Článok je súčasťou výskumnej témy „Zlepšenie odolnosti strukovín voči patogénom a škodcom“, zobraziť všetkých 5 článkov
Pôvodca nekrózy rastlín, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, využíva viacvrstvovú stratégiu na infikovanie rôznych hostiteľských rastlín. Táto štúdia navrhuje použitie diamínu L-ornitínu, neproteínovej aminokyseliny, ktorá stimuluje syntézu iných esenciálnych aminokyselín, ako alternatívnu stratégiu riadenia na zvýšenie molekulárnych, fyziologických a biochemických reakcií Phaseolus vulgaris L. na bielu pleseň spôsobenú Pseudomonas sclerotiorum. Experimenty in vitro ukázali, že L-ornitín významne inhiboval rast mycélia S. pyrenoidosa spôsobom závislým od dávky. Okrem toho by mohol významne znížiť závažnosť bielej plesne v skleníkových podmienkach. L-ornitín navyše stimuloval rast ošetrených rastlín, čo naznačuje, že testované koncentrácie L-ornitínu neboli pre ošetrené rastliny fytotoxické. Okrem toho L-ornitín zvýšil expresiu neenzymatických antioxidantov (celkové rozpustné fenoly a flavonoidy) a enzymatických antioxidantov (kataláza (CAT), peroxidáza (POX) a polyfenoloxidáza (PPO)) a zvýšil expresiu troch génov súvisiacich s antioxidantmi (PvCAT1, PvSOD a PvGR). Okrem toho analýza in silico odhalila prítomnosť predpokladaného proteínu oxaloacetát acetylhydrolázy (SsOAH) v genóme S. sclerotiorum, ktorý bol z hľadiska funkčnej analýzy, konzervovaných domén a topológie veľmi podobný proteínom oxaloacetát acetylhydrolázy (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) a Penicillium sp. (PlOAH). Je zaujímavé, že pridanie L-ornitínu do média so zemiakovou dextrózou (PDB) významne znížilo expresiu génu SsOAH v mycéliu S. sclerotiorum. Podobne exogénna aplikácia L-ornitínu významne znížila expresiu génu SsOAH v hubovom mycéliu zozbieranom z ošetrených rastlín. Aplikácia L-ornitínu nakoniec významne znížila sekréciu kyseliny šťaveľovej v PDB médiu aj v infikovaných listoch. Záverom možno konštatovať, že L-ornitín zohráva kľúčovú úlohu pri udržiavaní redoxného stavu, ako aj pri posilňovaní obrannej reakcie infikovaných rastlín. Výsledky tejto štúdie môžu pomôcť pri vývoji inovatívnych, ekologických metód na kontrolu bielej plesne a zmiernenie jej vplyvu na produkciu fazule a iných plodín.
Biela pleseň, ktorú spôsobuje nekrotrofná huba Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, je ničivé ochorenie znižujúce úrodu, ktoré predstavuje vážnu hrozbu pre celosvetovú produkciu fazule (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton a kol., 2006). Sclerotinia sclerotiorum je jedným z najťažšie kontrolovateľných pôdnych hubových rastlinných patogénov so širokým spektrom hostiteľov viac ako 600 rastlinných druhov a schopnosťou rýchlo macerovať hostiteľské tkanivá nešpecifickým spôsobom (Liang a Rollins, 2018). Za nepriaznivých podmienok prechádza kritickou fázou svojho životného cyklu, v ktorej zostáva dlhý čas v dormantnom stave ako čierne, tvrdé, semenám podobné štruktúry nazývané „skleróciá“ v pôde alebo ako biele, nadýchané výrastky v mycéliu alebo dreni stonky infikovaných rastlín (Schwartz a kol., 2005). S. sclerotiorum je schopná tvoriť skleróciá, čo jej umožňuje prežiť v infikovaných poliach dlhý čas a pretrvávať počas choroby (Schwartz a kol., 2005). Skleróciá sú bohaté na živiny, môžu pretrvávať v pôde dlhý čas a slúžia ako primárny inokulum pre následné infekcie (Schwartz a kol., 2005). Za priaznivých podmienok skleróciá klíčia a produkujú spóry prenášané vzduchom, ktoré môžu infikovať všetky nadzemné časti rastliny vrátane, ale nie výlučne, kvetov, stoniek alebo strukov (Schwartz a kol., 2005).
