Predtým sme informovali o tom, že sérové ​​hladiny tryptofánového metabolitu indol-3-propiónovej kyseliny (IPA) pochádzajúceho z čreva sú nižšie u pacientov s fibrózou pečene. V tejto štúdii sme skúmali transkriptóm a DNA metylóm v obéznych pečeniach vo vzťahu k sérovým hladinám IPA, ako aj úlohu IPA pri indukcii fenotypovej inaktivácie pečeňových stelátových buniek (HSC) in vitro.
Štúdia zahŕňala 116 obéznych pacientov bez diabetu mellitus 2. typu (DM2) (vek 46,8 ± 9,3 rokov; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), ktorí podstúpili bariatrickú operáciu v Bariatrickom chirurgickom centre v Kuopiu (KOBS). Hladiny cirkulujúceho IPA boli merané kvapalinovou chromatografiou s hmotnostnou spektrometriou (LC-MS), analýza pečeňových transkriptómov bola vykonaná sekvenovaním celkovej RNA a analýza metylácie DNA bola vykonaná pomocou Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Na experimenty in vitro boli použité ľudské pečeňové stelátové bunky (LX-2).
Hladiny IPA v sére korelovali s expresiou génov zapojených do apoptotických, mitofagických a dlhovekých dráh v pečeni. Gén AKT serín/treonínkinázy 1 (AKT1) bol najpočetnejším a dominantným interagujúcim génom v profiloch pečeňových transkriptov a metylácie DNA. Liečba IPA indukovala apoptózu, znížila mitochondriálne dýchanie a zmenila morfológiu buniek a mitochondriálnu dynamiku moduláciou expresie génov, o ktorých je známe, že regulujú fibrózu, apoptózu a prežitie buniek LX-2.
Tieto údaje spoločne podporujú tvrdenie, že IPA má potenciálne terapeutické účinky a môže indukovať apoptózu a posunúť fenotyp HSC smerom k neaktívnemu stavu, čím sa rozširuje možnosť inhibície fibrózy pečene interferenciou s aktiváciou HSC a metabolizmom mitochondrií.
Prevalencia obezity a metabolického syndrómu sa spája s rastúcim výskytom metabolicky asociovaného tukového ochorenia pečene (MASLD); toto ochorenie postihuje 25 % až 30 % bežnej populácie [1]. Hlavným dôsledkom etiológie MASLD je fibróza pečene, dynamický proces charakterizovaný neustálou akumuláciou fibróznej extracelulárnej matrice (ECM) [2]. Hlavnými bunkami zapojenými do fibrózy pečene sú pečeňové stelátové bunky (HSC), ktoré vykazujú štyri známe fenotypy: kľudové, aktivované, inaktivované a senescentné [3, 4]. HSC sa môžu aktivovať a transdiferencovať z kľudovej formy na proliferatívne bunky podobné fibroblastom s vysokými energetickými nárokmi, so zvýšenou expresiou α-hladkého svalového aktínu (α-SMA) a kolagénu typu I (Col-I) [5, 6]. Počas zvrátenia fibrózy pečene sa aktivované HSC eliminujú apoptózou alebo inaktiváciou. Tieto procesy zahŕňajú downreguláciu fibrogénnych génov a moduláciu prosurvivalných génov (ako sú signálne dráhy NF-κB a PI3K/Akt) [7, 8], ako aj zmeny v mitochondriálnej dynamike a funkcii [9].
Zistilo sa, že sérové ​​hladiny metabolitu tryptofánu, kyseliny indol-3-propiónovej (IPA), produkovanej v čreve, sú znížené pri metabolických ochoreniach u ľudí vrátane MASLD [10–13]. IPA sa spája s príjmom vlákniny, je známy svojimi antioxidačnými a protizápalovými účinkami a zmierňuje fenotyp nealkoholickej steatohepatitídy (NASH) in vivo a in vitro [11–14]. Niektoré dôkazy pochádzajú z našej predchádzajúcej štúdie, ktorá preukázala, že sérové ​​hladiny IPA boli nižšie u pacientov s fibrózou pečene ako u obéznych pacientov bez fibrózy pečene v štúdii Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Okrem toho sme ukázali, že liečba IPA môže znížiť expresiu génov, ktoré sú klasickými markermi bunkovej adhézie, migrácie buniek a aktivácie hematopoetických kmeňových buniek v modeli ľudských pečeňových stelátových buniek (LX-2) a je potenciálnym hepatoprotektívnym metabolitom [15]. Zostáva však nejasné, ako IPA indukuje regresiu fibrózy pečene aktiváciou apoptózy HSC a mitochondriálnej bioenergetiky.
V tejto štúdii demonštrujeme, že sérový IPA je spojený s expresiou génov obohatených o dráhy apoptózy, mitofágie a dlhovekosti v pečeni obéznych jedincov bez diabetu 2. typu (KOBS). Okrem toho sme zistili, že IPA môže indukovať klírens a degradáciu aktivovaných hematopoetických kmeňových buniek (HSC) prostredníctvom inaktivačnej dráhy. Tieto výsledky odhaľujú novú úlohu IPA, vďaka čomu sa stáva potenciálnym terapeutickým cieľom na podporu regresie fibrózy pečene.
Predchádzajúca štúdia v kohorte KOBS ukázala, že pacienti s fibrózou pečene mali nižšie hladiny IPA v krvnom obehu v porovnaní s pacientmi bez fibrózy pečene [15]. Aby sme vylúčili potenciálny mätúci vplyv diabetu 2. typu, do štúdie sme zaradili 116 obéznych pacientov bez diabetu 2. typu (priemerný vek ± SD: 46,8 ± 9,3 rokov; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabuľka 1) z prebiehajúcej štúdie KOBS ako študijnú populáciu [16]. Všetci účastníci poskytli písomný informovaný súhlas a protokol štúdie bol schválený etickou komisiou nemocnice North Savo County Hospital v súlade s Helsinskou deklaráciou (54/2005, 104/2008 a 27/2010).
Vzorky biopsie pečene boli odobraté počas bariatrickej chirurgie a histologicky vyhodnotené skúsenými patológmi podľa predtým opísaných kritérií [17, 18]. Hodnotiace kritériá sú zhrnuté v doplnkovej tabuľke S1 a boli opísané predtým [19].
