestou podávania u ľudí61. Preto odporúčame vyhodnotiť účinky donorov H2S u hlodavcov orálnou sondou.
Obmedzením je, že sme merali sulfid vo vodnom roztoku a sére pomocou metódy MB. Metódy na meranie sulfidov zahŕňajú jódovú titráciu, spektrofotometriu, elektrochemickú metódu (potenciometria, amperometria, coulometrická metóda a amperometrická metóda) a chromatografiu (plynová chromatografia a vysokoúčinná kvapalinová chromatografia), medzi ktorými je najčastejšie používanou metódou spektrofotometrická metóda MB62. Obmedzením metódy MB na meranie H2S v biologických vzorkách je, že meria všetky zlúčeniny obsahujúce síru a nie voľný H2S63, pretože sa vykonáva v kyslých podmienkach, čo vedie k extrakcii síry z biologického zdroja64. Podľa Americkej asociácie verejného zdravia je však MB štandardnou metódou na meranie sulfidov vo vode65. Toto obmedzenie preto neovplyvňuje naše hlavné výsledky týkajúce sa nestability roztokov obsahujúcich NaHS. Okrem toho v našej štúdii bola výťažnosť meraní sulfidov vo vzorkách vody a séra obsahujúcich NaHS 91 % a 93 %. Tieto hodnoty sú v súlade s predtým hlásenými rozsahmi (77–92)66, čo naznačuje prijateľnú analytickú presnosť42. Stojí za zmienku, že sme použili samce aj samice potkanov v súlade s pokynmi Národných inštitútov zdravia (NIH), aby sme sa v predklinických štúdiách vyhli nadmernému spoliehaniu sa na štúdie na zvieratách iba so samcami67 a aby sme do štúdií zahrnuli samce aj samice potkanov, kedykoľvek je to možné68. Tento bod zdôraznili aj iní69,70,71.
Záverom možno povedať, že výsledky tejto štúdie naznačujú, že roztoky NaHS pripravené z pitnej vody nemožno použiť na výrobu H2S kvôli ich nestabilite. Táto cesta podania by vystavila zvieratá nestabilným a nižším ako očakávaným hladinám NaHS; preto zistenia nemusia byť aplikovateľné na ľudí.
Súbory údajov použité a/alebo analyzované počas aktuálnej štúdie sú k dispozícii od príslušného autora na základe odôvodnenej žiadosti.
Szabo, K. Časová os výskumu sírovodíka (H2S): od environmentálneho toxínu k biologickému mediátoru. Biochemistry and Pharmacology 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. a Kimura, H. Možná úloha sírovodíka ako endogénneho neuromodulátora. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. a Papapetropoulos, A. Fyziologická úloha sírovodíka v bunkách, tkanivách a orgánoch cicavcov. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB a Kashfi, K. Vyvíjajúci sa potenciál bunkových systémov na dodávanie oxidu dusnatého a sírovodíka: nová éra personalizovanej medicíny. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. a kol. Dlhodobé podávanie donoru sírovodíka s pomalým uvoľňovaním môže zabrániť poškodeniu myokardu ischémiou/reperfúziou. Vedecké správy 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM a Hermann, A. Fosforylácia BK kanála reguluje citlivosť na sírovodík (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM a Hermann, A. Sírovodík zvyšuje aktivitu draslíkových (BK) kanálov aktivovaných vápnikom v nádorových bunkách hypofýzy potkanov. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. a kol. Sírovodík zvyšuje ochranný účinok dusitanov proti poškodeniu myokardu ischémiou-reperfúziou u potkanov s diabetom 2. typu. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. a kol. Trendy v chémii donorov H2S a jej vplyv na kardiovaskulárne ochorenia. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF a Olson, KR (2012). Pasívne straty sírovodíka v biologických experimentoch. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. a kol. Chemické aspekty meraní sírovodíka vo fyziologických vzorkách. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometrické stanovenie sírovodíka v prírodných vodách. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktický výcvik v chémii a biológii sírovodíka. „Antioxidanty.“ Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).