Huba Sclerotinia sclerotiorum využíva na infikovanie hostiteľských rastlín viacvrstvovú stratégiu, ktorá zahŕňa sériu koordinovaných udalostí od klíčenia sklerócií až po vývoj symptómov. Spočiatku S. sclerotiorum produkuje suspendované spóry (nazývané askospóry) z hubovitých štruktúr nazývaných apotécie, ktoré sa dostávajú do vzduchu a vyvíjajú sa na nepohyblivé sklerócie na infikovaných rastlinných zvyškoch (Bolton a kol., 2006). Huba potom vylučuje kyselinu šťaveľovú, faktor virulencie, na kontrolu pH bunkovej steny rastlín, podporu enzymatickej degradácie a invázie tkanív (Hegedus a Rimmer, 2005) a potlačenie oxidačného vzplanutia hostiteľskej rastliny. Tento proces okysľovania oslabuje bunkovú stenu rastlín a vytvára priaznivé prostredie pre normálnu a efektívnu činnosť enzýmov degradujúcich bunkovú stenu húb (CWDE), čo umožňuje patogénu prekonať fyzickú bariéru a preniknúť do hostiteľských tkanív (Marciano a kol., 1983). Po preniknutí S. sclerotiorum vylučuje množstvo CWDE, ako je polygalakturonáza a celuláza, ktoré uľahčujú jeho šírenie v infikovaných tkanivách a spôsobujú nekrózu tkaniva. Progresia lézií a hýfových rohoží vedie k charakteristickým príznakom bielej plesne (Hegedus a Rimmer, 2005). Hostiteľské rastliny zároveň rozpoznávajú molekulárne vzory spojené s patogénmi (PAMP) prostredníctvom receptorov rozpoznávania vzorov (PRR), čím spúšťajú sériu signálnych udalostí, ktoré nakoniec aktivujú obranné reakcie.
Napriek desaťročiam úsilia o kontrolu chorôb pretrváva nedostatok adekvátnej rezistentnej zárodočnej plazmy vo fazuli, rovnako ako v iných komerčných plodinách, kvôli rezistencii, prežitiu a prispôsobivosti patogénu. Manažment chorôb je preto mimoriadne náročný a vyžaduje si integrovanú, mnohostrannú stratégiu, ktorá zahŕňa kombináciu kultúrnych postupov, biologickej kontroly a chemických fungicídov (O'Sullivan a kol., 2021). Chemická kontrola bielej plesne je najúčinnejšia, pretože fungicídy, ak sa aplikujú správne a v správnom čase, dokážu účinne kontrolovať šírenie choroby, znížiť závažnosť infekcie a minimalizovať straty na úrode. Nadmerné používanie a nadmerná závislosť od fungicídov však môže viesť k vzniku rezistentných kmeňov S. sclerotiorum a negatívne ovplyvniť necieľové organizmy, zdravie pôdy a kvalitu vody (Le Cointe a kol., 2016; Ceresini a kol., 2024). Preto sa hľadanie ekologických alternatív stalo najvyššou prioritou.
Polyamíny (PA), ako napríklad putrescín, spermidín, spermín a kadaverín, môžu slúžiť ako sľubné alternatívy proti pôdnym rastlinným patogénom, čím úplne alebo čiastočne znížia používanie nebezpečných chemických fungicídov (Nehela a kol., 2024; Yi a kol., 2024). Vo vyšších rastlinách sa PA podieľajú na mnohých fyziologických procesoch vrátane, ale nie výlučne, bunkového delenia, diferenciácie a reakcie na abiotický a biotický stres (Killiny a Nehela, 2020). Môžu pôsobiť ako antioxidanty, pomáhať zachytávať reaktívne formy kyslíka (ROS), udržiavať redoxnú homeostázu (Nehela a Killiny, 2023), indukovať gény súvisiace s obranou (Romero a kol., 2018), regulovať rôzne metabolické dráhy (Nehela a Killiny, 2023), modulovať endogénne fytohormóny (Nehela a Killiny, 2019), vytvárať systémovú získanú rezistenciu (SAR) a regulovať interakcie rastlín a patogénov (Nehela a Killiny, 2020; Asija a kol., 2022; Czerwoniec, 2022). Stojí za zmienku, že špecifické mechanizmy a úlohy PA v obrane rastlín sa líšia v závislosti od druhu rastliny, patogénov a podmienok prostredia. Najhojnejšia PA v rastlinách je biosyntetizovaná z esenciálneho polyamínu L-ornitínu (Killiny a Nehela, 2020).
L-ornitín hrá viacero úloh v raste a vývoji rastlín. Napríklad predchádzajúce štúdie ukázali, že u ryže (Oryza sativa) môže byť ornitín spojený s recykláciou dusíka (Liu a kol., 2018), výnosom, kvalitou a arómou ryže (Lu a kol., 2020) a reakciou na vodný stres (Yang a kol., 2000). Okrem toho exogénna aplikácia L-ornitínu významne zvýšila toleranciu voči suchu u cukrovej repy (Beta vulgaris) (Hussein a kol., 2019) a zmiernila stres zo soli u cibule (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu a Çavuşoǧlu, 2021) a rastlín kešu orieška (Anacardium occidentale) (da Rocha a kol., 2012). Potenciálna úloha L-ornitínu v obrane proti abiotickému stresu môže byť spôsobená jeho účasťou na akumulácii prolínu v ošetrených rastlinách. Napríklad, gény súvisiace s metabolizmom prolínu, ako sú gény ornitín delta aminotransferázy (delta-OAT) a prolín dehydrogenázy (ProDH1 a ProDH2), boli predtým hlásené ako zapojené do obrany Nicotiana benthamiana a Arabidopsis thaliana proti nehostiteľským kmeňom Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar a Mysore, 2012). Na druhej strane, hubová ornitín dekarboxyláza (ODC) je potrebná pre rast patogénov (Singh a kol., 2020). Zacielenie na ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici prostredníctvom hostiteľom indukovaného umlčania génov (HIGS) významne zvýšilo odolnosť rastlín rajčiaka voči vädnutiu spôsobenému Fusarium (Singh a kol., 2020). Potenciálna úloha aplikácie exogénneho ornitínu proti biotickým stresom, ako sú fytopatogény, však nebola dobre preskúmaná. A čo je dôležitejšie, účinky ornitínu na odolnosť voči chorobám a súvisiace biochemické a fyziologické javy zostávajú do značnej miery nepreskúmané.
