Rôzne teórie obrany rastlín poskytujú dôležité teoretické vodítko pre vysvetlenie vzorcov špecializovaného metabolizmu rastlín, ale ich kľúčové predpovede je ešte potrebné overiť. V tejto štúdii sme použili nestrannú tandemovú hmotnostnú spektrometriu (MS/MS) na systematické preskúmanie metabolómu kmeňov tabaku atenuovaných z jednotlivých rastlín na populácie a blízko príbuzné druhy a spracovali sme veľké množstvo teórií hmotnostnej spektrometrie založených na zložených spektrách v informáciách. Rámec na testovanie kľúčových predpovedí teórií optimálnej obrany (OD) a pohyblivého cieľa (MT). Informačná zložka metabolomiky rastlín je v súlade s teóriou OD, ale protirečí hlavnej predikcii teórie MT o dynamike metabolomiky spôsobenej bylinožravcami. Od mikro až po makro evolučnú úroveň bol signál jasmonátu identifikovaný ako hlavný determinant OD, zatiaľ čo signál etylénu poskytol jemné doladenie reakcie špecifickej pre bylinožravce anotovanej molekulárnou sieťou MS/MS.
Špeciálne metabolity s rôznorodými štruktúrami sú hlavnými účastníkmi adaptácie rastlín na prostredie, najmä pri obrane pred nepriateľmi (1). Úžasná diverzifikácia špeciálneho metabolizmu nachádzajúceho sa v rastlinách stimulovala desaťročia hĺbkového výskumu jeho mnohých aspektov ekologických funkcií a vytvorila dlhý zoznam teórií obrany rastlín, ktoré predstavujú evolučný a ekologický vývoj interakcií medzi rastlinami a hmyzom. Empirický výskum poskytuje dôležité usmernenie (2). Tieto teórie obrany rastlín však nesledovali normatívnu cestu hypotetického deduktívneho uvažovania, v ktorom boli kľúčové predpovede na rovnakej úrovni analýzy (3) a boli experimentálne testované s cieľom posunúť sa vpred v ďalšom cykle teoretického vývoja (4). Technické obmedzenia obmedzujú zber údajov na špecifické metabolické kategórie a vylučujú komplexnú analýzu špecializovaných metabolitov, čím bránia porovnaniam medzi kategóriami, ktoré sú nevyhnutné pre teoretický vývoj (5). Nedostatok komplexných metabolomických údajov a spoločnej meny na porovnanie pracovného postupu spracovania metabolického priestoru medzi rôznymi skupinami rastlín bráni vedeckej zrelosti tejto oblasti.
Najnovší vývoj v oblasti metabolomiky tandemovej hmotnostnej spektrometrie (MS/MS) dokáže komplexne charakterizovať metabolické zmeny v rámci a medzi druhmi daného systémového kladu a možno ho kombinovať s výpočtovými metódami na výpočet štrukturálnej podobnosti medzi týmito komplexnými zmesami. Predchádzajúce znalosti chémie (5). Kombinácia pokročilých technológií v analýze a výpočtovej technike poskytuje nevyhnutný rámec pre dlhodobé testovanie mnohých predpovedí ekologických a evolučných teórií metabolickej diverzity. Shannon (6) prvýkrát predstavil teóriu informácie vo svojom zásadnom článku v roku 1948, čím položil základy pre matematickú analýzu informácie, ktorá sa používa v mnohých iných oblastiach ako jej pôvodná aplikácia. V genomike sa teória informácie úspešne aplikovala na kvantifikáciu konzervatívnej informácie o sekvenciách (7). V transkriptomickom výskume teória informácie analyzuje celkové zmeny v transkriptóme (8). V predchádzajúcom výskume sme aplikovali štatistický rámec teórie informácie na metabolomiku, aby sme opísali metabolickú expertízu na úrovni tkanív v rastlinách (9). V tejto štúdii kombinujeme pracovný postup založený na MS/MS so štatistickým rámcom informačnej teórie, charakterizovanej metabolickou diverzitou v spoločnej mene, aby sme porovnali kľúčové predpovede teórie obrany rastlín metabolómu indukovaného bylinožravcami.
Teoretické rámce obrany rastlín sú zvyčajne vzájomne inkluzívne a možno ich rozdeliť do dvoch kategórií: tie, ktoré sa snažia vysvetliť distribúciu rastlinne špecifických metabolitov na základe obranných funkcií, ako je napríklad teória optimálnej obrany (OD) (10), teória pohyblivého cieľa (MT) (11) a teória vzhľadu (12), zatiaľ čo iné hľadajú mechanické vysvetlenia toho, ako zmeny v dostupnosti zdrojov ovplyvňujú rast rastlín a akumuláciu špecializovaných metabolitov, ako je hypotéza uhlíkovo-živinovej bilancie (13), hypotéza rýchlosti rastu (14) a hypotéza rovnováhy rastu a diferenciácie (15). Tieto dva súbory teórií sú na rôznych úrovniach analýzy (4). Dve teórie zahŕňajúce obranné funkcie na funkčnej úrovni však dominujú diskusii o konštitutívnej a indukovateľnej obrane rastlín: teória OD, ktorá predpokladá, že rastliny investujú do svojej drahej chemickej obrany iba vtedy, keď je to potrebné, napríklad keď sú požité. Keď trávnatý živočích napadne, preto sa podľa možnosti budúceho útoku priradí zlúčenina s obrannou funkciou (10); Hypotéza MT predpokladá, že neexistuje os smerovej zmeny metabolitov, ale metabolit sa mení náhodne, čím sa vytvára možnosť prekážať metabolickému „cieľu pohybu“ útočiacich bylinožravcov. Inými slovami, tieto dve teórie prinášajú opačné predpovede o metabolickej prestavbe, ku ktorej dochádza po útoku bylinožravcov: vzťah medzi jednosmernou akumuláciou metabolitov s obrannou funkciou (OD) a neriadenými metabolickými zmenami (MT) (11).
Hypotézy OD a MT zahŕňajú nielen indukované zmeny v metabolóme, ale aj ekologické a evolučné dôsledky akumulácie týchto metabolitov, ako sú adaptívne náklady a prínosy týchto metabolických zmien v špecifickom ekologickom prostredí (16). Hoci obe hypotézy uznávajú obrannú funkciu špecializovaných metabolitov, ktorá môže, ale nemusí byť drahá, kľúčová predpoveď, ktorá odlišuje hypotézy OD a MT, spočíva v smerovaní indukovaných metabolických zmien. Predpoveď teórie OD si doteraz získala najväčšiu experimentálnu pozornosť. Tieto testy zahŕňajú štúdium priamych alebo nepriamych obranných funkcií rôznych tkanív špecifických zlúčenín v skleníkoch a prírodných podmienkach, ako aj zmeny vo vývojovom štádiu rastlín (17-19). Avšak doteraz, vzhľadom na nedostatok pracovného postupu a štatistického rámca pre globálnu komplexnú analýzu metabolickej diverzity akéhokoľvek organizmu, hlavný rozdiel v predikcii medzi týmito dvoma teóriami (t. j. smer metabolických zmien) ešte len treba overiť. Tu uvádzame takúto analýzu.
Jednou z najvýznamnejších charakteristík rastlinne špecifických metabolitov je ich extrémna štrukturálna diverzita na všetkých úrovniach, od jednotlivých rastlín, populácií až po podobné druhy (20). Na úrovni populácie možno pozorovať mnoho kvantitatívnych zmien v špecializovaných metabolitoch, zatiaľ čo na úrovni druhov sa zvyčajne zachovávajú silné kvalitatívne rozdiely (20). Preto je metabolická diverzita rastlín hlavným aspektom funkčnej diverzity, ktorá odráža prispôsobivosť rôznym výklenkom, najmä tým s rôznymi možnosťami invázie špeciálnym hmyzom a bežnými bylinožravcami (21). Od Fraenkelovho (22) prelomového článku o dôvodoch existencie rastlinne špecifických metabolitov sa interakcie s rôznym hmyzom považujú za dôležité selekčné tlaky a predpokladá sa, že tieto interakcie formovali rastliny počas evolúcie. Metabolická dráha (23). Medzidruhové rozdiely v diverzite špecializovaných metabolitov môžu tiež odrážať fyziologickú rovnováhu spojenú s konštitutívnou a indukovateľnou obranou rastlín proti bylinožravým stratégiám, pretože tieto dva druhy sú často navzájom negatívne korelované (24). Hoci môže byť prospešné udržiavať dobrú obranu za každých okolností, včasné metabolické zmeny spojené s obranou poskytujú jasné výhody, pretože umožňujú rastlinám alokovať cenné zdroje na iné fyziologické investície (19, 24) a vyhnúť sa potrebe symbiózy. Vedľajšie poškodenie (25). Okrem toho tieto reorganizácie špecializovaných metabolitov spôsobené bylinožravcami hmyzu môžu viesť k deštruktívnemu rozdeleniu v populácii (26) a môžu odrážať priame čítanie podstatných prirodzených zmien v signáli kyseliny jasmónovej (JA), ktoré sa môžu v populácii udržiavať. Vysoké a nízke signály JA sú kompromisom medzi obranou proti bylinožravcom a konkurenciou so špecifickými druhmi (27). Okrem toho špecializované biosyntetické dráhy metabolitov počas evolúcie prechádzajú rýchlou stratou a transformáciou, čo vedie k nerovnomernému metabolickému rozdeleniu medzi blízko príbuznými druhmi (28). Tieto polymorfizmy sa môžu rýchlo vytvoriť v reakcii na meniace sa vzorce bylinožravcov (29), čo znamená, že fluktuácia spoločenstiev bylinožravcov je kľúčovým faktorom, ktorý ovplyvňuje metabolickú heterogenitu.