Vzorky séra nalačno boli analyzované metódou necielenej kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou (LC-MS) na metabolomickú analýzu (n = 116). Vzorky boli analyzované pomocou systému UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Nemecko), ako bolo opísané predtým19. Identifikácia izopropylalkoholu (IPA) bola založená na retenčnom čase a porovnaní MS/MS spektra s čistými štandardmi. Intenzita signálu IPA (plocha píku) bola braná do úvahy vo všetkých ďalších analýzach [20].
Sekvenovanie celej pečeňovej RNA sa uskutočnilo pomocou Illumina HiSeq 2500 a údaje boli predspracované podľa predtým opísaného postupu [19, 21, 22]. Cielenú analýzu diferenciálnej expresie transkriptov ovplyvňujúcich mitochondriálnu funkciu/biogenézu sme vykonali s použitím 1957 génov vybraných z databázy MitoMiner 4.0 [23]. Analýza metylácie pečeňovej DNA sa uskutočnila pomocou Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) s použitím rovnakej metodiky, ako bola opísaná predtým [24, 25].
Ľudské pečeňové stelátové bunky (LX-2) boli láskavo poskytnuté prof. Stefanom Romeom a boli kultivované a udržiavané v médiu DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Na výber pracovnej dávky IPA boli bunky LX-2 ošetrené rôznymi koncentráciami IPA (10 μM, 100 μM a 1 mM; Sigma, 220027) v médiu DMEM/F12 počas 24 hodín. Okrem toho, na preskúmanie schopnosti IPA inaktivovať HSC boli bunky LX-2 súčasne ošetrené 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) a 1 mM IPA v médiu bez séra počas 24 hodín. Pre zodpovedajúce kontrolné vehikulá sa na ošetrenie TGF-β1 použil 4 nM HCL obsahujúci 0,1 % BSA a na ošetrenie IPA sa použilo 0,05 % DMSO a obe sa použili spoločne na kombinovanú liečbu.
Apoptóza sa hodnotila pomocou súpravy FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit so 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, kat. č. 640922) podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, LX-2 (1 × 105 buniek/jamka) sa kultivovali cez noc v 12-jamkových platniach a potom sa ošetrili viacerými dávkami IPA alebo IPA a TGF-β1. Nasledujúci deň sa zozbierali plávajúce a adherentné bunky, trypsinizovali, premyli PBS, resuspendovali vo väzbovom pufri pre Annexin V a inkubovali s FITC-Annexin V a 7-AAD počas 15 minút.
Mitochondrie v živých bunkách boli farbené na oxidačnú aktivitu pomocou Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Pre MTR testy boli bunky LX-2 inkubované pri rovnakých hustotách s IPA a TGF-β1. Po 24 hodinách boli živé bunky trypsinizované, premyté PBS a potom inkubované so 100 μM MTR v bezsérovom médiu pri teplote 37 °C počas 20 minút, ako bolo opísané predtým [26]. Pre analýzu morfológie živých buniek bola veľkosť buniek a cytoplazmatická komplexnosť analyzovaná pomocou parametrov dopredného rozptylu (FSC) a bočného rozptylu (SSC).
Všetky údaje (30 000 udalostí) boli získané pomocou softvéru NovoCyte Quanteon (Agilent) a analyzované pomocou softvéru NovoExpress® 1.4.1 alebo FlowJo V.10.
Miera spotreby kyslíka (OCR) a extracelulárna miera acidifikácie (ECAR) boli merané v reálnom čase pomocou analyzátora extracelulárneho toku Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) vybaveného systémom Seahorse XF Cell Mito Stress podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, 2 × 104 buniek LX-2/jamka bolo nasadených na kultivačné platne XF96. Po inkubácii cez noc boli bunky ošetrené izopropanolom (IPA) a TGF-β1 (doplnkové metódy 1). Analýza údajov bola vykonaná pomocou softvéru Seahorse XF Wave, ktorý obsahuje generátor správ o fenotypovom teste energie buniek Seahorse XF. Z tohto indexu bol vypočítaný index bioenergetického zdravia (BHI) [27].
Celková RNA bola transkribovaná do cDNA. Konkrétne metódy sú uvedené v odkaze [15]. Ako konštitutívne génové kontroly boli použité hladiny mRNA ľudského 60S ribozomálneho kyslého proteínu P0 (RPLP0) a cyklofilínu A1 (PPIA). Použil sa systém QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, Holandsko) so súpravou TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) alebo súpravou Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) a relatívna expresia génov bola vypočítaná pomocou porovnávacích parametrov cyklovania hodnôt Ct (ΔΔCt) a metódy ∆∆Ct. Podrobnosti o primeroch sú uvedené v doplnkových tabuľkách S2 a S3.
Jadrová DNA (ncDNA) a mitochondriálna DNA (mtDNA) boli extrahované pomocou súpravy DNeasy blood and tissue kit (Qiagen), ako bolo opísané predtým [28]. Relatívne množstvo mtDNA bolo vypočítané výpočtom pomeru každej cieľovej oblasti mtDNA ku geometrickému priemeru troch oblastí jadrovej DNA (mtDNA/ncDNA), ako je podrobne uvedené v doplnkových metódach 2. Podrobnosti o primeroch pre mtDNA a ncDNA sú uvedené v doplnkovej tabuľke S4.
Živé bunky boli farbené farbivom Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) na vizualizáciu medzibunkových a intracelulárnych mitochondriálnych sietí. Bunky LX-2 (1 × 104 buniek/jamka) boli kultivované na sklenených podložných sklíčkach v zodpovedajúcich kultivačných platniach so skleneným dnom (Ibidi GmbH, Martinsried, Nemecko). Po 24 hodinách boli živé bunky LX-2 inkubované so 100 μM MTR počas 20 minút pri teplote 37 °C a bunkové jadrá boli farbené DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich), ako bolo opísané predtým [29]. Mitochondriálne siete boli vizualizované pomocou inverzného mikroskopu Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Nemecko) vybaveného konfokálnym modulom Zeiss LSM 800 pri teplote 37 °C vo vlhkej atmosfére s 5 % CO2 s použitím objektívu 63×NA 1,3. Pre každý typ vzorky sme získali desať snímok série Z. Každá séria Z obsahuje 30 rezov, každý s hrúbkou 9,86 μm. Pre každú vzorku boli získané snímky desiatich rôznych zorných polí pomocou softvéru ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Nemecko) a analýza mitochondriálnej morfológie bola vykonaná pomocou softvéru ImageJ (v1.54d) [30, 31] podľa parametrov podrobne uvedených v doplnkových metódach 3.