Pochopenie komplexnosti infekcie strukovín spôsobenej S. sclerotiorum je dôležité pre vývoj účinných stratégií kontroly. V tejto štúdii sme sa zamerali na identifikáciu potenciálnej úlohy diamínu L-ornitínu ako kľúčového faktora pri posilňovaní obranných mechanizmov a odolnosti rastlín strukovín voči infekcii Sclerotinia sclerotiorum. Predpokladáme, že okrem posilňovania obranných reakcií infikovaných rastlín zohráva L-ornitín kľúčovú úlohu aj pri udržiavaní redoxného stavu. Navrhujeme, že potenciálne účinky L-ornitínu súvisia s reguláciou enzymatických a neenzymatických antioxidačných obranných mechanizmov a s interferenciou s faktormi patogenity/virulencie húb a súvisiacimi proteínmi. Táto dvojitá funkčnosť L-ornitínu z neho robí sľubného kandidáta na udržateľnú stratégiu na zmiernenie vplyvu bielej plesne a zvýšenie odolnosti bežných strukovín voči tomuto silnému hubovému patogénu. Výsledky tejto štúdie môžu pomôcť pri vývoji inovatívnych, ekologických metód na kontrolu bielej plesne a zmiernenie jej vplyvu na produkciu strukovín.
V tejto štúdii bola ako experimentálny materiál použitá náchylná komerčná odroda fazule obyčajnej Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Zdravé semená láskavo poskytlo Oddelenie výskumu strukovín, Výskumný ústav poľných plodín (FCRI), Poľnohospodárske výskumné centrum (ARC) v Egypte. Päť semien bolo zasiatych do plastových kvetináčov (vnútorný priemer 35 cm, hĺbka 50 cm) naplnených pôdou infikovanou S. sclerotiorum v skleníkových podmienkach (25 ± 2 °C, relatívna vlhkosť 75 ± 1 %, 8 hodín svetla/16 hodín tmy). 7 – 10 dní po zasiatí (DPS) boli sadenice preriedené tak, aby v každom kvetináči zostali iba dve sadenice s rovnomerným rastom a tromi plne rozvinutými listami. Všetky rastliny v kvetináčoch boli zalievané raz za dva týždne a mesačne hnojené v odporúčanej dávke pre danú odrodu.
Na prípravu L-ornitíndiamínu (tiež známeho ako (+)-(S)-2,5-diaminopentánová kyselina; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemecko) s koncentráciou 500 mg/l sa najprv 50 mg rozpustilo v 100 ml sterilnej destilovanej vody. Zásobný roztok sa potom zriedil a použil v nasledujúcich experimentoch. Stručne povedané, in vitro sa testovalo šesť sérií koncentrácií L-ornitínu (12,5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/l). Okrem toho sa ako negatívna kontrola (mock) použila sterilná destilovaná voda a ako pozitívna kontrola sa použil komerčný zmáčateľný fungicíd „Rizolex-T“ 50 % (toklofos-metyl 20 % + tiram 30 %; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, guvernorát Gharbia, Egypt). Komerčný fungicíd „Rizolex-T“ bol testovaný in vitro v piatich koncentráciách (2, 4, 6, 8 a 10 mg/l).
Vzorky stoniek a strukov fazule obyčajnej s typickými príznakmi plesne bielej (miera napadnutia: 10 – 30 %) boli zozbierané z komerčných fariem. Hoci väčšina infikovaných rastlinných materiálov bola identifikovaná podľa druhu/odrody (náchylná komerčná odroda Giza 3), iné, najmä tie získané z miestnych trhov, boli neznámeho druhu. Zozbierané infikované materiály boli najprv povrchovo dezinfikované 0,5 % roztokom chlórnanu sodného počas 3 minút, potom niekoľkokrát opláchnuté sterilnou destilovanou vodou a utrené dosucha sterilným filtračným papierom, aby sa odstránila prebytočná voda. Infikované orgány boli potom narezané na malé kúsky zo stredného tkaniva (medzi zdravým a infikovaným tkanivom), kultivované na zemiakovom dextrózovom agare (PDA) a inkubované pri teplote 25 ± 2 °C s 12-hodinovým cyklom svetlo/12-hodinová tma počas 5 dní, aby sa stimulovala tvorba sklerócií. Na čistenie izolátov húb zo zmiešaných alebo kontaminovaných kultúr bola použitá aj metóda mycéliovej špičky. Čistený izolát húb bol najprv identifikovaný na základe jeho kultivačných morfologických charakteristík a potom bol na základe mikroskopických znakov potvrdený ako S. sclerotiorum. Nakoniec boli všetky purifikované izoláty testované na patogenitu na citlivej odrode fazule obyčajnej Giza 3, aby sa splnili Kochove postuláty.