V tejto práci sme konkrétne riešili nasledujúce problémy. (I) Ako bylinožravý hmyz rekonfiguruje rastlinný metabolóm? (Ii) Aké sú hlavné informačné zložky metabolickej plasticity, ktoré možno kvantifikovať na testovanie predpovedí teórie dlhodobej obrany? (Iii) Či preprogramovať rastlinný metabolóm spôsobom jedinečným pre útočníka, ak áno, akú úlohu zohráva rastlinný hormón pri prispôsobovaní špecifickej metabolickej odpovede a ktoré metabolity prispievajú k druhovej špecifickosti obrany? (Iv) Keďže predpovede mnohých obranných teórií možno rozšíriť na všetky úrovne biologických tkanív, pýtali sme sa, aká konzistentná je spôsobená metabolická odpoveď od vnútorného po medzidruhové porovnanie? Za týmto účelom sme systematicky študovali listový metabolom nikotínu v tabaku, čo je ekologická modelová rastlina s bohatým špecializovaným metabolizmom, ktorá je účinná proti larvám dvoch pôvodných bylinožravcov, Lepidoptera Datura (Ms) (veľmi agresívny, prevažne konzumovaný). Na ľuľkonočných a spodoptera littoralis (Sl) sú bavlníkové červy akýmsi „rodom“ s hostiteľskými rastlinami ľuľkovitých a inými hostiteľmi iných rodov a čeľadí. Rastlinná potrava. Analyzovali sme MS/MS metabolomické spektrum a extrahovali sme štatistické deskriptory informačnej teórie na porovnanie teórií OD a MT. Vytvorili sme mapy špecifickosti na odhalenie identity kľúčových metabolitov. Analýza bola rozšírená na pôvodnú populáciu N. nasi a blízko príbuzných druhov tabaku, aby sme ďalej analyzovali kovarianciu medzi signalizáciou rastlinných hormónov a indukciou OD.
Aby sme získali celkovú mapu plasticity a štruktúry listového metabolómu bylinožravého tabaku, použili sme predtým vyvinutý analytický a výpočtový pracovný postup na komplexný zber a dekonvoluciu MS/MS spektier nezávislých od dát s vysokým rozlíšením z rastlinných extraktov (9). Táto nediferencovaná metóda (nazývaná MS/MS) dokáže zostaviť neredundantné spektrá zlúčenín, ktoré sa potom môžu použiť pre všetky tu opísané analýzy na úrovni zlúčenín. Tieto dekonvoluované rastlinné metabolity sú rôznych typov a pozostávajú zo stoviek až tisícok metabolitov (tu približne 500 – 1 000 s/MS/MS). V tejto štúdii uvažujeme metabolickú plasticitu v rámci teórie informácií a kvantifikujeme diverzitu a profesionalitu metabolómu na základe Shannonovej entropie metabolického frekvenčného rozdelenia. Pomocou predtým implementovaného vzorca (8) sme vypočítali súbor indikátorov, ktoré možno použiť na kvantifikáciu diverzity metabolómu (indikátor Hj), špecializácie metabolického profilu (indikátor δj) a metabolickej špecifickosti jedného metabolitu (indikátor Si). Okrem toho sme na kvantifikáciu indukovateľnosti metabolómu u bylinožravcov použili index relatívnej plasticity vzdialenosti (RDPI) (Obrázok 1A) (30). V rámci tohto štatistického rámca považujeme spektrum MS/MS za základnú informačnú jednotku a spracovávame relatívnu abundanciu MS/MS do mapy frekvenčného rozdelenia a potom pomocou Shannonovej entropie odhadujeme diverzitu metabolómu z nej. Špecializácia metabolómu sa meria priemernou špecifickosťou jedného spektra MS/MS. Preto sa zvýšenie abundancie niektorých tried MS/MS po indukcii u bylinožravcov transformuje na spektrálnu indukovateľnosť, RDPI a špecializáciu, teda zvýšenie indexu δj, pretože sa produkuje viac špecializovaných metabolitov a produkuje sa vysoký index Si. Zníženie indexu diverzity Hj odráža, že buď sa znižuje počet generovaných MS/MS, alebo sa frekvenčné rozdelenie profilu mení menej rovnomerným smerom, pričom sa znižuje jeho celková neistota. Výpočtom Si indexu je možné zdôrazniť, ktoré MS/MS sú indukované určitými bylinožravcami, a naopak, ktoré MS/MS na indukciu nereagujú, čo je kľúčový ukazovateľ na rozlíšenie predikcie MT a OD.
(A) Štatistické deskriptory používané pre indukovateľnosť dát (RDPI), diverzitu (index Hj), špecializáciu (index δj) a špecifickosť metabolitov (index Si) u bylinožravcov (H1 až Hx). Zvýšenie stupňa špecializácie (δj) naznačuje, že v priemere sa bude produkovať viac metabolitov špecifických pre bylinožravce, zatiaľ čo zníženie diverzity (Hj) naznačuje pokles produkcie metabolitov alebo nerovnomerné rozloženie metabolitov v distribučnej mape. Hodnota Si hodnotí, či je metabolit špecifický pre daný stav (tu bylinožravce) alebo naopak, či sa udržiava na rovnakej úrovni. (B) Koncepčný diagram predikcie obrannej teórie s použitím osi informačnej teórie. Teória OD predpovedá, že útok bylinožravcov zvýši počet obranných metabolitov, čím sa zvýši δj. Zároveň sa Hj znižuje, pretože profil je reorganizovaný smerom k zníženej neistote metabolických informácií. Teória MT predpovedá, že útok bylinožravcov spôsobí nesmerové zmeny v metabolóme, čím sa zvýši Hj ako indikátor zvýšenej neistoty metabolických informácií a spôsobí náhodné rozloženie Si. Navrhli sme tiež zmiešaný model, najlepší MT, v ktorom niektoré metabolity s vyššími obrannými hodnotami budú obzvlášť zvýšené (vysoká hodnota Si), zatiaľ čo iné vykazujú náhodné reakcie (nižšia hodnota Si).
Pomocou deskriptorov informačnej teórie interpretujeme teóriu OD tak, že predpovedáme, že zmeny špeciálnych metabolitov vyvolané bylinožravcami v neindukovanom konštitutívnom stave povedú k (i) zvýšeniu metabolickej špecifickosti (index Si), čoho výsledkom bude metabonomická špecifickosť (index δj) (zvýšenie) určitých skupín špeciálnych metabolitov s vyššou obrannou hodnotou a (ii) zníženiu diverzity metabolómu (index Hj) v dôsledku zmeny distribúcie metabolickej frekvencie smerom k väčšej distribúcii leptínových teliesok. Na úrovni jedného metabolitu sa očakáva usporiadaná distribúcia Si, kde metabolit zvýši hodnotu Si podľa svojej obrannej hodnoty (obrázok 1B). V tomto duchu vysvetľujeme teóriu MT tak, že predpovedáme, že excitácia povedie k (i) nesmerovým zmenám v metabolitoch, čo povedie k zníženiu indexu δj, a (ii) zvýšeniu indexu Hj v dôsledku zvýšenia metabolickej neistoty alebo náhodnosti, ktorú možno kvantifikovať Shannonovou entropiou vo forme zovšeobecnenej diverzity. Pokiaľ ide o metabolické zloženie, teória MT predpovedá náhodnú distribúciu Si. Berúc do úvahy, že určité metabolity sú za špecifických podmienok a za špecifických podmienok a iné nie sú za špecifických podmienok a ich obranná hodnota závisí od prostredia, navrhli sme aj model zmiešanej obrany, v ktorom sú δj a Hj rozdelené pozdĺž Si v dvoch smeroch. Zvyšovanie vo všetkých smeroch, iba určité skupiny metabolitov, ktoré majú vyššie obranné hodnoty, zvlášť zvýšia Si, zatiaľ čo iné budú mať náhodné rozdelenie (obrázok 1B).
Aby sme otestovali predikciu predefinovanej obrannej teórie na osi deskriptora informačnej teórie, získali sme expertné (Ms) alebo generalistické (Sl) larvy bylinožravcov na listoch Nepenthes pallens (Obrázok 2A). Pomocou MS/MS analýzy sme získali 599 neredundantných MS/MS spektier (súbor s údajmi S1) z metanolových extraktov listového tkaniva odobratých po kŕmení húseníc. Použitie indexov RDPI, Hj a δj na vizualizáciu rekonfigurácie informačného obsahu v konfiguračných súboroch MS/MS odhaľuje zaujímavé vzory (Obrázok 2B). Celkový trend je taký, že ako je popísané v informačnom deskriptore, ako húsenice pokračujú v konzumácii listov, stupeň všetkej metabolickej reorganizácie sa v priebehu času zvyšuje: 72 hodín po tom, čo bylinožravec najedol, sa RDPI významne zvyšuje. V porovnaní s nepoškodenou kontrolou bol Hj významne znížený, čo bolo spôsobené zvýšeným stupňom špecializácie metabolického profilu, ktorý bol kvantifikovaný indexom δj. Tento zjavný trend je v súlade s predpoveďami teórie OD, ale je v rozpore s hlavnými predpoveďami teórie MT, ktorá sa domnieva, že náhodné (nesmerové) zmeny hladín metabolitov sa používajú ako obranná kamufláž (obrázok 1B). Hoci obsah elicitorov orálnej sekrécie (OS) a stravovacie správanie týchto dvoch bylinožravcov sú odlišné, ich priame kŕmenie viedlo k podobným zmenám v smeroch Hj a δj počas 24-hodinového a 72-hodinového obdobia zberu. Jediný rozdiel sa vyskytol po 72 hodinách RDPI. V porovnaní s metabolizmom spôsobeným kŕmením Ms bol celkový metabolizmus indukovaný kŕmením Sl vyšší.
(A) Experimentálny dizajn: bylinožravce obyčajné (S1) alebo expertné (Ms) sú kŕmené odsolenými listami džbánok, zatiaľ čo pri simulovanej bylinožravosti sa na manipuláciu s prepichnutím štandardizovaných pozícií listov používa OS Ms (W + OSMs). Larvy S1 (W + OSSl) alebo voda (W + W). Kontrola (C) je nepoškodený list. (B) Index indukovateľnosti (RDPI v porovnaní s kontrolnou tabuľkou), diverzity (Hj index) a špecializácie (δj index) vypočítaný pre mapu špeciálnych metabolitov (599 MS/MS; dátový súbor S1). Hviezdičky označujú významné rozdiely medzi priamym kŕmením bylinožravcov a kontrolnou skupinou (Studentov t-test s párovým t-testom, *P<0,05 a ***P<0,001). ns, nie je dôležité. (C) Index časového rozlíšenia hlavného (modrý rámček, aminokyselina, organická kyselina a cukor; dátový súbor S2) a spektra špeciálnych metabolitov (červený rámček 443 MS/MS; dátový súbor S1) po simulovanej bylinožravej liečbe. Farebný pás označuje 95 % interval spoľahlivosti. Hviezdička označuje významný rozdiel medzi liečbou a kontrolou [kvadratická analýza rozptylu (ANOVA), nasledovaná Tukeyho hodnotou štatisticky významného rozdielu (HSD) pre post hoc viacnásobné porovnania, *P<0,05, **P<0,01 a *** P <0,001]. (D) Špecializácia bodových grafov a profilov špeciálnych metabolitov (opakované vzorky s rôznymi ošetreniami).