Bunky boli fixované 2 % glutaraldehydom v 0,1 M fosfátovom pufri, následne fixované 1 % roztokom oxidu osmia (Sigma Aldrich, MO, USA), postupne dehydratované acetónom (Merck, Darmstadt, Nemecko) a nakoniec zaliate do epoxidovej živice. Boli pripravené ultratenké rezy a farbené 1 % uranylacetátom (Merck, Darmstadt, Nemecko) a 1 % citrátom olovnatým (Merck, Darmstadt, Nemecko). Ultraštrukturálne snímky boli získané pomocou transmisného elektrónového mikroskopu JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokio, Japonsko) pri urýchľovacom napätí 80 kV.
Morfológia buniek LX-2 ošetrených IPA počas 24 hodín bola analyzovaná fázovo-kontrastnou mikroskopiou pri 50-násobnom zväčšení s použitím inverzného svetelného mikroskopu Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 a AxioCam MRm, Jena, Nemecko).
Klinické údaje boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka alebo medián (interkvartilný rozsah: IQR). Na porovnanie rozdielov medzi tromi študijnými skupinami bola použitá jednofaktorová analýza rozptylu (spojité premenné) alebo χ² test (kategorické premenné). Na korekciu viacnásobného testovania bola použitá miera falošne pozitívnych výsledkov (FDR) a gény s FDR < 0,05 boli považované za štatisticky významné. Na koreláciu metylácie CpG DNA s intenzitou IPA signálu bola použitá Spearmanova korelačná analýza s uvedenou nominálnou hodnotou p (p < 0,05).
Analýza dráhy sa vykonala pomocou webového nástroja na analýzu génových súborov (WebGestalt) pre 268 transkriptov (nominálne p < 0,01), 119 transkriptov asociovaných s mitochondriami (nominálne p < 0,05) a 4350 CpG z 3093 pečeňových transkriptov, ktoré boli asociované s hladinami IPA v krvnom sére. Na nájdenie prekrývajúcich sa génov sa použil voľne dostupný nástroj Venny DB (verzia 2.1.0) a na vizualizáciu interakcií proteín-proteín sa použil StringDB (verzia 11.5).
V experimente LX-2 boli vzorky testované na normálnosť pomocou D'Agostino-Pearsonovho testu. Údaje boli získané z najmenej troch biologických replikátov a podrobené jednofaktorovej ANOVA s Bonferroniho post hoc testom. Hodnota p menej ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú. Údaje sú prezentované ako priemer ± SD a počet experimentov je uvedený na každom obrázku. Všetky analýzy a grafy boli vykonané pomocou štatistického softvéru GraphPad Prism 8 pre Windows (GraphPad Software Inc., verzia 8.4.3, San Diego, USA).
Najprv sme skúmali súvislosť hladín IPA v sére s transkriptmi v pečeni, celom tele a mitochondriách. V celkovom profile transkriptov bol najsilnejším génom asociovaným s hladinami IPA v sére MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogénom aktivovaná proteínkináza aktivovaná proteínkináza 3); v profile transkriptov súvisiacich s mitochondriami bol najsilnejšie asociovaným génom AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serín/treonínkináza 1) (Doplnkový súbor 1 a Doplnkový súbor 2).
Následne sme analyzovali globálne transkripty (n = 268; p < 0,01) a transkripty spojené s mitochondriami (n = 119; p < 0,05), pričom sme nakoniec identifikovali apoptózu ako najvýznamnejšiu kanonickú dráhu (p = 0,0089). V prípade mitochondriálnych transkriptov spojených s hladinami IPA v sére sme sa zamerali na apoptózu (FDR = 0,00001), mitofágiu (FDR = 0,00029) a signálne dráhy TNF (FDR = 0,000006) (obrázok 1A, tabuľka 2 a doplnkové obrázky 1A-B).
Analýza prekrývajúcich sa globálnych transkriptov asociovaných s mitochondriami a metylácie DNA v ľudskej pečeni v súvislosti s hladinami IPA v sére. A predstavuje 268 globálnych transkriptov, 119 transkriptov asociovaných s mitochondriami a transkriptov metylovanej DNA, ktoré sú mapované na 3092 CpG miest asociovaných s hladinami IPA v sére (hodnoty p < 0,01 pre globálne transkripty a metylovanú DNA a hodnoty p < 0,05 pre mitochondriálne transkripty). Hlavné prekrývajúce sa transkripty sú zobrazené v strede (AKT1 a YKT6). B Interakčná mapa 13 génov s najvyšším skóre interakcie (0,900) s inými génmi bola zostavená z 56 prekrývajúcich sa génov (oblasť čiernej čiary), ktoré boli významne asociované s hladinami IPA v sére pomocou online nástroja StringDB. Zelená: Gény mapované na bunkovú zložku Gene Ontology (GO): mitochondrie (GO:0005739). AKT1 je proteín s najvyšším skóre (0,900) pre interakcie s inými proteínmi na základe údajov (na základe text miningu, experimentov, databáz a koexpresie). Uzly siete predstavujú proteíny a hrany predstavujú spojenia medzi proteínmi.
Keďže metabolity črevnej mikrobioty môžu regulovať epigenetické zloženie prostredníctvom metylácie DNA [32], skúmali sme, či hladiny IPA v sére súvisia s metyláciou DNA v pečeni. Zistili sme, že dve hlavné metylačné miesta spojené s hladinami IPA v sére sa nachádzajú v blízkosti oblasti 3 bohatej na prolín-serín (C19orf55) a člena 6 rodiny proteínov tepelného šoku B (malý) (HSPB6) (dodatočný súbor 3). Metylácia DNA 4350 CpG (p < 0,01) korelovala s hladinami IPA v sére a bola obohatená o regulačné dráhy dlhovekosti (p = 0,006) (obrázok 1A, tabuľka 2 a doplnkový obrázok 1C).