Okrem toho bol najinvazívnejší izolát S. sclerotiorum (izolát č. 3) ďalej potvrdený na základe sekvenovania interného transkribovaného spaceru (ITS), ako je opísané vo White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Stručne povedané, izoláty boli kultivované v zemiakovom dextrózovom bujóne (PDB) a inkubované pri teplote 25 ± 2 °C počas 5 – 7 dní. Hubové mycélium bolo potom zozbierané, prefiltrované cez gázu, dvakrát premyté sterilnou vodou a vysušené sterilným filtračným papierom. Genomická DNA bola izolovaná pomocou súpravy Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Oblasť ITS rDNA bola následne amplifikovaná pomocou špecifického páru primerov ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; očakávaná veľkosť: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska a kol., 2017). Purifikované PCR produkty boli odoslané na sekvenovanie (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Sekvencie ITS rDNA boli sekvenované obojsmerne pomocou Sangerovej sekvenovacej metódy. Zostavené dopytované sekvencie boli následne porovnané s najnovšími údajmi v GenBank a Národnom centre pre biotechnologické informácie (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) pomocou softvéru BLASTn. Dotazovaná sekvencia bola porovnaná s 20 ďalšími kmeňmi/izolátmi S. sclerotiorum získanými z najnovších údajov v NCBI GenBank (doplnková tabuľka S1) pomocou ClustalW v balíku Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; verzia 11) (Kumar a kol., 2024). Evolučná analýza bola vykonaná pomocou metódy maximálnej pravdepodobnosti a všeobecného modelu časovo reverzibilnej nukleotidovej substitúcie (Nei a Kumar, 2000). Je zobrazený strom s najvyššou logaritmickou pravdepodobnosťou. Počiatočný strom pre heuristické vyhľadávanie sa vyberie výberom stromu s vyššou logaritmickou pravdepodobnosťou medzi stromom spájania susedov (NJ) (Kumar a kol., 2024) a stromom maximálnej šetrnosti (MP). Strom NJ bol zostrojený pomocou párovej matice vzdialeností vypočítanej pomocou všeobecného časovo reverzibilného modelu (Nei a Kumar, 2000).
Antibakteriálna aktivita L-ornitínu a baktericídu „Rizolex-T“ bola stanovená in vitro metódou agarovej difúzie. Metóda: Odoberte príslušné množstvo zásobného roztoku L-ornitínu (500 mg/l) a dôkladne ho premiešajte s 10 ml živného média PDA, čím sa pripravia roztoky s konečnými koncentráciami 12,5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/l. Ako kontrola sa použilo päť koncentrácií fungicídu „Rizolex-T“ (2, 4, 6, 8 a 10 mg/l) a sterilná destilovaná voda. Po stuhnutí média sa do stredu Petriho misky preniesla čerstvo pripravená mycéliová zátka kultúry Sclerotinia sclerotiorum s priemerom 4 mm a kultivovala sa pri teplote 25 ± 2 °C, kým mycélium nepokrylo celú kontrolnú Petriho misku, po čom sa zaznamenal rast huby. Vypočítajte percentuálnu inhibíciu radiálneho rastu S. sclerotiorum pomocou rovnice 1:
Experiment sa opakoval dvakrát, so šiestimi biologickými replikáciami pre každú kontrolnú/experimentálnu skupinu a piatimi kvetináčmi (dve rastliny na kvetináč) pre každý biologický replikát. Každý biologický replikát sa analyzoval dvakrát (dve technické replikáty), aby sa zabezpečila presnosť, spoľahlivosť a reprodukovateľnosť experimentálnych výsledkov. Okrem toho sa na výpočet polovice maximálnej inhibičnej koncentrácie (IC50) a IC99 použila probitová regresná analýza (Prentice, 1976).
Na vyhodnotenie potenciálu L-ornitínu v skleníkových podmienkach sa uskutočnili dva po sebe idúce kvetináčové experimenty. Stručne povedané, kvetináče sa naplnili sterilizovanou ílovito-piesočnatou pôdou (3:1) a naočkovali sa čerstvo pripravenou kultúrou S. sclerotiorum. Najprv sa kultivoval najinvazívnejší izolát S. sclerotiorum (izolát č. 3) tak, že sa jedno sklerócium rozreže na polovicu, položí sa lícom nadol na PDA a inkubuje sa pri teplote 25 °C v konštantnej tme (24 hodín) počas 4 dní, aby sa stimuloval rast mycélia. Z predného okraja sa potom odobrali štyri agarové zátky s priemerom 5 mm a naočkovali sa 100 g sterilnej zmesi pšeničných a ryžových otrúb (1:1, obj./obj.) a všetky banky sa inkubovali pri teplote 25 ± 2 °C v 12-hodinovom cykle svetlo/12-hodinová tma počas 5 dní, aby sa stimulovala tvorba sklerócií. Obsah všetkých baniek sa pred pridaním pôdy dôkladne premiešal, aby sa zabezpečila homogenita. Potom sa do každého kvetináča pridalo 100 g kolonizačnej zmesi otrúb, aby sa zabezpečila konštantná koncentrácia patogénov. Naočkované kvetináče sa poliali, aby sa aktivoval rast húb, a na 7 dní sa umiestnili do skleníkových podmienok.