Aby sme preskúmali, či sa remodelácia vyvolaná bylinožravcami na úrovni metabolómu odráža v zmenách hladiny jednotlivých metabolitov, najprv sme sa zamerali na metabolity, ktoré sme predtým študovali v listoch Nepenthes pallens s preukázanou rezistenciou voči bylinožravcom. Fenolové amidy sú konjugáty hydroxycinnamamidu a polyamínu, ktoré sa akumulujú počas bylinožravého procesu hmyzu a je známe, že znižujú jeho výkonnosť (32). Hľadali sme prekurzory zodpovedajúcich MS/MS a vyniesli sme ich kumulatívne kinetické krivky (obrázok S1). Nie je prekvapujúce, že deriváty fenolu, ktoré nie sú priamo zapojené do obrany proti bylinožravcom, ako je kyselina chlorogénová (CGA) a rutín, sú po bylinožravcoch down-regulované. Naopak, bylinožravce môžu vyrobiť fenolamidy s vysokou účinnosťou. Nepretržité kŕmenie dvoch bylinožravcov viedlo k takmer rovnakému excitačnému spektru fenolamidov a tento vzorec bol obzvlášť zrejmý pri de novo syntéze fenolamidov. Rovnaký jav sa bude pozorovať pri skúmaní dráhy 17-hydroxygeranylnonandiol diterpénových glykozidov (17-HGL-DTG), ktorá produkuje veľké množstvo acyklických diterpénov s účinnými anti-herbivornými funkciami (33), z ktorých kŕmenie Ms pomocou Sl spustilo podobný expresný profil (obrázok S1).
Možnou nevýhodou experimentov s priamym kŕmením bylinožravcami je rozdiel v rýchlosti konzumácie listov a čase kŕmenia bylinožravcov, čo sťažuje elimináciu účinkov špecifických pre bylinožravce spôsobených zraneniami a bylinožravcami. Aby sme lepšie vyriešili druhovú špecifickosť indukovanej metabolickej odpovede listov u bylinožravcov, simulovali sme kŕmenie lariev Ms a Sl okamžitým nanesením čerstvo odobratého OS (OSM a OSS1) na štandardný vpich W v konzistentných polohách listov. Tento postup sa nazýva ošetrenie W + OS a štandardizuje indukciu presným načasovaním nástupu odpovede vyvolanej bylinožravcom bez toho, aby spôsoboval mätúce účinky rozdielov v rýchlosti alebo množstve straty tkaniva (obrázok 2A) (34). Pomocou MS/MS analýzy a výpočtového postupu sme získali 443 MS/MS spektier (dátový súbor S1), ktoré sa prekrývali so spektrami predtým zostavenými z experimentov s priamym kŕmením. Analýza informačnej teórie tohto súboru údajov MS/MS ukázala, že preprogramovanie metabolomov špecializovaných na listy simuláciou bylinožravcov vykazovalo stimuly špecifické pre OS (obrázok 2C). Najmä v porovnaní s liečbou OSS1 spôsobil OSM zvýšenie špecializácie metabolómu po 4 hodinách. Stojí za zmienku, že v porovnaní s experimentálnym súborom údajov o priamej kŕmení bylinožravcami sa metabolická kinetika vizualizovaná v dvojrozmernom priestore pomocou súradníc Hj a δj a smerovosť špecializácie metabolómu v reakcii na simulovanú liečbu bylinožravcami v priebehu času konzistentne zvyšovali (obrázok 2D). Zároveň sme kvantifikovali obsah aminokyselín, organických kyselín a cukrov (súbor s údajmi S2), aby sme zistili, či je toto cielené zvýšenie expertízy metabolómu spôsobené rekonfiguráciou centrálneho metabolizmu uhlíka v reakcii na simulované bylinožravce (obrázok S2). Aby sme tento vzorec lepšie vysvetlili, ďalej sme monitorovali kinetiku metabolickej akumulácie predtým diskutovaných dráh fenolamidu a 17-HGL-DTG. Indukcia bylinožravcov špecifická pre OS sa transformuje do diferenciálneho vzorca preskupenia v rámci metabolizmu fenolamidu (obrázok S3). Fenolické amidy obsahujúce kumarínové a kofeoylové skupiny sú prednostne indukované OSS1, zatiaľ čo OSM spúšťajú špecifickú indukciu ferulylových konjugátov. V prípade dráhy 17-HGL-DTG bola detegovaná diferenciálna indukcia OS produktmi malonylácie a dimalonylácie v následnom reťazci (obrázok S3).
Ďalej sme študovali plasticitu transkriptómu indukovanú OS pomocou súboru údajov z časového mikročipu, ktorý simuluje použitie OSM na ošetrenie listov ružicových rastlín u bylinožravcov. Kinetika odberu vzoriek sa v podstate prekrýva s kinetikou použitou v tejto metabolomickej štúdii (35). V porovnaní s rekonfiguráciou metabolómu, pri ktorej je metabolická plasticita v priebehu času obzvlášť zvýšená, pozorujeme prechodné transkripčné vzplanutia v listoch indukované Ms, kde indukovateľnosť transkriptómu (RDPI) a špecializácia (δj) sú na úrovni 1. V tomto časovom bode došlo k významnému nárastu hodín a diverzity (Hj), expresia BMP1 bola významne znížená, po čom nasledovala relaxácia špecializácie transkriptómu (obrázok S4). Rodiny metabolických génov (ako napríklad P450, glykozyltransferáza a BAHD acyltransferáza) sa podieľajú na procese zostavovania špeciálnych metabolitov zo štrukturálnych jednotiek odvodených z primárneho metabolizmu podľa vyššie uvedeného modelu skorej vysokej špecializácie. Ako prípadová štúdia bola analyzovaná fenylalanínová dráha. Analýza potvrdila, že základné gény v metabolizme fenolamidu sú u bylinožravcov vysoko indukované OS v porovnaní s rastlinami, ktoré nie sú indukované, a ich expresné vzory sú si úzko zladené. Transkripčný faktor MYB8 a štrukturálne gény PAL1, PAL2, C4H a 4CL v predradenej časti tejto dráhy vykazovali skorú iniciáciu transkripcie. Acyltransferázy, ktoré hrajú úlohu v konečnom zostavení fenolamidu, ako napríklad AT1, DH29 a CV86, vykazujú predĺžený vzorec upregulácie (obrázok S4). Vyššie uvedené pozorovania naznačujú, že skorá iniciácia špecializácie transkriptómu a neskoršie zvýšenie metabolomickej špecializácie sú spriahnutým režimom, čo môže byť spôsobené synchrónnym regulačným systémom, ktorý iniciuje silnú obrannú reakciu.
Rekonfigurácia v signalizácii rastlinných hormónov funguje ako regulačná vrstva, ktorá integruje informácie o bylinožravcoch na preprogramovanie fyziológie rastlín. Po simulácii bylinožravcov sme merali kumulatívnu dynamiku kľúčových kategórií rastlinných hormónov a vizualizovali časovú koexpresiu medzi nimi [Pearsonov korelačný koeficient (PCC) > 0,4] (obrázok 3A). Ako sa očakávalo, rastlinné hormóny súvisiace s biosyntézou sú prepojené v rámci siete koexpresie rastlinných hormónov. Okrem toho je do tejto siete namapovaná metabolická špecifickosť (Si index), aby sa zvýraznili rastlinné hormóny indukované rôznymi ošetreniami. Sú znázornené dve hlavné oblasti špecifickej odpovede bylinožravcov: jedna je v klastri JA, kde JA (jeho biologicky aktívna forma JA-Ile) a ďalšie deriváty JA vykazujú najvyššie skóre Si; druhou je etylén (ET). Giberelín vykazoval len mierny nárast špecifickosti pre bylinožravce, zatiaľ čo iné rastlinné hormóny, ako napríklad cytokinín, auxín a kyselina abscisová, mali nízku indukčnú špecifickosť pre bylinožravce. V porovnaní s použitím samotného W + W sa amplifikácia maximálnej hodnoty derivátov JA prostredníctvom aplikácie OS (W + OS) môže v podstate transformovať na silný špecifický indikátor JA. Neočakávane je známe, že OSM a OSS1 s rôznym obsahom elicitorov spôsobujú podobnú akumuláciu JA a JA-Ile. Na rozdiel od OSS1 je OSM špecificky a silne indukovaný OSM, zatiaľ čo OSS1 neamplifikuje odpoveď bazálnych rán (obrázok 3B).
(A) Analýza koexpresnej siete založená na výpočte PCC simulácie kinetiky akumulácie rastlinných hormónov indukovaných bylinožravcami. Uzol predstavuje jeden rastlinný hormón a veľkosť uzla predstavuje index Si špecifický pre rastlinný hormón medzi ošetreniami. (B) Akumulácia JA, JA-Ile a ET v listoch spôsobená rôznymi ošetreniami, ktoré sú označené rôznymi farbami: marhuľová, W + OSM; modrá, W + OSSl; čierna, W + W; sivá, C (kontrola). Hviezdičky označujú významné rozdiely medzi ošetrením a kontrolou (dvojcestná ANOVA nasledovaná Tukey HSD post hoc viacnásobným porovnaním, *** P <0,001). Analýza informačnej teórie (C)697 MS/MS (súbor S1) v biosyntéze JA a zhoršenom spektre vnímania (irAOC a irCOI1) a (D)585 MS/MS (súbor S1) v ETR1 so zhoršeným ET signálom. Dve simulované ošetrenia bylinožravcami spustili čiary rastlín a kontrolné rastliny s prázdnym vehikulom (EV). Hviezdičky označujú významné rozdiely medzi ošetrením W+OS a nepoškodenou kontrolnou skupinou (dvojcestná ANOVA nasledovaná Tukey HSD post hoc viacnásobným porovnaním, *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001). (E) Rozptýlené grafy rozptýleného opozície voči špecializácii. Farby predstavujú rôzne geneticky modifikované kmene; symboly predstavujú rôzne metódy ošetrenia: trojuholník, W + OSS1; obdĺžnik, W + OSM; kruh C
Ďalej sme použili geneticky modifikovaný kmeň atenuovaných Nepenthes (irCOI1 a sETR1) v kľúčových krokoch biosyntézy JA a ET (irAOC a irACO) a vnímania (irCOI1 a sETR1) na analýzu metabolizmu týchto dvoch rastlinných hormónov u bylinožravcov. Relatívny príspevok preprogramovania. V súlade s predchádzajúcimi experimentmi sme potvrdili indukciu bylinožravého OS v rastlinách s prázdnymi nosičmi (EV) (obrázok 3, C až D) a celkový pokles indexu Hj spôsobený OSM, zatiaľ čo index δj sa zvýšil. Reakcia je výraznejšia ako reakcia vyvolaná OSS1. Dvojčiarový graf s použitím Hj a δj ako súradníc ukazuje špecifickú dereguláciu (obrázok 3E). Najzreteľnejším trendom je, že v kmeňoch bez JA signálu sú zmeny diverzity a špecializácie metabolómu spôsobené bylinožravcami takmer úplne eliminované (obrázok 3C). Naproti tomu tiché vnímanie ET u rastlín sETR1, hoci celkový vplyv na zmeny v metabolizme bylinožravcov je oveľa nižší ako vplyv JA signalizácie, zmierňuje rozdiel v indexoch Hj a δj medzi excitáciami OSM a OSS1 (obrázok 3D a obrázok S5). To naznačuje, že okrem základnej funkcie prenosu JA signálu slúži prenos ET signálu aj na jemné doladenie druhovo špecifickej metabolickej odpovede bylinožravcov. V súlade s touto funkciou jemného doladenia nedošlo k žiadnej zmene v celkovej indukovateľnosti metabolómu u rastlín sETR1. Na druhej strane, v porovnaní s rastlinami sETR1, rastliny irACO indukovali podobné celkové amplitúdy metabolických zmien spôsobených bylinožravcami, ale vykazovali významne odlišné skóre Hj a δj medzi expozíciami OSM a OSS1 (obrázok S5).