Aby sme pochopili biologické mechanizmy, ktoré sú základom súvislostí medzi hladinami IPA v sére, globálnymi transkriptmi, transkriptmi asociovanými s mitochondriami a metyláciou DNA v ľudskej pečeni, vykonali sme analýzu prekrývania génov identifikovaných v predchádzajúcej analýze dráhy (obrázok 1A). Výsledky analýzy obohatenia dráhy 56 prekrývajúcich sa génov (vo vnútri čiernej čiary na obrázku 1A) ukázali, že dráha apoptózy (p = 0,00029) zvýraznila dva gény spoločné pre tri analýzy: AKT1 a YKT6 (homológ YKT6 v-SNARE), ako je znázornené na Vennovom diagrame (doplnkový obrázok 2 a obrázok 1A). Je zaujímavé, že sme zistili, že AKT1 (cg19831386) a YKT6 (cg24161647) pozitívne korelovali s hladinami IPA v sére (doplnkový súbor 3). Na identifikáciu potenciálnych proteínových interakcií medzi génovými produktmi sme ako vstup vybrali 13 génov s najvyšším skóre spoločnej oblasti (0,900) spomedzi 56 prekrývajúcich sa génov a vytvorili sme mapu interakcií. Podľa úrovne spoľahlivosti (hraničnej spoľahlivosti) bol gén AKT1 s najvyšším skóre (0,900) na vrchole (obrázok 1B).
Na základe analýzy dráhy sme zistili, že apoptóza bola hlavnou dráhou, a preto sme skúmali, či liečba IPA ovplyvní apoptózu HSC in vitro. Predtým sme preukázali, že rôzne dávky IPA (10 μM, 100 μM a 1 mM) boli netoxické pre bunky LX-2 [15]. Táto štúdia ukázala, že liečba IPA v koncentrácii 10 μM a 100 μM zvýšila počet životaschopných a nekrotických buniek. V porovnaní s kontrolnou skupinou sa však životaschopnosť buniek pri koncentrácii 1 mM IPA znížila, zatiaľ čo miera nekrózy buniek zostala nezmenená (obrázok 2A, B). Aby sme našli optimálnu koncentráciu na vyvolanie apoptózy v bunkách LX-2, testovali sme 10 μM, 100 μM a 1 mM IPA počas 24 hodín (obrázok 2A-E a doplnkový obrázok 3A-B). Je zaujímavé, že IPA 10 μM a 100 μM znížili mieru apoptózy (%), avšak IPA 1 mM zvýšila neskorú apoptózu a mieru apoptózy (%) v porovnaní s kontrolnou skupinou, a preto bola vybraná pre ďalšie experimenty (obrázky 2A–D).
IPA indukuje apoptózu buniek LX-2. Na kvantifikáciu miery apoptózy a morfológie buniek prietokovou cytometriou sa použila metóda dvojitého farbenia annexinom V a 7-AAD. Bunky BA sa inkubovali s 10 μM, 100 μM a 1 mM IPA počas 24 hodín alebo s F–H TGF-β1 (5 ng/ml) a 1 mM IPA v bezsérovom médiu počas 24 hodín. A: živé bunky (annexín V -/ 7AAD-); B: nekrotické bunky (annexín V -/ 7AAD+); C, F: skoré (annexín V +/ 7AAD-); D, G: neskoré (annexín V+/7AAD.+); E, H: percento celkových skorých a neskorých apoptotických buniek v miere apoptózy (%). Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD, n = 3 nezávislé experimenty. Štatistické porovnania sa uskutočnili pomocou jednofaktorovej ANOVA s Bonferroniho post hoc testom. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Ako sme už predtým ukázali, 5 ng/ml TGF-β1 môže indukovať aktiváciu HSC zvýšením expresie klasických markerových génov [15]. Bunky LX-2 boli ošetrené kombináciou 5 ng/ml TGF-β1 a 1 mM IPA (Obr. 2E–H). Liečba TGF-β1 nezmenila mieru apoptózy, avšak spoločná liečba IPA zvýšila neskorú apoptózu a mieru apoptózy (%) v porovnaní s liečbou TGF-β1 (Obr. 2E–H). Tieto výsledky naznačujú, že 1 mM IPA môže podporovať apoptózu v bunkách LX-2 nezávisle od indukcie TGF-β1.
Ďalej sme skúmali vplyv IPA na mitochondriálne dýchanie v bunkách LX-2. Výsledky ukázali, že 1 mM IPA znížil parametre spotreby kyslíka (OCR): nemitochondriálne dýchanie, bazálne a maximálne dýchanie, únik protónov a produkciu ATP v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 3A, B), zatiaľ čo index bioenergetického zdravia (BHI) sa nezmenil.
IPA znižuje mitochondriálne dýchanie v bunkách LX-2. Krivka mitochondriálneho dýchania (OCR) je prezentovaná ako parametre mitochondriálneho dýchania (nemitochondriálne dýchanie, bazálne dýchanie, maximálne dýchanie, únik protónov, tvorba ATP, SRC a BHI). Bunky A a B boli inkubované s 10 μM, 100 μM a 1 mM IPA počas 24 hodín. Bunky C a D boli inkubované s TGF-β1 (5 ng/ml) a 1 mM IPA v bezsérovom médiu počas 24 hodín. Všetky merania boli normalizované na obsah DNA pomocou súpravy CyQuant. BHI: index bioenergetického zdravia; SRC: respiračná rezervná kapacita; OCR: rýchlosť spotreby kyslíka. Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD), n = 5 nezávislých experimentov. Štatistické porovnania boli vykonané pomocou jednofaktorovej ANOVA a Bonferroniho post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; a ***p < 0,001
Pre komplexnejšie pochopenie vplyvu IPA na bioenergetický profil buniek LX-2 aktivovaných TGF-β1 sme analyzovali mitochondriálnu oxidačnú fosforyláciu pomocou OCR (Obr. 3C,D). Výsledky ukázali, že liečba TGF-β1 mohla znížiť maximálne dýchanie, respiračnú rezervnú kapacitu (SRC) a BHI v porovnaní s kontrolnou skupinou (Obr. 3C,D). Okrem toho kombinovaná liečba znížila bazálne dýchanie, únik protónov a produkciu ATP, ale SRC a BHI boli významne vyššie ako u buniek liečených TGF-β1 (Obr. 3C,D).