Do každého kvetináča bolo potom zasiatych päť semien odrody Giza 3. V kvetináčoch ošetrených L-ornitínom a fungicídom Rizolex-T boli sterilizované semená najskôr namočené na dve hodiny do vodného roztoku oboch zlúčenín s konečnou koncentráciou IC99 približne 250 mg/l a 50 mg/l a potom boli pred výsevom jednu hodinu sušené na vzduchu. Na druhej strane boli semená namočené v sterilnej destilovanej vode ako negatívna kontrola. Po 10 dňoch, pred prvým zalievaním, boli sadenice preriedené, pričom v každom kvetináči zostali iba dve čisté sadenice. Okrem toho, aby sa zabezpečila infekcia S. sclerotiorum, boli stonky fazule v rovnakom vývojovom štádiu (10 dní) odrezané na dvoch rôznych miestach pomocou sterilizovaného skalpela a do každej rany bolo umiestnených približne 0,5 g kolonizačnej zmesi otrúb, po čom nasledovala vysoká vlhkosť, aby sa stimulovala infekcia a rozvoj choroby vo všetkých naočkovaných rastlinách. Kontrolné rastliny boli podobne poranené a do rany bolo umiestnené rovnaké množstvo (0,5 g) sterilnej, nekolonizovanej zmesi otrúb a udržiavané vo vysokej vlhkosti, aby sa simulovalo prostredie pre rozvoj choroby a zabezpečila sa konzistentnosť medzi liečenými skupinami.
Metóda ošetrenia: Sadenice fazule boli zaliate 500 ml vodného roztoku L-ornitínu (250 mg/l) alebo fungicídu Rizolex-T (50 mg/l) zavlažovaním pôdy, potom bolo ošetrenie opakované trikrát v intervale 10 dní. Kontrolné skupiny ošetrené placebom boli zavlažované 500 ml sterilnej destilovanej vody. Všetky ošetrenia boli vykonané v skleníkových podmienkach (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % relatívna vlhkosť a fotoperióda 8 hodín svetla/16 hodín tmy). Všetky kvetináče boli zalievané každé dva týždne a mesačne ošetrované vyváženým NPK hnojivom (20-20-20, s 3,6 % síry a TE mikroelementmi; Zain Seeds, Egypt) v koncentrácii 3 – 4 g/l postrekom na listy podľa odporúčaní pre konkrétnu odrodu a pokynov výrobcu. Pokiaľ nie je uvedené inak, plne rozvinuté zrelé listy (2. a 3. list zhora) boli odobraté z každého biologického replikátu 72 hodín po ošetrení (hpt), homogenizované, spojené a uskladnené pri teplote -80 °C na ďalšie analýzy vrátane, ale nie výlučne, in situ histochemickej lokalizácie indikátorov oxidačného stresu, lipidovej peroxidácie, enzymatických a neenzymatických antioxidantov a génovej expresie.
Intenzita infekcie plesňou bielou sa hodnotila týždenne 21 dní po inokulácii (dpi) pomocou stupnice 1–9 (doplnková tabuľka S2) na základe stupnice Petzoldta a Dicksona (1996) upravenej Teranom a kol. (2006). Stručne povedané, stonky a konáre rastlín fazule sa skúmali od miesta inokulácie, aby sa sledoval postup lézií pozdĺž internódií a uzlov. Následne sa merala vzdialenosť lézie od miesta inokulácie k najvzdialenejšiemu bodu pozdĺž stonky alebo konára a na základe umiestnenia lézie sa priradilo skóre 1–9, kde (1) označovalo žiadnu viditeľnú infekciu v blízkosti miesta inokulácie a (2–9) označovalo postupné zväčšovanie veľkosti lézie a postup pozdĺž uzlov/internódií (doplnková tabuľka S2). Intenzita infekcie plesňou bielou sa potom prepočítala na percentá pomocou vzorca 2:
Okrem toho bola plocha pod krivkou progresie ochorenia (AUDPC) vypočítaná pomocou vzorca (Shaner a Finney, 1977), ktorý bol nedávno upravený pre bielu hnilobu fazule obyčajnej (Chauhan a kol., 2020) pomocou rovnice 3:
Kde Yi = závažnosť ochorenia v čase ti, Yi+1 = závažnosť ochorenia v ďalšom čase ti+1, ti = čas prvého merania (v dňoch), ti+1 = čas ďalšieho merania (v dňoch), n = celkový počet časových bodov alebo pozorovacích bodov. Parametre rastu fazule vrátane výšky rastliny (cm), počtu vetiev na rastlinu a počtu listov na rastlinu boli zaznamenávané týždenne počas 21 dní vo všetkých biologických replikátoch.
V každom biologickom opakovaní boli vzorky listov (druhý a tretí plne vyvinutý list zhora) odobraté 45. deň po ošetrení (15 dní po poslednom ošetrení). Každý biologický opakovanie pozostával z piatich kvetináčov (dve rastliny na kvetináč). Približne 500 mg rozdrveného tkaniva bolo použitých na extrakciu fotosyntetických pigmentov (chlorofyl a, chlorofyl b a karotenoidy) s použitím 80 % acetónu pri teplote 4 °C v tme. Po 24 hodinách boli vzorky centrifugované a supernatant bol odobratý na kolorimetrické stanovenie obsahu chlorofylu a, chlorofylu b a karotenoidov pomocou spektrofotometra UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonsko) podľa metódy (Lichtenthaler, 1987) meraním absorbancie pri troch rôznych vlnových dĺžkach (A470, A646 a A663 nm). Nakoniec bol obsah fotosyntetických pigmentov vypočítaný pomocou nasledujúcich vzorcov 4–6, ktoré opísal Lichtenthaler (1987).