Aby sme identifikovali špecializované metabolity, ktoré majú dôležitý vplyv na druhovo špecifickú odpoveď bylinožravcov, a doladili ich produkciu prostredníctvom ET signálov, použili sme predtým vyvinutú štrukturálnu MS/MS metódu. Táto metóda sa opiera o metódu bi-klastrovania na opätovné odvodenie metabolickej rodiny z MS/MS fragmentov [normalizovaný skalárny súčin (NDP)] a skóre podobnosti na základe neutrálnej straty (NL). Súbor údajov MS/MS vytvorený analýzou ET transgénnych línií produkoval 585 MS/MS (súbor údajov S1), ktoré boli rozdelené ich klastrovaním do siedmich hlavných MS/MS modulov (M) (obrázok 4A). Niektoré z týchto modulov sú husto zabalené predtým charakterizovanými špeciálnymi metabolitmi: napríklad M1, M2, M3, M4 a M7 sú bohaté na rôzne fenolové deriváty (M1), flavonoidné glykozidy (M2), acylové cukry (M3 a M4) a 17-HGL-DTG (M7). Okrem toho sa vypočítajú metabolicky špecifické informácie (Si index) jedného metabolitu v každom module a jeho distribúcia Si je možné intuitívne vidieť. Stručne povedané, MS/MS spektrá vykazujúce vysokú bylinožravú a genotypovú špecificitu sú charakterizované vysokými hodnotami Si a štatistiky kurtózy naznačujú distribúciu srsti v pravom rohu chvosta. Jedna takáto distribúcia chudého koloidu bola detegovaná v M1, v ktorej fenolamid vykazoval najvyšší podiel Si (obrázok 4B). Vyššie spomínaný bylinožravý indukovateľný 17-HGL-DTG v M7 vykazoval mierne skóre Si, čo naznačuje mierny stupeň diferenciálnej regulácie medzi týmito dvoma typmi OS. Naproti tomu väčšina konštitutívne produkovaných špecializovaných metabolitov, ako je rutín, CGA a acylové cukry, patrí medzi najnižšie skóre Si. Aby sa lepšie preskúmala štrukturálna komplexnosť a distribúcia Si medzi špeciálnymi metabolitmi, bola pre každý modul vytvorená molekulárna sieť (obrázok 4B). Dôležitou predikciou teórie OD (zhrnutej na obrázku 1B) je, že reorganizácia špeciálnych metabolitov po bylinožravcoch by mala viesť k jednosmerným zmenám v metabolitoch s vysokou obrannou hodnotou, najmä zvýšením ich špecifickosti (na rozdiel od náhodného rozdelenia) (režim) Obranný metabolit predpovedaný teóriou MT. Väčšina fenolových derivátov akumulovaných v M1 funkčne súvisí s poklesom výkonnosti hmyzu (32). Pri porovnaní hodnôt Si v metabolitoch M1 medzi indukovanými listami a listami kontrolných rastlín EV po 24 hodinách sme pozorovali, že metabolická špecifickosť mnohých metabolitov po bylinožravcoch má významný rastúci trend (obrázok 4C). Špecifické zvýšenie hodnoty Si bolo zistené iba v obranných fenolamidoch, ale žiadne zvýšenie hodnoty Si nebolo zistené v iných fenoloch a neznámych metabolitoch, ktoré koexistujú v tomto module. Ide o špecializovaný model, ktorý súvisí s teóriou OD. Hlavné predpovede metabolických zmien spôsobených bylinožravcami sú konzistentné. Aby sme otestovali, či táto špecifickosť fenolamidového spektra bola indukovaná OS-špecifickým ET, vyniesli sme index metabolitu Si a spôsobili rozdielnu hodnotu expresie medzi OSM a OSS1 v genotypoch EV a sETR1 (obrázok 4D). V sETR1 bol rozdiel medzi OSM a OSS1 indukovaný fenamidom výrazne znížený. Metóda bi-klastrovania bola tiež použitá na údaje MS/MS zozbierané v kmeňoch s nedostatočným JA na odvodenie hlavných MS/MS modulov súvisiacich s JA-regulovanou metabolickou špecializáciou (obrázok S6).
(A) Výsledky zhlukovania 585 MS/MS na základe zdieľaného fragmentu (podobnosť NDP) a zdieľanej neutrálnej straty (podobnosť NL) vedú k tomu, že modul (M) je konzistentný so známou rodinou zlúčenín alebo s neznámym alebo slabo metabolizovaným zložením metabolitov. Vedľa každého modulu je zobrazené špecifické rozloženie metabolitov (MS/MS) (Si). (B) Modulárna molekulárna sieť: Uzly predstavujú MS/MS a hrany, NDP (červená) a NL (modrá) skóre MS/MS (hraničná hodnota > 0,6). Stupňovitý index špecifickosti metabolitov (Si) je zafarbený na základe modulu (vľavo) a namapovaný na molekulárnu sieť (vpravo). (C) Modul M1 EV rastliny v konštitutívnom (kontrola) a indukovanom stave (simulovaný bylinožravec) po 24 hodinách: diagram molekulárnej siete (hodnota Si je veľkosť uzla, obranný fenolamid je zvýraznený modrou farbou). (D) Diagram molekulárnej siete M1 spektrálnej čiary sETR1 so zhoršeným vnímaním EV a ET: fenolová zlúčenina znázornená zeleným kruhovým uzlom a významný rozdiel (hodnota P) medzi ošetreniami W + OSM a W + OSS1 ako veľkosť uzla. CP, N-kafeoyl-tyrozín; CS, N-kafeoyl-spermidín; FP, ester kyseliny N-ferulovej s kyselinou močovou; FS, N-ferulyl-spermidín; CoP, N', N “-kumarolyl-tyrozín; DCS, N', N”-dikafeoyl-spermidín; CFS, N', N”-kafeoyl, feruloyl-spermidín; Lycium barbarum v kustovnici druhu Son; Nick. O-AS, O-acylový cukor.
Analýzu sme ďalej rozšírili z jediného atenuovaného genotypu Nepenthes na prirodzené populácie, kde boli predtým opísané silné vnútrodruhové zmeny v hladinách JA u bylinožravcov a špecifických metabolitov v prirodzených populáciách (26). Túto sadu údajov sme použili na pokrytie 43 zárodočných plazm. Tieto zárodočné plazmy pozostávajú zo 123 druhov rastlín z N. pallens. Tieto rastliny boli odobraté zo semien zozbieraných v rôznych pôvodných biotopoch v Utahu, Nevade, Arizone a Kalifornii (obrázok S7), vypočítali sme diverzitu metabolómu (tu nazývanú populačná úroveň) β diverzitu a špecializáciu spôsobenú OSM. V súlade s predchádzajúcimi štúdiami sme pozorovali širokú škálu metabolických zmien pozdĺž osí Hj a δj, čo naznačuje, že zárodočné plazmy majú významné rozdiely v plasticite svojich metabolických reakcií na bylinožravce (obrázok S7). Táto organizácia pripomína predchádzajúce pozorovania o dynamickom rozsahu zmien JA spôsobených bylinožravcami a udržala si veľmi vysokú hodnotu v jednej populácii (26, 36). Pomocou JA a JA-Ile na testovanie celkovej korelácie úrovní medzi Hj a δj sme zistili, že existuje významná pozitívna korelácia medzi JA a indexom diverzity a špecializácie metabolómu β (obrázok S7). To naznačuje, že heterogenita v indukcii JA indukovaná bylinožravcami zistená na úrovni populácie môže byť spôsobená kľúčovými metabolickými polymorfizmami spôsobenými výberom z hmyzích bylinožravcov.
Predchádzajúce štúdie ukázali, že druhy tabaku sa značne líšia typom a relatívnou závislosťou od indukovanej a konštitutívnej metabolickej obrany. Predpokladá sa, že tieto zmeny v prenose signálov proti bylinožravcom a obranných schopnostiach sú regulované populačným tlakom hmyzu, životným cyklom rastlín a nákladmi na obrannú produkciu vo výklenku, kde daný druh rastie. Študovali sme konzistenciu prestavby metabolómu listov indukovanej bylinožravcami šiestich druhov Nicotiana pôvodom zo Severnej a Južnej Ameriky. Tieto druhy sú blízko príbuzné severoamerickým druhom Nepenthes, konkrétne Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. atenuovaná tráva, Nicotiana tabacum, lineárny tabak, tabak (Nicotiana spegazzinii) a tabakový list tabaku (Nicotiana obtusifolia) (obrázok 5A) (37). Šesť z týchto druhov, vrátane dobre charakterizovaného druhu N. please, sú jednoročné rastliny kladu petúnie a obtusifolia N. sú trvalky sesterského kladu Trigonophyllae (38). Následne sa na týchto siedmich druhoch vykonala indukcia W + W, W + OSM a W + OSS1 s cieľom študovať metabolické preskupenie hmyzu na úrovni druhov.