Taktiež sme vykonali „Test fenotypu bunkovej energie“ poskytovaný softvérom Seahorse (doplnkový obrázok 4A–D). Ako je znázornené na doplnkovom obrázku 3B, metabolické potenciály OCR aj ECAR sa po liečbe TGF-β1 znížili, avšak v skupinách s kombinovanou liečbou a liečbou IPA sa v porovnaní s kontrolnou skupinou nepozoroval žiadny rozdiel. Okrem toho sa po kombinovanej liečbe a liečbe IPA v porovnaní s kontrolnou skupinou znížili bazálne aj stresové hladiny OCR (doplnkový obrázok 4C). Je zaujímavé, že podobný vzorec sa pozoroval pri kombinovanej terapii, kde sa v porovnaní s liečbou TGF-β1 nepozorovala žiadna zmena bazálnych a stresových hladín ECAR (doplnkový obrázok 4C). V HSC zníženie mitochondriálnej oxidačnej fosforylácie a schopnosť kombinovanej liečby obnoviť SCR a BHI po expozícii liečbe TGF-β1 nezmenili metabolický potenciál (OCR a ECAR). Tieto výsledky spoločne naznačujú, že IPA môže znižovať bioenergetiku v HSC, čo naznačuje, že IPA môže indukovať nižší energetický profil, ktorý posúva fenotyp HSC smerom k inaktivácii (doplnkový obrázok 4D).
Vplyv IPA na dynamiku mitochondrií bol skúmaný pomocou trojrozmernej kvantifikácie mitochondriálnej morfológie a sieťových prepojení, ako aj farbenia MTR (obrázok 4 a doplnkový obrázok 5). Obrázok 4 ukazuje, že v porovnaní s kontrolnou skupinou liečba TGF-β1 znížila priemernú povrchovú plochu, počet vetiev, celkovú dĺžku vetiev a počet spojov vetiev (obrázok 4A a B) a zmenila podiel mitochondrií zo sférickej na strednú morfológiu (obrázok 4C). Iba liečba IPA znížila priemerný objem mitochondrií a zmenila podiel mitochondrií zo sférickej na strednú morfológiu v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 4A). Naproti tomu sféricita, priemerná dĺžka vetiev a mitochondriálna aktivita hodnotená pomocou MTR závislého od mitochondriálneho membránového potenciálu (obrázok 4A a E) zostali nezmenené a tieto parametre sa medzi skupinami nelíšili. Tieto výsledky spoločne naznačujú, že liečba TGF-β1 a IPA zrejme moduluje tvar a veľkosť mitochondrií, ako aj komplexnosť siete v živých bunkách LX-2.
IPA mení mitochondriálnu dynamiku a množstvo mitochondriálnej DNA v bunkách LX-2. A. Reprezentatívne konfokálne snímky živých buniek LX-2 inkubovaných s TGF-β1 (5 ng/ml) a 1 mM IPA počas 24 hodín v médiu bez séra, zobrazujúce mitochondriálne siete zafarbené s Mitotracker™ Red CMXRos a jadrá zafarbené na modro s DAPI. Všetky údaje obsahovali najmenej 15 snímok na skupinu. Pre každý typ vzorky sme získali 10 snímok Z-stack. Každá sekvencia na osi Z obsahovala 30 rezov, každý s hrúbkou 9,86 μm. Mierka: 10 μm. B. Reprezentatívne objekty (iba mitochondrie) identifikované aplikáciou adaptívneho prahovania na snímku. Kvantitatívna analýza a porovnanie prepojení mitochondriálnej morfologickej siete boli vykonané pre všetky bunky v každej skupine. C. Frekvencia pomerov tvarov mitochondrií. Hodnoty blízke 0 označujú sférické tvary a hodnoty blízke 1 označujú vláknité tvary. D Obsah mitochondriálnej DNA (mtDNA) bol stanovený podľa popisu v časti Materiály a metódy. Analýza E Mitotracker™ Red CMXRos sa uskutočnila prietokovou cytometriou (30 000 udalostí) podľa popisu v časti Materiály a metódy. Údaje sú prezentované ako priemer ± SD, n = 3 nezávislé experimenty. Štatistické porovnania sa uskutočnili pomocou jednofaktorovej ANOVA a Bonferroniho post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Následne sme analyzovali obsah mtDNA v bunkách LX-2 ako indikátor počtu mitochondrií. V porovnaní s kontrolnou skupinou bol obsah mtDNA v skupine liečenej TGF-β1 zvýšený (obrázok 4D). V porovnaní so skupinou liečenou TGF-β1 bol obsah mtDNA v skupine s kombinovanou liečbou znížený (obrázok 4D), čo naznačuje, že IPA môže znižovať obsah mtDNA a pravdepodobne aj počet mitochondrií, ako aj mitochondriálne dýchanie (obrázok 3C). Okrem toho sa zdá, že IPA znižuje obsah mtDNA v kombinovanej liečbe, ale neovplyvňuje mitochondriálnu aktivitu sprostredkovanú MTR (obrázky 4A–C).
Skúmali sme súvislosť IPA s hladinami mRNA génov spojených s fibrózou, apoptózou, prežitím a mitochondriálnou dynamikou v bunkách LX-2 (obrázok 5A–D). V porovnaní s kontrolnou skupinou vykazovala skupina liečená TGF-β1 zvýšenú expresiu génov, ako je reťazec kolagénu typu I α2 (COL1A2), α-aktín hladkého svalstva (αSMA), matrixová metaloproteináza 2 (MMP2), tkanivový inhibítor metaloproteinázy 1 (TIMP1) a gén podobný dynamínu 1 (DRP1), čo naznačuje zvýšenú fibrózu a aktiváciu. Okrem toho v porovnaní s kontrolnou skupinou liečba TGF-β1 znížila hladiny mRNA nukleárneho receptora pregnánu X (PXR), kaspázy 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibítora B-buniek α, zosilňovača ľahkého peptidu génu nukleárneho faktora κ (NFκB1A) a inhibítora podjednotky kinázy nukleárneho faktora κB β (IKBKB) (obrázok 5A–D). V porovnaní s liečbou TGF-β1, kombinovaná liečba s TGF-β1 a IPA znížila expresiu COL1A2 a MMP2, ale zvýšila hladiny mRNA PXR, TIMP1, B-bunkového lymfómu-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β a IKBKB. Liečba IPA významne znížila expresiu MMP2, proteínu X asociovaného s Bcl-2 (BAX), AKT1, proteínu optickej atrofie 1 (OPA1) a mitochondriálneho fúzneho proteínu 2 (MFN2), zatiaľ čo expresia CASP8, NFκB1A, NFκB1B a IKBKB bola v porovnaní s kontrolnou skupinou zvýšená. Nezistil sa však žiadny rozdiel v expresii kaspázy-3 (CASP3), faktora aktivujúceho apoptotickú peptidázu 1 (APAF1), mitochondriálneho fúzneho proteínu 1 (MFN1) a štiepneho proteínu 1 (FIS1). Tieto výsledky spoločne naznačujú, že liečba IPA moduluje expresiu génov spojených s fibrózou, apoptózou, prežitím a mitochondriálnou dynamikou. Naše údaje naznačujú, že liečba IPA znižuje fibrózu v bunkách LX-2; zároveň stimuluje prežitie posunom fenotypu smerom k inaktivácii.