72 hodín po ošetrení (hpt) sa z každého biologického replikátu odobrali listy (druhý a tretí plne vyvinutý list zhora) na histochemickú lokalizáciu peroxidu vodíka (H2O2) a superoxidového aniónu (O2•−) in situ. Každý biologický replikát pozostával z piatich kvetináčov (dve rastliny na kvetináč). Každý biologický replikát sa analyzoval duplicitne (dva technické replikáty), aby sa zabezpečila presnosť, spoľahlivosť a reprodukovateľnosť metódy. H2O2 a O2•− sa stanovili pomocou 0,1 % 3,3′-diaminobenzidínu (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemecko) alebo nitromodrej tetrazolia (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemecko) podľa metód opísaných Romero-Puertasom a kol. (2004) a Adamom a kol. (1989) s menšími úpravami. Na histochemickú lokalizáciu H2O2 in situ boli lístky vákuovo infiltrované 0,1 % DAB v 10 mM Tris pufri (pH 7,8) a potom inkubované pri izbovej teplote na svetle počas 60 minút. Listy boli odfarbené v 0,15 % (v/v) TCA v zmesi etanol:chloroform 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Káhira, Egypt) a potom vystavené svetlu, kým nestmavli. Podobne boli chlopne vákuovo infiltrované 10 mM fosforečnanovým pufrom draselným (pH 7,8) obsahujúcim 0,1 hm./v. % HBT na histochemickú lokalizáciu O2•− in situ. Listy boli inkubované na svetle pri izbovej teplote počas 20 minút, potom odfarbené ako vyššie a potom osvetlené, kým sa neobjavili tmavomodré/fialové škvrny. Intenzita výslednej hnedej (ako indikátor H2O2) alebo modrofialovej (ako indikátor O2•−) farby bola hodnotená pomocou verzie balíka na spracovanie obrazu ImageJ pre Fiji (http://fiji.sc; prístup 7. marca 2024).
Malondialdehyd (MDA; ako marker lipidovej peroxidácie) bol stanovený podľa metódy Du a Bramlage (1992) s miernymi úpravami. Listy z každého biologického replikátu (druhý a tretí plne vyvinutý list zhora) boli zozbierané 72 hodín po ošetrení (hpt). Každý biologický replikát obsahoval päť kvetináčov (dve rastliny na kvetináč). Každý biologický replikát bol analyzovaný duplicitne (dva technické replikáty), aby sa zabezpečila presnosť, spoľahlivosť a reprodukovateľnosť metódy. Stručne povedané, 0,5 g mletého listového tkaniva bolo použitých na extrakciu MDA s 20 % kyselinou trichlóroctovou (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) obsahujúcou 0,01 % butylovaného hydroxytoluénu (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Obsah MDA v supernatante bol potom stanovený kolorimetricky meraním absorbancie pri 532 a 600 nm pomocou spektrofotometra UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonsko) a potom vyjadrený ako nmol g−1 FW.
Na stanovenie neenzymatických a enzymatických antioxidantov boli listy (druhý a tretí plne vyvinutý list zhora) odobraté z každého biologického replikátu 72 hodín po ošetrení (hpt). Každý biologický replikát pozostával z piatich kvetináčov (dve rastliny na kvetináč). Každá biologická vzorka bola analyzovaná duplicitne (dve technické vzorky). Dva listy boli rozomleté ​​tekutým dusíkom a použité priamo na stanovenie enzymatických a neenzymatických antioxidantov, celkových aminokyselín, obsahu prolínu, génovej expresie a kvantifikácie oxalátu.
Celkový obsah rozpustných fenolov bol stanovený pomocou Folin-Ciocalteuovho činidla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) s miernymi úpravami metódy opísanej Kahkonenom a kol. (1999). Stručne povedané, približne 0,1 g homogenizovaného listového tkaniva bolo extrahovaných 20 ml 80 % metanolu v tme počas 24 hodín a supernatant bol zozbieraný po centrifugácii. 0,1 ml extraktu vzorky bolo zmiešaných s 0,5 ml Folin-Ciocalteuovho činidla (10 %), pretrepávaných 30 sekúnd a ponechaných v tme 5 minút. Potom bolo do každej skúmavky pridaných 0,5 ml 20 % roztoku uhličitanu sodného (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Káhira, Egypt), dôkladne premiešaných a inkubovaných pri izbovej teplote v tme počas 1 hodiny. Po inkubácii bola absorbancia reakčnej zmesi meraná pri 765 nm pomocou UV-160A spektrofotometra (Shimadzu Corporation, Japonsko). Koncentrácia celkových rozpustných fenolov v extraktoch vzoriek bola stanovená pomocou kalibračnej krivky kyseliny galovej (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) a vyjadrená v miligramoch ekvivalentu kyseliny galovej na gram čerstvej hmotnosti (mg GAE g-1 čerstvej hmotnosti).