(A) Fylogenetický strom bootstrap založený na maximálnej pravdepodobnosti [pre syntézu jadrového glutamínu (38)] a geografickom rozšírení siedmich blízko príbuzných druhov Nicotiana (rôzne farby) (37). (B) Bodový graf špecializovanej diverzity pre metabolické profily siedmich druhov Nicotiana (939 MS/MS; súbor údajov S1). Na úrovni druhov je diverzita metabolómu negatívne korelovaná so stupňom špecializácie. Analýza korelácie na úrovni druhov medzi metabolickou diverzitou a špecializáciou a akumuláciou JA je znázornená na obrázku 2. S9. Farba, rôzne typy; trojuholník, W + OSS1; obdĺžnik, W + OSM; (C) Dynamika JA a JA-Ile u Nicotiana je zoradená podľa amplitúdy excitácie OS (dvojcestná ANOVA a Tukey HSD po viacnásobnom porovnaní, * P <0,05, ** P <0,01 a * ** Pre porovnanie W + OS a W + W, P <0,001). Krabicový graf (D) diverzity a (E) špecializácie každého druhu po simulácii bylinožravého a metylového JA (MeJA). Hviezdička označuje významný rozdiel medzi W + OS a W + W alebo lanolínom plus W (Lan + W) alebo Lan plus MeJA (Lan + MeJa) a kontrolnou skupinou Lan (dvojcestná analýza rozptylu, po ktorej nasledovalo Tukeyho HSD post hoc viacnásobné porovnanie, *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001).
Pomocou metódy duálnych klastrov sme identifikovali 9 modulov 939 MS/MS (súbor s údajmi S1). Zloženie MS/MS rekonfigurovaných rôznymi ošetreniami sa medzi rôznymi modulmi a druhmi značne líši (obrázok S8). Vizualizácia Hj (tu označovaná ako γ-diverzita na úrovni druhu) a δj odhaľuje, že rôzne druhy sa agregujú do veľmi odlišných skupín v metabolickom priestore, kde je rozdelenie na úrovni druhov zvyčajne výraznejšie ako excitácia. S výnimkou N. linear a N. obliquus vykazujú široký dynamický rozsah indukčných účinkov (obrázok 5B). Naproti tomu druhy ako N. purpurea a N. obtusifolia majú menej zjavnú metabolickú odpoveď na ošetrenie, ale metabolóm je rozmanitejší. Druhovo špecifické rozdelenie indukovanej metabolickej odpovede viedlo k významnej negatívnej korelácii medzi špecializáciou a gama diverzitou (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Zmeny hladín JA vyvolané OS pozitívne korelujú so špecializáciou metabolómu a negatívne korelujú s metabolickou gama diverzitou, ktorú vykazuje každý druh (obrázok 5B a obrázok S9). Stojí za zmienku, že druhy hovorovo označované ako druhy „reagujúce na signál“ na obrázku 5C, ako napríklad háďatká Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute a Nepenthes attenated, spôsobili významné príznaky po 30 minútach. Nedávne ohniská JA a JA-Ile špecifické pre OS, zatiaľ čo iné baktérie nazývané „nereagujúce na signál“, ako napríklad Nepenthes mills, Nepenthes powdery a N. obtusifolia, vykazujú iba indukciu JA-Ile Edge bez akejkoľvek špecifickosti pre OS (obrázok 5C). Na metabolickej úrovni, ako je uvedené vyššie, v prípade atenuovaných Nepenthes látky reagujúce na signál vykazovali špecifickosť pre OS a významne zvýšili δj, pričom znížili Hj. Tento primingový efekt špecifický pre OS nebol zistený u druhov klasifikovaných ako druhy nereagujúce na signál (obrázok 5, D a E). Metabolity špecifické pre OS sa častejšie zdieľajú medzi druhmi reagujúcimi na signál a tieto signálne zhluky sa zhlukujú s druhmi so slabšími signálnymi odpoveďami, zatiaľ čo druhy so slabšími signálnymi odpoveďami vykazujú menšiu vzájomnú závislosť (obrázok S8). Tento výsledok naznačuje, že indukcia JA špecifická pre OS a rekonfigurácia metabolómu špecifická pre OS sú na úrovni druhov prepojené.
Následne sme na ošetrenie rastlín použili lanolínovú pastu obsahujúcu metylJA (MeJA), aby sme zistili, či sú tieto väzbové režimy obmedzené dostupnosťou JA aplikovaného exogénnou JA, ktorá bude v cytoplazme rastlín. Rýchla deesterifikácia je JA. Zistili sme rovnaký trend postupnej zmeny z druhov reagujúcich na signál na druhy nereagujúce na signál, čo je spôsobené nepretržitým prísunom JA (obrázok 5, D a E). Stručne povedané, ošetrenie MeJA silne preprogramovalo metabolómy lineárnych nematód, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens a N. mikimotoi, čo viedlo k významnému zvýšeniu δj a poklesu Hj. Iba N. purpurea vykazovala zvýšenie δj, ale nie Hj. N. obtusifolia, u ktorej sa predtým preukázalo, že akumuluje extrémne nízke hladiny JA, tiež zle reaguje na ošetrenie MeJA, pokiaľ ide o rekonfiguráciu metabolómu. Tieto výsledky naznačujú, že produkcia JA alebo prenos signálu je fyziologicky obmedzená u druhov nereagujúcich na signál. Na overenie tejto hypotézy sme študovali štyri druhy (N. pallens, N. mills, N. pink a N. microphylla) indukované transkriptómom W + W, W + OSM a W + OSS1 (39). V súlade so vzorcom remodelácie metabolómu sú druhy v transkriptómovom priestore dobre oddelené, pričom N. attenated vykazoval najvyšší RDPI indukovaný OS, zatiaľ čo N. gracilis mal najnižší (obrázok 6A). Zistilo sa však, že diverzita transkriptómu indukovaná N. oblonga bola najnižšia spomedzi štyroch druhov, na rozdiel od najvyššej metabonomickej diverzity N. oblonga, ktorá bola predtým preukázaná u siedmich druhov. Predchádzajúce štúdie ukázali, že súbor génov súvisiacich so signálmi skorej obrany, vrátane signálov JA, vysvetľuje špecifickosť reakcií skorej obrany indukovaných elicitormi súvisiacimi s bylinožravcami u druhov Nicotiana (39). Porovnanie signálnych dráh JA medzi týmito štyrmi druhmi odhalilo zaujímavý vzorec (obrázok 6B). Väčšina génov v tejto dráhe, ako napríklad AOC, OPR3, ACX a COI1, vykazovala u týchto štyroch druhov relatívne vysoké úrovne indukcie. Kľúčový gén JAR4 však premieňa JA na jeho biologicky aktívnu formu akumulovaných transkriptov JA-Ile a jeho úroveň transkripcie je veľmi nízka, najmä u N. mills, Nepenthes pieris a N. microphylla. Okrem toho, u N. bifidum nebol detegovaný iba transkript iného génu AOS. Tieto zmeny v génovej expresii môžu byť zodpovedné za extrémne fenotypy vyvolané nízkou produkciou JA u signálne anergných druhov a indukciou u N. gracilis.
(A) Analýza informačnej teórie preprogramovania skorých transkripčných odpovedí štyroch blízko príbuzných druhov tabaku odobratých 30 minút po indukcii bylinožravcami. RDPI sa vypočíta porovnaním listov indukovaných bylinožravým OS s kontrolnou skupinou s ranou. Farby označujú rôzne druhy a symboly označujú rôzne metódy liečby. (B) Analýza génovej expresie v signálnych dráhach JA u štyroch druhov. Zjednodušená dráha JA je zobrazená vedľa krabicového grafu. Rôzne farby označujú rôzne metódy spracovania. Hviezdička označuje, že medzi ošetrením W + OS a kontrolnou skupinou W + W existuje významný rozdiel (pre Studentov t-test pre párové rozdiely, *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001). OPDA, kyselina 12-oxofytodiénová; OPC-8: kyselina 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyklopentán-1-oktánová.
V poslednej časti sme skúmali, ako môže byť druhovo špecifická remodelácia metabolómu rôznych rastlinných druhov u hmyzu rezistentná voči bylinožravcom. Predchádzajúci výskum sa zameriaval na rod Nicotiana. Ich rezistencia voči Ms a larvám sa značne líši (40). Tu sme skúmali súvislosť medzi týmto modelom a ich metabolickou plasticitou. Použitím vyššie uvedených štyroch druhov tabaku a testovaním korelácie medzi diverzitou a špecializáciou metabolómu spôsobenou bylinožravcami a rezistenciou rastlín voči Ms a Sl sme zistili, že rezistencia, diverzita a špecializácia voči generalistickému Sl sú pozitívne korelované, zatiaľ čo korelácia medzi rezistenciou voči expertným dámam a špecializáciou je slabá a korelácia s diverzitou nie je významná (obrázok S10). Pokiaľ ide o rezistenciu voči S1, atenuovaný N. chinensis aj N. gracilis, u ktorých sa predtým preukázalo, že vykazujú úrovne transdukcie JA signálu aj plasticitu metabolómu, mali veľmi odlišné reakcie na indukciu bylinožravcami a tiež vykazovali podobnú vysokú rezistenciu. Pohlavie.
V uplynulých šesťdesiatich rokoch poskytla teória obrany rastlín teoretický rámec, na základe ktorého výskumníci predpovedali značný počet evolúcií a funkcií špecializovaných metabolitov rastlín. Väčšina z týchto teórií nedodržiava bežný postup silných inferencií (41). Navrhujú kľúčové predpovede (3) na rovnakej úrovni analýzy. Keď testovanie kľúčových predpovedí umožňuje analýzu špecifických teórií, toto pole sa posúva vpred. Možno ich podporiť, ale iné zamietnuť (42). Namiesto toho nová teória robí predpovede na rôznych úrovniach analýzy a pridáva novú vrstvu deskriptívnych úvah (42). Dve teórie navrhnuté na funkčnej úrovni, MT a OD, sa však dajú ľahko vysvetliť ako dôležité predpovede špecializovaných metabolických zmien spôsobených bylinožravcami: Teória OD sa domnieva, že zmeny v špecializovanom metabolickom „priestore“ sú vysoko smerové. Teória MT sa domnieva, že tieto zmeny budú nesmerové a náhodne umiestnené v metabolickom priestore a majú tendenciu mať metabolity s vysokou obrannou hodnotou. Predchádzajúce skúmania predpovedí OD a MT boli testované s použitím úzkeho súboru apriórnych „obranných“ zlúčenín. Tieto testy zamerané na metabolity vylučujú schopnosť analyzovať rozsah a trajektóriu rekonfigurácie metabolómu počas bylinožravosti a neumožňujú testovanie v konzistentnom štatistickom rámci, ktoré by vyžadovalo kľúčové predpovede, ktoré možno považovať za celok. Kvantifikácia zmien v metabolóme rastlín. V tejto štúdii sme použili inovatívnu technológiu v metabolomike založenú na výpočtovej MS a vykonali sme dekonvolučnú MS analýzu vo všeobecnom jazyku deskriptorov informačnej teórie, aby sme otestovali rozdiel medzi týmito dvoma navrhovanými na globálnej metabolomickej úrovni. Kľúčová predikcia tejto teórie. Informačná teória sa uplatňuje v mnohých oblastiach, najmä v kontexte výskumu biodiverzity a toku živín (43). Pokiaľ však vieme, ide o prvú aplikáciu použitú na opis metabolického informačného priestoru rastlín a riešenie ekologických problémov súvisiacich s dočasnými metabolickými zmenami v reakcii na environmentálne signály. Schopnosť tejto metódy spočíva najmä v jej schopnosti porovnávať vzorce v rámci rastlinných druhov a medzi nimi, aby sa preskúmalo, ako sa bylinožravce vyvinuli z rôznych druhov do medzidruhových makroevolučných vzorcov na rôznych úrovniach evolúcie. Metabolizmus.