IPA moduluje expresiu fibroblastových, apoptotických, životaschopných a mitochondriálnych dynamikálnych génov v bunkách LX-2. Histogramy zobrazujú expresiu mRNA v porovnaní s endogénnou kontrolou (RPLP0 alebo PPIA) po indukcii buniek LX-2 s TGF-β1 a IPA v bezsérovom médiu počas 24 hodín. A označuje fibroblasty, B označuje apoptotické bunky, C označuje prežívajúce bunky a D označuje expresiu génov mitochondriálnej dynamiky. Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD), n = 3 nezávislé experimenty. Štatistické porovnania boli vykonané pomocou jednofaktorovej ANOVA a Bonferroniho post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Následne boli zmeny veľkosti buniek (FSC-H) a cytoplazmatickej komplexnosti (SSC-H) hodnotené prietokovou cytometriou (obrázok 6A, B) a zmeny morfológie buniek po liečbe IPA boli hodnotené transmisnou elektrónovou mikroskopiou (TEM) a fázovo kontrastnou mikroskopiou (doplnkový obrázok 6A-B). Ako sa očakávalo, bunky v skupine liečenej TGF-β1 sa zväčšili v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 6A, B), čo vykazuje klasickú expanziu drsného endoplazmatického retikula (ER*) a fagolyzozómov (P), čo naznačuje aktiváciu hematopoetických kmeňových buniek (HSC) (doplnkový obrázok 6A). V porovnaní so skupinou liečenou TGF-β1 sa však veľkosť buniek, cytoplazmatická komplexnosť (obr. 6A, B) a obsah ER* znížili v skupine liečenej kombinovanou liečbou TGF-β1 a IPA (doplnkový obrázok 6A). Okrem toho liečba IPA znížila veľkosť buniek, cytoplazmatickú komplexnosť (obrázky 6A, B), obsah P a ER* (doplnkový obrázok 6A) v porovnaní s kontrolnou skupinou. Okrem toho sa obsah apoptotických buniek zvýšil po 24 hodinách liečby IPA v porovnaní s kontrolnou skupinou (biele šípky, doplnkový obrázok 6B). Tieto výsledky spoločne naznačujú, že 1 mM IPA môže stimulovať apoptózu HSC a zvrátiť zmeny morfologických parametrov buniek indukované TGF-β1, čím reguluje veľkosť a komplexnosť buniek, čo môže súvisieť s inaktiváciou HSC.
IPA mení veľkosť buniek a cytoplazmatickú komplexnosť v bunkách LX-2. Reprezentatívne obrázky analýzy prietokovou cytometriou. Analýza použila stratégiu hradlovania špecifickú pre bunky LX-2: SSC-A/FSC-A na definovanie bunkovej populácie, FSC-H/FSC-A na identifikáciu dubletov a SSC-H/FSC-H na analýzu veľkosti a komplexnosti buniek. Bunky boli inkubované s TGF-β1 (5 ng/ml) a 1 mM IPA v médiu bez séra počas 24 hodín. Bunky LX-2 boli rozdelené do ľavého dolného kvadrantu (SSC-H-/FSC-H-), ľavého horného kvadrantu (SSC-H+/FSC-H-), pravého dolného kvadrantu (SSC-H-/FSC-H+) a pravého horného kvadrantu (SSC-H+/FSC-H+) na analýzu veľkosti buniek a cytoplazmatickej komplexnosti. B. Morfológia buniek bola analyzovaná prietokovou cytometriou s použitím FSC-H (priamy rozptyl, veľkosť buniek) a SSC-H (bočný rozptyl, cytoplazmatická komplexnosť) (30 000 udalostí). Údaje sú prezentované ako priemer ± SD, n = 3 nezávislé experimenty. Štatistické porovnania boli vykonané pomocou jednofaktorovej ANOVA a Bonferroniho post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 a ****p < 0,0001
Črevné metabolity, ako napríklad IPA, sa stali horúcou témou výskumu, čo naznačuje, že v črevnej mikrobiote by sa mohli objaviť nové ciele. Je preto zaujímavé, že IPA, metabolit, ktorý sme spojili s fibrózou pečene u ľudí [15], sa v zvieracích modeloch ukázal ako potenciálna antifibrotická zlúčenina [13, 14]. V tejto štúdii po prvýkrát demonštrujeme súvislosť medzi sérovým IPA a globálnou transkriptomikou pečene a metyláciou DNA u obéznych jedincov bez diabetu 2. typu (T2D), pričom zdôrazňujeme apoptózu, mitofágiu a dlhovekosť, ako aj možný kandidátsky gén AKT1 regulujúci homeostázu pečene. Ďalšou novinkou našej štúdie je, že sme preukázali interakciu liečby IPA s apoptózou, bunkovou morfológiou, mitochondriálnou bioenergetikou a dynamikou v bunkách LX-2, čo naznačuje nižšie energetické spektrum, ktoré posúva fenotyp HSC smerom k inaktivácii, vďaka čomu je IPA potenciálnym kandidátom na zlepšenie fibrózy pečene.