Celkový obsah rozpustných flavonoidov bol stanovený podľa metódy Djeridane a kol. (2006) s miernymi úpravami. Stručne povedané, 0,3 ml vyššie uvedeného metanolového extraktu bolo zmiešaných s 0,3 ml 5 % roztoku chloridu hlinitého (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), dôkladne premiešaných a potom inkubovaných pri izbovej teplote počas 5 minút, po čom nasledovalo pridanie 0,3 ml 10 % roztoku octanu draselného (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Káhira, Egypt), dôkladne premiešaných a inkubovaných pri izbovej teplote počas 30 minút v tme. Po inkubácii bola absorbancia reakčnej zmesi meraná pri 430 nm pomocou spektrofotometra UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonsko). Koncentrácia celkových rozpustných flavonoidov v extraktoch vzoriek bola stanovená pomocou kalibračnej krivky rutínu (TCI America, Portland, OR, USA) a potom vyjadrená v miligramoch ekvivalentu rutínu na gram čerstvej hmotnosti (mg RE g-1 čerstvej hmotnosti).
Celkový obsah voľných aminokyselín v listoch fazule bol stanovený pomocou modifikovaného ninhydrínového činidla (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) na základe metódy navrhnutej Yokoyamom a Hiramatsuom (2003) a upravenej Sunom a kol. (2006). Stručne povedané, 0,1 g mletého tkaniva bolo extrahovaných pufrom s pH 5,4 a 200 μl supernatantu reagovalo s 200 μl ninhydrínu (2 %) a 200 μl pyridínu (10 %; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), inkubovalo sa 30 minút vo vriacom vodnom kúpeli, potom sa ochladilo a meralo pri 580 nm pomocou spektrofotometra UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonsko). Na druhej strane, prolín bol stanovený Batesovou metódou (Bates a kol., 1973). Prolín bol extrahovaný 3 % kyselinou sulfosalicylovou (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) a po centrifugácii bolo 0,5 ml supernatantu zmiešaných s 1 ml ľadovej kyseliny octovej (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) a ninhydrínovým činidlom, inkubovaných pri 90 °C počas 45 minút, ochladených a meraných pri 520 nm pomocou rovnakého spektrofotometra ako je uvedené vyššie. Celkové voľné aminokyseliny a prolín v extraktoch z listov boli stanovené pomocou kalibračných kriviek glycínu a prolínu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a vyjadrené ako mg/g čerstvej hmotnosti.
Na stanovenie enzymatickej aktivity antioxidačných enzýmov sa približne 500 mg homogenizovaného tkaniva extrahovalo 3 ml 50 mM Tris pufra (pH 7,8) obsahujúceho 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a 7,5 % polyvinylpyrolidónu (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugovalo sa pri 10 000 × g počas 20 minút v chladničke (4 °C) a supernatant (surový enzýmový extrakt) sa zozbieral (El-Nagar a kol., 2023; Osman a kol., 2023). Kataláza (CAT) potom reagovala s 2 ml 0,1 M fosfátového pufra sodného (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a 100 μl 269 mM roztoku H2O2, aby sa stanovila jej enzymatická aktivita podľa metódy Aebiho (1984) s miernymi úpravami (El-Nagar a kol., 2023; Osman a kol., 2023). Enzymatická aktivita guajakol-dependentnej peroxidázy (POX) sa stanovila metódou podľa Harracha a kol. (2009). (2008) s menšími úpravami (El-Nagar a kol., 2023; Osman a kol., 2023) a enzymatická aktivita polyfenoloxidázy (PPO) bola stanovená po reakcii s 2,2 ml 100 mM fosfátového pufra sodného (pH 6,0), 100 μl guajakolu (TCI chemicals, Portland, OR, USA) a 100 μl 12 mM H2O2. Metóda bola mierne upravená oproti (El-Nagar a kol., 2023; Osman a kol., 2023). Stanovenie bolo vykonané po reakcii s 3 ml roztoku katecholu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) čerstvo pripraveného v 0,1 M fosfátovom pufri (pH 6,0). Aktivita CAT sa merala monitorovaním rozkladu H2O2 pri 240 nm (A240), aktivita POX sa merala monitorovaním nárastu absorbancie pri 436 nm (A436) a aktivita PPO sa merala zaznamenávaním fluktuácií absorbancie pri 495 nm (A495) každých 30 sekúnd počas 3 minút pomocou spektrofotometra UV-160A (Shimadzu, Japonsko).
Na detekciu hladín transkriptov troch génov súvisiacich s antioxidantmi, vrátane peroxizomálnej katalázy (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxiddismutázy (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1) a glutatiónreduktázy (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), v listoch fazule (druhý a tretí plne vyvinutý list zhora) 72 hodín po poslednom ošetrení sa použila RT-PCR v reálnom čase. Stručne povedané, RNA sa izolovala pomocou súpravy Simply P Total RNA Extraction Kit (kat. č. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Čína) podľa protokolu výrobcu. Potom sa cDNA syntetizovala pomocou súpravy TOP script™ cDNA Synthesis Kit podľa pokynov výrobcu. Sekvencie primerov vyššie uvedených troch génov sú uvedené v doplnkovej tabuľke S3. Ako gén pre správu génov bol použitý PvActin-3 (prístupové číslo GenBank: XM_068616709.1) a relatívna expresia génu bola vypočítaná pomocou metódy 2-ΔΔCT (Livak a Schmittgen, 2001). Bola preukázaná stabilita aktínu pri biotickom strese (nekompatibilná interakcia medzi bežnými strukovinami a antraknóznou hubou Colletotrichum lindemuthianum) a abiotickom strese (sucho, slanosť, nízka teplota) (Borges a kol., 2012).