Analýza hlavných komponentov (PCA) prevádza viacrozmerný súbor údajov do priestoru redukcie dimenzionality, aby bolo možné vysvetliť hlavný trend údajov, preto sa zvyčajne používa ako prieskumná technika na analýzu súboru údajov, ako je napríklad dekonvolučný metabolóm. Redukcia dimenzionality však stratí časť informačného obsahu v súbore údajov a PCA nemôže poskytnúť kvantitatívne informácie o charakteristikách, ktoré sú obzvlášť relevantné pre ekologickú teóriu, ako napríklad: ako bylinožravce rekonfigurujú diverzitu v špecializovaných oblastiach (napríklad bohatosť, distribúcia) a početnosť) metabolity? Ktoré metabolity sú prediktormi indukovaného stavu daného bylinožravca? Z hľadiska špecifickosti, diverzity a indukovateľnosti sa informačný obsah profilu metabolitov špecifických pre listy rozloží a zistí sa, že konzumácia bylinožravcov môže aktivovať špecifický metabolizmus. Neočakávane sme pozorovali, že ako je opísané v implementovaných indikátoroch informačnej teórie, výsledná metabolická situácia sa po útokoch dvoch bylinožravcov (nočne kŕmeného generalistu Sl) a experta na ľuľky pani, výrazne prekrýva. Hoci ich stravovacie správanie a koncentrácia sa výrazne líšia. Iniciátor konjugátu mastných kyselín a aminokyselín (FAC) v OS (31). Použitím bylinožravého OS na liečbu štandardizovaných bodných rán sa pri simulovanej liečbe bylinožravcami prejavil podobný trend. Tento štandardizovaný postup simulácie reakcie rastlín na útoky bylinožravcov eliminuje mätúce faktory spôsobené zmenami v stravovacom správaní bylinožravcov, ktoré vedú k rôznemu stupňu poškodenia v rôznych časoch (34). FAC, o ktorom je známe, že je hlavnou príčinou OSM, znižuje reakcie JAS a iných rastlinných hormónov v OSS1, zatiaľ čo OSS1 ich znižuje stokrát (31). OSS1 však spôsobil podobné úrovne akumulácie JA v porovnaní s OSM. Predtým sa preukázalo, že reakcia JA v atenuovaných Nepenthes je veľmi citlivá na OSM, pričom FAC si dokáže udržať svoju aktivitu aj pri zriedení vodou v pomere 1:1000 (44). Preto v porovnaní s OSM, hoci je FAC v OSS1 veľmi nízky, postačuje na vyvolanie dostatočného prepuknutia JA. Predchádzajúce štúdie ukázali, že proteíny podobné porínu (45) a oligosacharidy (46) sa môžu použiť ako molekulárne kľúče na spustenie obranných reakcií rastlín v OSS1. Stále však nie je jasné, či sú tieto elicitory v OSS1 zodpovedné za akumuláciu JA pozorovanú v súčasnej štúdii.
Hoci existuje len málo štúdií opisujúcich rozdielne metabolické odtlačky prstov spôsobené aplikáciou rôznych bylinožravcov alebo exogénnej JA alebo SA (kyselina salicylová) (47), nikto nenarušil druhovo špecifickú poruchu bylinožravcov v sieti rastlín a jej vplyv na špecifické osobné informácie. Celkový vplyv metabolizmu sa systematicky študuje. Táto analýza ďalej potvrdila, že prepojenie vnútornej hormonálnej siete s inými rastlinnými hormónmi inými ako JA formuje špecifickosť metabolickej reorganizácie spôsobenej bylinožravcami. Konkrétne sme zistili, že ET spôsobený OSM bol výrazne väčší ako ten spôsobený OSS1. Tento režim je v súlade s vyšším obsahom FAC v OSM, čo je nevyhnutná a postačujúca podmienka na spustenie ET vzplanutia (48). V kontexte interakcie medzi rastlinami a bylinožravcami je signálna funkcia ET na dynamiku metabolitov špecifických pre rastliny stále sporadická a zameriava sa iba na jednu skupinu zlúčenín. Okrem toho väčšina štúdií použila exogénnu aplikáciu ET alebo jeho prekurzorov alebo rôznych inhibítorov na štúdium regulácie ET, medzi ktorými tieto exogénne chemické aplikácie spôsobia mnoho nešpecifických vedľajších účinkov. Podľa našich vedomostí táto štúdia predstavuje prvé rozsiahle systematické skúmanie úlohy ET pri jeho využití na produkciu a vnímanie poškodených transgénnych rastlín s cieľom koordinovať dynamiku rastlinného metabolómu. Indukcia ET špecifická pre bylinožravce môže v konečnom dôsledku modulovať metabolómovú odpoveď. Najvýznamnejšia je transgénna manipulácia génov biosyntézy (ACO) a vnímania (ETR1), ktorá odhalila de novo akumuláciu fenolamidov špecifickú pre bylinožravce. Predtým sa ukázalo, že ET dokáže jemne doladiť akumuláciu nikotínu indukovanú JA reguláciou putrescín N-metyltransferázy (49). Z mechanického hľadiska však nie je jasné, ako ET jemne doladí indukciu fenamidu. Okrem signálnej transdukčnej funkcie ET môže byť metabolický tok presmerovaný aj na S-adenozyl-1-metionín, aby sa regulovala investícia do polyaminofenolamidov. S-adenozyl-1-metionín je ET a bežný medziprodukt biosyntetickej dráhy polyamínu. Mechanizmus, ktorým signál ET reguluje hladinu fenolamidu, si vyžaduje ďalšie štúdium.
Dlhodobo, kvôli veľkému počtu špeciálnych metabolitov s neznámou štruktúrou, nebola intenzívna pozornosť venovaná špecifickým metabolickým kategóriám schopná presne posúdiť časové zmeny metabolickej diverzity po biologických interakciách. V súčasnosti, na základe analýzy teórie informácií, je hlavným výsledkom získavania MS/MS spektra založeného na nezaujatých metabolitoch to, že bylinožravce, ktoré jedia alebo simulujú bylinožravce, naďalej znižujú celkovú metabolickú diverzitu listového metabolómu a zároveň zvyšujú stupeň jeho špecializácie. Toto dočasné zvýšenie špecifickosti metabolómu spôsobené bylinožravcami je spojené so synergickým zvýšením špecifickosti transkriptómu. Znakom, ktorý najviac prispieva k tejto väčšej špecializácii metabolómu (s vyššou hodnotou Si), je špeciálny metabolit s predtým charakterizovanou bylinožravou funkciou. Tento model je v súlade s predikciou teórie OD, ale predikcia MT súvisiaca s náhodnosťou preprogramovania metabolómu nie je konzistentná. Tieto údaje sú však tiež v súlade s predikciou zmiešaného modelu (najlepšia MT; obrázok 1B), pretože iné necharakterizované metabolity s neznámymi obrannými funkciami môžu stále sledovať náhodné rozdelenie Si.
Pozoruhodný vzorec, ktorý tento výskum ďalej zachytil, je, že od úrovne mikroevolúcie (jedna rastlina a populácia tabaku) až po väčšiu evolučnú škálu (blízko príbuzné druhy tabaku) sú rôzne úrovne evolučnej organizácie v „najlepšej obrane“. Existujú významné rozdiely v schopnostiach bylinožravcov. Moore a kol. (20) a Kessler a Kalske (1) nezávisle navrhli previesť tri funkčné úrovne biodiverzity, ktoré pôvodne rozlíšil Whittaker (50), na konštitutívne a indukované časové zmeny chemickej diverzity; títo autori ani zhrnuli postupy pre zber údajov o metabolóme vo veľkom meradle tiež nenačrtávajú, ako vypočítať metabolickú diverzitu z týchto údajov. V tejto štúdii budú menšie úpravy Whittakerovej funkčnej klasifikácie brať do úvahy α-metabolickú diverzitu ako diverzitu MS/MS spektier v danej rastline a β-metabolickú diverzitu ako základný vnútrodruhový metabolizmus skupiny populácií a γ-metabolická diverzita bude rozšírením analýzy podobných druhov.
Signál JA je nevyhnutný pre širokú škálu metabolických reakcií bylinožravcov. Chýba však prísne kvantitatívne testovanie príspevku intraspecifickej regulácie biosyntézy JA k diverzite metabolómu a to, či je signál JA všeobecným miestom pre stresom indukovanú metabolickú diverzifikáciu na vyššej makroevolučnej úrovni, je stále nejasné. Zistili sme, že bylinožravá povaha bylinožravcov Nepenthes indukuje špecializáciu metabolómu a variácie špecializácie metabolómu v rámci populácie druhov Nicotiana a medzi blízko príbuznými druhmi Nicotiana systematicky pozitívne korelujú so signalizáciou JA. Okrem toho, keď je signál JA narušený, metabolická špecifickosť indukovaná jedným genotypom bylinožravca sa zruší (obrázok 3, C a E). Keďže zmeny metabolického spektra prirodzene atenuovaných populácií Nepenthes sú väčšinou kvantitatívne, zmeny v metabolickej β diverzite a špecifickosti v tejto analýze môžu byť do značnej miery spôsobené silnou excitáciou kategórií zlúčenín bohatých na metabolity. Tieto triedy zlúčenín dominujú časti profilu metabolómu a vedú k pozitívnej korelácii so signálmi JA.