Zistili sme, že apoptóza, mitofágia a dlhovekosť boli najdôležitejšími kanonickými dráhami obohatenými o pečeňové gény spojené s cirkulujúcim sérovým IPA. Narušenie systému kontroly kvality mitochondrií (MQC) môže viesť k mitochondriálnej dysfunkcii, mitofágii a apoptóze, čím podporuje výskyt MASLD [33, 34]. Preto môžeme špekulovať, že IPA môže byť zapojený do udržiavania bunkovej dynamiky a mitochondriálnej integrity prostredníctvom apoptózy, mitofágie a dlhovekosti v pečeni. Naše údaje ukázali, že dva gény boli spoločné vo všetkých troch testoch: YKT6 a AKT1. Stojí za zmienku, že YKT6 je proteín SNARE zapojený do procesu fúzie bunkových membrán. Zohráva úlohu v autofágii a mitofágii tvorbou iniciačného komplexu s STX17 a SNAP29 na autofagozóme, čím podporuje fúziu autofagozómov a lyzozómov [35]. Okrem toho strata funkcie YKT6 vedie k zhoršenej mitofágii [36], zatiaľ čo zvýšená regulácia YKT6 je spojená s progresiou hepatocelulárneho karcinómu (HCC), čo vykazuje zvýšené prežitie buniek [37]. Na druhej strane, AKT1 je najdôležitejší interagujúci gén a hrá dôležitú úlohu pri ochoreniach pečene, vrátane signálnej dráhy PI3K/AKT, bunkového cyklu, migrácie buniek, proliferácie, fokálnej adhézie, mitochondriálnej funkcie a sekrécie kolagénu [38–40]. Aktivovaná signálna dráha PI3K/AKT môže aktivovať hematopoetické kmeňové bunky (HSC), čo sú bunky zodpovedné za produkciu extracelulárnej matrice (ECM), a jej dysregulácia môže prispievať k výskytu a progresii fibrózy pečene [40]. Okrem toho je AKT jedným z kľúčových faktorov prežitia buniek, ktorý inhibuje apoptózu buniek závislú od p53, a aktivácia AKT môže byť spojená s inhibíciou apoptózy pečeňových buniek [41, 42]. Získané výsledky naznačujú, že IPA môže byť zapojený do apoptózy spojenej s mitochondriami pečene tým, že ovplyvňuje rozhodnutie hepatocytov o vstupe do apoptózy alebo prežití. Tieto účinky môžu byť regulované kandidátskymi génmi AKT a/alebo YKT6, ktoré sú kritické pre homeostázu pečene.
Naše výsledky ukázali, že 1 mM IPA indukoval apoptózu a znížil mitochondriálne dýchanie v bunkách LX-2 nezávisle od liečby TGF-β1. Je pozoruhodné, že apoptóza je hlavnou cestou pre rozlíšenie fibrózy a aktiváciu hematopoetických kmeňových buniek (HSC) a je tiež kľúčovou udalosťou v reverzibilnej fyziologickej odpovedi na fibrózu pečene [4, 43]. Obnova BHI v bunkách LX-2 po kombinovanej liečbe navyše poskytla nové poznatky o potenciálnej úlohe IPA v regulácii mitochondriálnej bioenergetiky. V pokojových a neaktívnych podmienkach hematopoetické bunky normálne využívajú mitochondriálnu oxidačnú fosforyláciu na produkciu ATP a majú nízku metabolickú aktivitu. Na druhej strane, aktivácia HSC zvyšuje mitochondriálne dýchanie a biosyntézu, aby kompenzovala energetické nároky vstupu do glykolytického stavu [44]. Skutočnosť, že IPA neovplyvnil metabolický potenciál a ECAR, naznačuje, že glykolytická dráha je menej prioritná. Podobne iná štúdia ukázala, že 1 mM IPA bol schopný modulovať aktivitu mitochondriálneho respiračného reťazca v kardiomyocytoch, bunkovej línii ľudských hepatocytov (Huh7) a endotelových bunkách ľudskej pupočníkovej žily (HUVEC); Nezistil sa však žiadny vplyv IPA na glykolýzu v kardiomyocytoch, čo naznačuje, že IPA môže ovplyvniť bioenergetiku iných typov buniek [45]. Preto predpokladáme, že 1 mM IPA môže pôsobiť ako mierny chemický rozpojovač, pretože môže významne znížiť expresiu fibrogénnych génov, morfológiu buniek a mitochondriálnu bioenergetiku bez zmeny množstva mtDNA [46]. Mitochondriálne rozpojovače môžu inhibovať fibrózu indukovanú kultúrou a aktiváciu HSC [47] a znižovať produkciu mitochondriálneho ATP regulovanú alebo indukovanú určitými proteínmi, ako sú rozpojovacie proteíny (UCP) alebo adenínnukleotidová translokáza (ANT). V závislosti od typu bunky môže tento jav chrániť bunky pred apoptózou a/alebo podporovať apoptózu [46]. Na objasnenie úlohy IPA ako mitochondriálneho rozpojovača pri inaktivácii hematopoetických kmeňových buniek sú však potrebné ďalšie štúdie.
Následne sme skúmali, či sa zmeny v mitochondriálnom dýchaní odrážajú v mitochondriálnej morfológii živých buniek LX-2. Je zaujímavé, že liečba TGF-β1 mení mitochondriálny podiel zo sférického na stredný, so zníženým mitochondriálnym vetvením a zvýšenou expresiou DRP1, kľúčového faktora v mitochondriálnom štiepení [48]. Okrem toho je fragmentácia mitochondrií spojená s celkovou komplexnosťou siete a prechod z fúzie na štiepenie je kritický pre aktiváciu hematopoetických kmeňových buniek (HSC), zatiaľ čo inhibícia mitochondriálneho štiepenia vedie k apoptóze HSC [49]. Naše výsledky teda naznačujú, že liečba TGF-β1 môže vyvolať zníženie komplexnosti mitochondriálnej siete so zníženým vetvením, čo je častejšie pri mitochondriálnom štiepení spojenom s aktivovanými hematopoetickými kmeňovými bunkami (HSC). Naše údaje ďalej ukázali, že IPA by mohla zmeniť podiel mitochondrií zo sférického na stredný tvar, čím by sa znížila expresia OPA1 a MFN2. Štúdie ukázali, že zníženie regulácie OPA1 by mohlo spôsobiť zníženie mitochondriálneho membránového potenciálu a spustiť apoptózu buniek [50]. Je známe, že MFN2 sprostredkováva mitochondriálnu fúziu a apoptózu [51]. Získané výsledky naznačujú, že indukcia buniek LX-2 pomocou TGF-β1 a/alebo IPA zrejme moduluje tvar a veľkosť mitochondrií, ako aj stav aktivácie a komplexnosť siete.