Keďže biochemické mechanizmy druhov tabaku, ktoré sú s ním blízko príbuzné, sú veľmi odlišné, metabolity sú špecificky identifikované v kvalitatívnom aspekte, takže je to analytickejšie. Spracovanie zachyteného metabolického profilu informačnou teóriou odhaľuje, že indukcia bylinožravcami zhoršuje kompromis medzi metabolickou gama diverzitou a špecializáciou. Signál JA hrá v tomto kompromise ústrednú úlohu. Zvýšenie špecializácie metabolómu je v súlade s hlavnou predikciou OD a pozitívne koreluje so signálom JA, zatiaľ čo signál JA negatívne koreluje s metabolickou gama diverzitou. Tieto modely naznačujú, že kapacita OD rastlín je určená hlavne plasticitou JA, či už v mikroevolučnom meradle alebo vo väčšom evolučnom meradle. Experimenty s exogénnou aplikáciou JA, ktoré obchádzajú defekty biosyntézy JA, ďalej odhaľujú, že blízko príbuzné druhy tabaku možno rozlíšiť na druhy reagujúce na signál a druhy nereagujúce na signál, rovnako ako ich spôsob JA a plasticita metabolómu indukovaná bylinožravcami. Druhy nereagujúce na signál nemôžu reagovať kvôli svojej neschopnosti produkovať endogénnu JA, a preto podliehajú fyziologickým obmedzeniam. Toto môže byť spôsobené mutáciami v niektorých kľúčových génoch v signálnej dráhe JA (AOS a JAR4 u N. crescens). Tento výsledok zdôrazňuje, že tieto medzidruhové makroevolučné vzorce môžu byť spôsobené najmä zmenami vo vnímaní a reakcii vnútorných hormónov.
Okrem interakcie medzi rastlinami a bylinožravcami súvisí skúmanie metabolickej diverzity so všetkými dôležitými teoretickými pokrokmi vo výskume biologickej adaptácie na prostredie a evolúcie komplexných fenotypových znakov. S nárastom množstva údajov získaných modernými MS prístrojmi môže testovanie hypotéz o metabolickej diverzite teraz prekročiť individuálne/kategóriové rozdiely v metabolitoch a vykonať globálnu analýzu, ktorá odhalí neočakávané vzorce. V procese rozsiahlej analýzy je dôležitou metaforou myšlienka vytvorenia zmysluplných máp, ktoré možno použiť na skúmanie údajov. Dôležitým výsledkom súčasnej kombinácie nestrannej MS/MS metabolomiky a teórie informácií je preto to, že poskytuje jednoduchú metriku, ktorú možno použiť na vytvorenie máp na prehliadanie metabolickej diverzity v rôznych taxonomických mierkach. To je základná požiadavka tejto metódy. Štúdium mikro/makro evolúcie a ekológie spoločenstiev.
Na makroevolučnej úrovni je jadrom teórie koevolúcie rastlín a hmyzu Ehrlicha a Ravena (51) predpoveď, že variácia medzidruhovej metabolickej diverzity je príčinou diverzifikácie rastlinných línií. Avšak za päťdesiat rokov od publikovania tejto zásadnej práce bola táto hypotéza zriedkavo testovaná (52). Je to do značnej miery spôsobené fylogenetickými charakteristikami porovnateľných metabolických charakteristík naprieč dlhodobými rastlinnými líniami. Táto vzácnosť sa dá použiť na ukotvenie metód cieľovej analýzy. Súčasný pracovný postup MS/MS spracovaný informačnou teóriou kvantifikuje štrukturálnu podobnosť neznámych metabolitov MS/MS (bez predchádzajúceho výberu metabolitov) a prevádza tieto MS/MS na súbor MS/MS, teda v profesionálnom metabolizme. Tieto makroevolučné modely sa porovnávajú v klasifikačnej stupnici. Jednoduché štatistické ukazovatele. Proces je podobný fylogenetickej analýze, ktorá môže použiť zarovnanie sekvencií na kvantifikáciu miery diverzifikácie alebo vývoja znakov bez predchádzajúcej predpovede.
Na biochemickej úrovni skríningová hypotéza Firna a Jonesa (53) ukazuje, že metabolická diverzita sa udržiava na rôznych úrovniach, aby poskytovala suroviny na vykonávanie biologických aktivít predtým nesúvisiacich alebo substituovaných metabolitov. Metódy teórie informácií poskytujú rámec, v ktorom možno tieto metabolitovo-špecifické evolučné prechody, ku ktorým dochádza počas špecializácie metabolitov, kvantifikovať ako súčasť navrhovaného evolučného skríningového procesu: biologicky aktívna adaptácia z nízkej špecifickosti na vysokú špecifickosť. Inhibované metabolity daného prostredia.
Celkovo vzaté, v raných dobách molekulárnej biológie boli vyvinuté dôležité teórie obrany rastlín a deduktívne metódy založené na hypotézach sa všeobecne považujú za jediný prostriedok vedeckého pokroku. Je to do značnej miery spôsobené technickými obmedzeniami merania celého metabolómu. Hoci metódy založené na hypotézach sú obzvlášť užitočné pri výbere iných kauzálnych mechanizmov, ich schopnosť prehĺbiť naše chápanie biochemických sietí je obmedzenejšia ako výpočtové metódy, ktoré sú v súčasnosti dostupné v súčasnej vede s intenzívnym spracovaním údajov. Preto teórie, ktoré nemožno predpovedať, ďaleko presahujú rozsah dostupných údajov, takže hypotetický vzorec/testovací cyklus pokroku vo výskumnej oblasti nemožno zrušiť (4). Predpokladáme, že výpočtový pracovný postup metabolomiky, ktorý je tu predstavený, môže oživiť záujem o nedávne (ako) a konečné (prečo) otázky metabolickej diverzity a prispieť k novej ére teoreticky riadenej dátovej vedy. Táto éra prehodnotila dôležité teórie, ktoré inšpirovali predchádzajúce generácie.
Priame kŕmenie bylinožravcov sa vykonáva odchovom larvy druhého instaru alebo larvy Sl na jednom liste svetlosfarbenej džbánky jednej kvitnúcej ruže, s 10 rastlinnými replikáciami na rastlinu. Larvy hmyzu boli zovreté svorkami a zvyšné listové tkanivo bolo odobraté 24 a 72 hodín po infekcii a rýchlo zmrazené a metabolity boli extrahované.
Simulujte bylinožravú liečbu vysoko synchronizovaným spôsobom. Metóda spočíva v použití kotúčov s látkovými vzormi na prepichnutie troch radov tŕňov na každej strane strednej žilky troch plne rozvinutých listov rastliny počas rastovej fázy látkovej girlandy a okamžitej aplikácii Ms zriedeného v pomere 1:5. Alebo použite rukavice na vpichnutie S1 OS do vpichnutej rany. Zozbierajte a spracujte list podľa vyššie uvedeného popisu. Použite predtým opísanú metódu na extrakciu primárnych metabolitov a rastlinných hormónov (54).
Pri exogénnych aplikáciách JA sa tri stopkové listy každej zo šiestich kvitnúcich rastlín ruží každého druhu ošetria 20 μl lanolínovej pasty obsahujúcej 150 μg MeJA (Lan + MeJA) a 20 μl lanolínu plus ošetrenie rán (Lan + W) alebo sa ako kontrola použije 20 μl čistého lanolínu. Listy sa zozbierajú 72 hodín po ošetrení, rýchlo zmrazia v tekutom dusíku a uskladnia pri teplote -80 °C až do použitia.
V našej výskumnej skupine boli identifikované štyri transgénne línie JA a ET, a to irAOC (36), irCOI1 (55), irACO a sETR1 (48). irAOC vykazoval silný pokles hladín JA a JA-Ile, zatiaľ čo irCOI1 nebol citlivý na JA. V porovnaní s EV sa akumulácia JA-Ile zvýšila. Podobne irACO znižuje produkciu ET a v porovnaní s EV sETR1, ktorý je necitlivý na ET, zvyšuje produkciu ET.
Na neinvazívne meranie ET sa používa fotoakustický laserový spektrometer (senzor ET v reálnom čase Sensor Sense ETD-300). Ihneď po ošetrení sa polovica listov odrezala a preniesla do 4 ml uzavretej sklenenej fľaštičky a priestor nad kvapalinou sa nechal akumulovať do 5 hodín. Počas merania sa každá fľaštička preplachovala prúdom 2 litre/hodinu čistého vzduchu počas 8 minút, ktorý predtým prešiel katalyzátorom od spoločnosti Sensor Sense na odstránenie CO2 a vody.
Dáta z mikročipov boli pôvodne publikované v (35) a uložené v komplexnej databáze génovej expresie Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI) (prístupové číslo GSE30287). Pre túto štúdiu boli extrahované údaje zodpovedajúce listom spôsobeným ošetrením W + OSM a nepoškodenej kontrole. Hrubá intenzita je log2. Pred štatistickou analýzou bola základná línia prepočítaná a normalizovaná na 75. percentil pomocou softvérového balíka R.
Pôvodné údaje o sekvenovaní RNA (RNA-seq) druhov Nicotiana boli získané z archívu krátkych čítaní NCBI (SRA), číslo projektu PRJNA301787, ktorý zverejnili Zhou a kol. (39) a postupuje sa podľa popisu v (56). Na analýzu v tejto štúdii boli vybrané surové údaje spracované pomocou W + W, W + OSM a W + OSS1 zodpovedajúce druhom Nicotiana a spracované nasledujúcim spôsobom: Najprv boli surové údaje o sekvenovaní RNA prevedené do formátu FASTQ. HISAT2 konvertuje FASTQ na SAM a SAMtools konvertuje súbory SAM do zoradených súborov BAM. Na výpočet génovej expresie sa používa StringTie a jeho metóda expresie je založená na počte fragmentov na tisíc bázových fragmentov na milión sekvenovaných transkripčných fragmentov.
Chromatografická kolóna Acclaim (150 mm x 2,1 mm; veľkosť častíc 2,2 μm) použitá v analýze a predkolóna 4 mm x 4 mm sú vyrobené z rovnakého materiálu. V systéme Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) sa používa nasledujúci binárny gradient: 0 až 0,5 minúty, izokratický 90 % A [deionizovaná voda, 0,1 % (v/v) acetonitril a 0,05 % kyselina mravčia], 10 % B (acetonitril a 0,05 % kyselina mravčia); 0,5 až 23,5 minúty, gradientová fáza je 10 % A a 90 % B; 23,5 až 25 minút, izokratický 10 % A a 90 % B. Prietok je 400 μl/min. Pre všetky MS analýzy vstreknite eluent z kolóny do kvadrupólového analyzátora s meraním doby letu (qTOF) vybaveného zdrojom elektrospreju pracujúcim v režime pozitívnej ionizácie (napätie kapiláry 4500 V; výstup kapiláry 130 V; teplota sušenia 200 °C; prietok vzduchu počas sušenia 10 litrov/min).