Naše výsledky naznačujú, že kombinovaná liečba TGFβ-1 a IPA by mohla znížiť mtDNA a morfologické parametre buniek reguláciou expresie mRNA génov fibrózy, apoptózy a génov súvisiacich s prežitím v bunkách vyhýbajúcich sa apoptóze. IPA skutočne znížila hladinu expresie mRNA AKT1 a dôležitých génov fibrózy, ako sú COL1A2 a MMP2, ale zvýšila hladinu expresie CASP8, ktorý je spojený s apoptózou. Naše výsledky ukázali, že po liečbe IPA sa expresia BAX znížila a expresia mRNA podjednotiek rodiny TIMP1, BCL-2 a NF-κB zvýšila, čo naznačuje, že IPA by mohla stimulovať signály prežitia v hematopoetických kmeňových bunkách (HSC), ktoré sa vyhýbajú apoptóze. Tieto molekuly môžu pôsobiť ako signály podporujúce prežitie v aktivovaných hematopoetických kmeňových bunkách, čo môže byť spojené so zvýšenou expresiou antiapoptotických proteínov (ako je Bcl-2), zníženou expresiou proapoptotického BAX a komplexnou interakciou medzi TIMP a NF-κB [5, 7]. IPA uplatňuje svoje účinky prostredníctvom PXR a zistili sme, že kombinovaná liečba s TGF-β1 a IPA zvýšila hladiny expresie mRNA PXR, čo naznačuje potlačenie aktivácie HSC. Je známe, že aktivovaná signalizácia PXR inhibuje aktiváciu HSC in vivo aj in vitro [52, 53]. Naše výsledky naznačujú, že IPA sa môže podieľať na odstraňovaní aktivovaných HSC podporou apoptózy, redukciou fibrózy a mitochondriálneho metabolizmu a zosilnením signálov prežitia, čo sú typické procesy, ktoré premieňajú aktivovaný fenotyp HSC na inaktivovaný. Ďalším možným vysvetlením potenciálneho mechanizmu a úlohy IPA pri apoptóze je, že vychytáva dysfunkčné mitochondrie primárne prostredníctvom mitofágie (vnútorná dráha) a vonkajšej signálnej dráhy TNF (Tabuľka 1), ktorá je priamo spojená so signálnou dráhou prežitia NF-κB (Doplnkový obrázok 7). Je zaujímavé, že gény obohatené o IPA sú schopné indukovať proapoptotické a pro-prežívacie signály v apoptotickej dráhe [54], čo naznačuje, že IPA môže indukovať apoptotickú dráhu alebo prežitie interakciou s týmito génmi. Avšak, ako IPA indukuje apoptózu alebo prežitie počas aktivácie HSC a jej mechanistické dráhy zostávajú nejasné.
IPA je mikrobiálny metabolit, ktorý vzniká z tryptofánu v potrave prostredníctvom črevnej mikrobioty. Štúdie preukázali, že má protizápalové, antioxidačné a epigenetické regulačné vlastnosti v črevnom prostredí.[55] Štúdie preukázali, že IPA dokáže modulovať funkciu črevnej bariéry a znižovať oxidačný stres, čo môže prispievať k jeho lokálnym fyziologickým účinkom.[56] V skutočnosti sa IPA transportuje do cieľových orgánov prostredníctvom krvného obehu a keďže IPA má podobnú štruktúru hlavných metabolitov s tryptofánom, serotonínom a derivátmi indolu, IPA vykonáva metabolické účinky, ktoré vedú ku kompetitívnemu metabolickému osudu.[52] IPA môže súťažiť s metabolitmi odvodenými od tryptofánu o väzbové miesta na enzýmoch alebo receptoroch, čo môže potenciálne narušiť normálne metabolické dráhy. To zdôrazňuje potrebu ďalších štúdií jeho farmakokinetiky a farmakodynamiky, aby sa lepšie pochopilo jeho terapeutické okno.[57] Zostáva sa len uvidieť, či sa to môže vyskytnúť aj v hematopoetických kmeňových bunkách (HSC).
Uznávame, že naša štúdia má určité obmedzenia. Aby sme špecificky preskúmali súvislosti súvisiace s IPA, vylúčili sme pacientov s diabetes mellitus 2. typu (DM2). Uznávame, že to obmedzuje širokú použiteľnosť našich zistení na pacientov s diabetes mellitus 2. typu a pokročilým ochorením pečene. Hoci fyziologická koncentrácia IPA v ľudskom sére je 1 – 10 μM [11, 20], koncentrácia 1 mM IPA bola zvolená na základe najvyššej netoxickej koncentrácie [15] a najvyššej miery apoptózy, bez rozdielu v percentuálnom zastúpení populácie nekrotických buniek. Hoci sa v tejto štúdii použili suprafyziologické hladiny IPA, v súčasnosti neexistuje konsenzus o účinnej dávke IPA [52]. Hoci sú naše výsledky významné, širší metabolický osud IPA zostáva aktívnou oblasťou výskumu. Navyše, naše zistenia o súvislosti medzi hladinami IPA v sére a metyláciou DNA pečeňových transkriptov boli získané nielen z hematopoetických kmeňových buniek (HSC), ale aj z tkanív pečene. Na základe našich predchádzajúcich zistení z analýzy transkriptómov, že IPA súvisí s aktiváciou hematopoetických kmeňových buniek (HSC) [15] a HSC sú hlavnými bunkami zapojenými do progresie fibrózy pečene, sme sa rozhodli použiť ľudské bunky LX-2. Pečeň sa skladá z viacerých typov buniek, preto by sa pri štúdiu úlohy IPA a jej interakcie s inými typmi pečeňových buniek mali zvážiť aj iné bunkové modely, ako napríklad systém kokultivácie hepatocytov-HSC-imunitných buniek v kombinácii s aktiváciou kaspázy a fragmentáciou DNA, ako aj mechanizmus účinku vrátane hladiny proteínov.