Vykonajte analýzu fragmentov MS/MS (ďalej len MS/MS), ktoré sú irelevantné alebo nerozoznateľné od údajov, aby ste získali štrukturálne informácie o celkovom detekovateľnom metabolickom profile. Koncept nerozlišovacej metódy MS/MS sa opiera o skutočnosť, že kvadrupól má veľmi veľké okno izolácie hmotnosti [preto všetky signály pomeru hmotnosti k náboju (m/z) považujte za fragmenty]. Z tohto dôvodu, keďže prístroj Impact II nebol schopný vytvoriť náklon CE, vykonalo sa niekoľko nezávislých analýz s použitím zvýšených hodnôt energie zrážkovej disociácie (CE) indukovanej zrážkou. Stručne povedané, najskôr analyzujte vzorku pomocou UHPLC-elektrosprejovej ionizácie/qTOF-MS s použitím režimu jednej hmotnostnej spektrometrie (podmienky nízkej fragmentácie generované fragmentáciou v zdroji), skenovaním od m/z 50 do 1500 pri opakovacej frekvencii 5 Hz. Použite dusík ako kolízny plyn pre analýzu MS/MS a vykonajte nezávislé merania pri nasledujúcich štyroch rôznych napätiach disociácie indukovanej zrážkou: 20, 30, 40 a 50 eV. Počas celého procesu merania má kvadrupól najväčšie okno izolácie hmotnosti, od m/z 50 do 1500. Keď je experiment s m/z predného telesa a šírkou izolácie nastavený na 200, rozsah hmotnosti sa automaticky aktivuje operačným softvérom prístroja a 0 Da. Skenujte fragmenty hmotnosti ako v režime jednej hmotnosti. Na kalibráciu hmotnosti použite mravčan sodný (50 ml izopropanolu, 200 μl kyseliny mravčej a 1 ml 1M vodného roztoku NaOH). Pomocou vysoko presného kalibračného algoritmu Bruker sa súbor s údajmi kalibruje po spustení priemerného spektra v danom časovom období. Na konverziu súborov s nespracovanými údajmi do formátu NetCDF použite funkciu exportu softvéru Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Brémy, Nemecko). Súbor údajov MS/MS bol uložený v otvorenej metabolomickej databáze MetaboLights (www.ebi.ac.uk) s prístupovým číslom MTBLS1471.
Zostavenie MS/MS je možné realizovať pomocou korelačnej analýzy medzi signálmi kvality MS1 a MS/MS pre nízku a vysokú energiu zrážky a novo implementovanými pravidlami. Na realizáciu korelačnej analýzy distribúcie prekurzora k produktu sa používa skript R a na implementáciu pravidiel skript C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline).
Aby sme znížili falošne pozitívne chyby spôsobené šumom pozadia a falošnou koreláciou spôsobenou detekciou určitých m/z prvkov len v niekoľkých vzorkách, používame funkciu „filled peak“ balíka R XCMS (na korekciu šumu pozadia), ktorá by sa mala použiť na nahradenie intenzity „NA“ (nedetekovaný peak). Aj keď sa použije funkcia fill peak, v súbore údajov je stále veľa hodnôt intenzity „0“, ktoré ovplyvnia výpočet korelácie. Potom porovnáme výsledky spracovania údajov získané s použitím funkcie fill peak a bez použitia funkcie fill peak a vypočítame hodnotu šumu pozadia na základe priemernej korigovanej odhadovanej hodnoty a potom nahradíme tieto 0 hodnôt intenzity vypočítanou hodnotou pozadia. Zohľadnili sme tiež iba prvky, ktorých intenzita trikrát presiahla hodnotu pozadia, a považovali sme ich za „skutočné píky“. Pre výpočty PCC sa berú do úvahy iba signály m/z súborov údajov prekurzora vzorky (MS1) a fragmentov s najmenej ôsmimi skutočnými píkmi.
Ak intenzita znaku kvality prekurzora v celej vzorke významne koreluje so zníženou intenzitou rovnakého znaku kvality, ktorý je vystavený nízkej alebo vysokej energii zrážky, a znak nie je označený systémom CAMERA ako izotopový pík, je možné ho ďalej definovať. Potom sa výpočtom všetkých možných párov prekurzor-produkt do 3 sekúnd (odhadované okno retenčného času pre retenciu píku) vykoná korelačná analýza. Iba vtedy, keď je hodnota m/z nižšia ako hodnota prekurzora a MS/MS fragmentácia sa vyskytuje na rovnakom mieste vzorky v súbore údajov ako prekurzor, z ktorého je odvodený, sa považuje za fragment.
Na základe týchto dvoch jednoduchých pravidiel vylúčime špecifikované fragmenty s hodnotami m/z vyššími ako m/z identifikovaného prekurzora a na základe polohy vzorky, kde sa prekurzor nachádza, a špecifikovaného fragmentu. Je tiež možné vybrať kvalitatívne znaky generované mnohými fragmentmi v zdroji generovanými v režime MS1 ako kandidátske prekurzory, čím sa generujú redundantné zlúčeniny MS/MS. Aby sa znížila táto redundancia údajov, ak podobnosť NDP spektier presiahne 0,6 a patria do chromatogramu „pcgroup“ anotovaného pomocou CAMERA, zlúčime ich. Nakoniec zlúčime všetky štyri výsledky CE spojené s prekurzorom a fragmentmi do finálneho dekonvoluovaného kompozitného spektra výberom píku s najvyššou intenzitou spomedzi všetkých kandidátskych píkov s rovnakou hodnotou m/z pri rôznych energiách zrážky. Nasledujúce kroky spracovania sú založené na koncepte kompozitného spektra a zohľadňujú rôzne podmienky CE potrebné na maximalizáciu pravdepodobnosti fragmentácie, pretože niektoré fragmenty je možné detegovať iba pri špecifickej energii zrážky.
Na výpočet indukovateľnosti metabolického profilu sa použil RDPI (30). Diverzita metabolického spektra (index Hj) sa odvodzuje z množstva prekurzorov MS/MS pomocou Shannonovej entropie frekvenčného rozdelenia MS/MS s použitím nasledujúcej rovnice opísanej Martínezom a kol. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), kde Pij zodpovedá relatívnej frekvencii i-tej MS/MS v j-tej vzorke (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m)t).
Metabolická špecificita (Si index) je definovaná ako identita expresie danej MS/MS vo vzťahu k frekvencii medzi uvažovanými vzorkami. Špecificita MS/MS sa vypočíta ako Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Na meranie metabolomovo-špecifického δj indexu každej j-tej vzorky a priemeru MS/MS špecificity δj = ∑i = 1mPijSi použite nasledujúci vzorec:
Spektrá MS/MS sú zoradené do párov a podobnosť sa vypočíta na základe týchto dvoch skóre. Najprv sa pomocou štandardnej metódy NDP (známej aj ako metóda kosínusovej korelácie) pomocou nasledujúcej rovnice vyhodnotí podobnosť segmentov medzi spektrami: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, kde S1 a S2. Pre spektrum 1 a spektrum 2, ako aj pre WS1, i a WS2, i predstavuje váhu na základe intenzity píku, pri ktorej je rozdiel i-teho spoločného píku medzi týmito dvoma spektrami menší ako 0,01 Da. Váha sa vypočíta takto: W = [intenzita píku] m [kvalita] n, m = 0,5, n = 2, ako navrhuje MassBank.
Bola implementovaná druhá metóda hodnotenia, ktorá zahŕňala analýzu zdieľanej NL medzi MS/MS. Na tento účel sme použili 52 NL zoznamov, ktoré sa často vyskytujú počas procesu fragmentácie MS, a špecifickejšiu NL (súbor s údajmi S1), ktorá bola predtým anotovaná pre MS/MS spektrum sekundárnych metabolitov oslabeného druhu Nepenthes (9, 26). Pre každú MS/MS sme vytvorili binárny vektor 1 a 0, ktorý zodpovedá aktuálnej a neexistujúcej nejakej NL. Na základe podobnosti euklidovskej vzdialenosti sa pre každý pár binárnych NL vektorov vypočíta skóre podobnosti NL.
Na vykonanie duálneho klastrovania sme použili balík R DiffCoEx, ktorý je založený na rozšírení váženej analýzy génovej koexpresie (WGCNA). Pomocou NDP a NL skórovacích matíc MS/MS spektier sme na výpočet porovnávacej korelačnej matice použili DiffCoEx. Binárne klastrovanie sa vykonáva nastavením parametra „cutreeDynamic“ na method = „hybrid“, cutHeight = 0,9999, deepSplit = T a minClusterSize = 10. Zdrojový kód R pre DiffCoEx bol stiahnutý z dodatočného súboru 1 Tessonom a kol. (57); požadovaný softvérový balík R WGCNA nájdete na https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Aby sme vykonali MS/MS analýzu molekulárnych sietí, vypočítali sme párovú spektrálnu konektivitu na základe typov podobnosti NDP a NL a použili sme softvér Cytoscape na vizualizáciu topológie siete pomocou organického rozloženia v aplikácii CyFilescape yFiles, ktorá rozširuje algoritmus rozloženia.
Na vykonanie štatistickej analýzy údajov použite R verziu 3.0.1. Štatistická významnosť bola hodnotená pomocou obojsmernej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukeyho post-hoc test na skutočný významný rozdiel (HSD). Na analýzu rozdielu medzi bylinožravou skupinou a kontrolnou skupinou bolo obojstranné rozdelenie dvoch skupín vzoriek s rovnakým rozptylom analyzované pomocou Studentovho t-testu.
Doplňujúce materiály k tomuto článku nájdete na stránke http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný podľa podmienok licencie Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ktorá umožňuje použitie, distribúciu a reprodukciu v akomkoľvek médiu, pokiaľ konečné použitie nie je na komerčný zisk a predpokladom je, že pôvodné dielo je správne. Zdroj.
Poznámka: Žiadame vás o poskytnutie vašej e-mailovej adresy iba preto, aby osoba, ktorú odporúčate stránke, vedela, že chcete, aby videla daný e-mail a že nejde o spam. Nebudeme zaznamenávať žiadne e-mailové adresy.
Táto otázka sa používa na overenie, či ste návštevník, a na zabránenie automatického odosielania spamu.
Teória informácií poskytuje univerzálnu menu pre porovnávanie špeciálnych metabolomov a predikciu teórií testovej obrany.
Teória informácií poskytuje univerzálnu menu pre porovnávanie špeciálnych metabolomov a predikciu teórií testovej obrany.
©2021 American Association for the Advancement of Science. všetky práva vyhradené. AAAS je partnerom HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.