Najprv sme vykonali celogenómovú in silico analýzu proteínov oxaloacetát acetylhydrolázy (OAH) v S. sclerotiorum pomocou nástroja proteín-proteín BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul a kol., 1997, 2005). Stručne povedané, použili sme OAH z Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxid: 1191702; prístupové číslo GenBank XP_040799428.1; 342 aminokyselín) a Penicillium lagena (PlOAH; taxid: 94218; prístupové číslo GenBank XP_056833920.1; 316 aminokyselín) ako dotazovacie sekvencie na mapovanie homológneho proteínu v S. sclerotiorum (taxid: 5180). BLASTp sa vykonal na najnovších dostupných údajoch o genóme S. sclerotiorum v databáze GenBank na webovej stránke Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Okrem toho bol pomocou metódy maximálnej pravdepodobnosti v MEGA11 (Tamura a kol., 2021) a modelu založeného na matici JTT (Jones a kol., 1992) odvodený predpokladaný gén OAH zo S. sclerotiorum (SsOAH) a evolučná analýza a fylogenetický strom AfOAH z A. fijiensis CBS 313.89 a PlOAH z P. lagena. Fylogenetický strom bol kombinovaný s analýzou viacnásobného zarovnania proteínových sekvencií všetkých predpokladaných génov OAH (SsOAH) zo S. sclerotiorum a dotazovanej sekvencie pomocou nástroja Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos a Agarwala, 2007). Okrem toho boli najlepšie zhodné aminokyselinové sekvencie SsOAH z S. sclerotiorum zarovnané s dotazovanými sekvenciami (AfOAH a PlOAH) (Larkin a kol., 2007) pomocou ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) a konzervované oblasti v zarovnaní boli vizualizované pomocou nástroja ESPript (verzia 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Okrem toho boli predpokladané funkčné reprezentatívne domény a konzervované miesta S. sclerotiorum SsOAH interaktívne klasifikované do rôznych čeľadí pomocou nástroja InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum a kol., 2021). Nakoniec bolo vykonané trojrozmerné (3D) modelovanie štruktúry predpokladaného S. sclerotiorum SsOAH pomocou nástroja Protein Homology/Analogy Recognition Engine (server Phyre2 verzia 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley a kol., 2015) a validované pomocou servera SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini a kol., 2014). Predpovedané trojrozmerné štruktúry (formát PDB) boli interaktívne vizualizované pomocou balíka UCSF-Chimera (verzia 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen a kol., 2004).
Na stanovenie transkripčnej hladiny oxaloacetát acetylhydrolázy (SsOAH; GenBank evidenčné číslo: XM_001590428.1) v mycéliu Sclerotinia sclerotiorum sa použila kvantitatívna real-time fluorescenčná PCR. Stručne povedané, S. sclerotiorum sa naočkoval do banky obsahujúcej PDB a umiestnil sa do trepacieho inkubátora (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) pri teplote 25 ± 2 °C počas 24 hodín pri 150 ot./min. a v konštantnej tme (24 hodín) na stimuláciu rastu mycélia. Následne sa bunky ošetrili L-ornitínom a fungicídom Rizolex-T v konečných koncentráciách IC50 (približne 40 a 3,2 mg/l) a potom sa kultivovali ďalších 24 hodín za rovnakých podmienok. Po inkubácii boli kultúry centrifugované pri 2500 ot./min. počas 5 minút a supernatant (hubové mycélium) bol zozbieraný na analýzu génovej expresie. Podobne bolo hubové mycélium zozbierané 0, 24, 48, 72, 96 a 120 hodín po infekcii z infikovaných rastlín, ktoré mali na povrchu infikovaných tkanív bielu pleseň a vatovité mycélium. RNA bola extrahovaná z hubového mycélia a potom bola syntetizovaná cDNA, ako je opísané vyššie. Sekvencie primerov pre SsOAH sú uvedené v doplnkovej tabuľke S3. SsActin (prístupové číslo GenBank: XM_001589919.1) bol použitý ako gén pre údržbu a relatívna génová expresia bola vypočítaná pomocou metódy 2-ΔΔCT (Livak a Schmittgen, 2001).
Kyselina šťaveľová bola stanovená v zemiakovom dextrózovom bujóne (PDB) a vo vzorkách rastlín obsahujúcich hubový patogén Sclerotinia sclerotiorum podľa metódy Xu a Zhanga (2000) s miernymi úpravami. Stručne povedané, izoláty S. sclerotiorum boli naočkované do baniek obsahujúcich PDB a potom kultivované v trepacom inkubátore (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) pri 150 ot./min. a teplote 25 ± 2 °C počas 3 – 5 dní v konštantnej tme (24 h), aby sa stimuloval rast mycélia. Po inkubácii bola hubová kultúra najprv prefiltrovaná cez filtračný papier Whatman #1 a potom centrifugovaná pri 2500 ot./min. počas 5 minút, aby sa odstránilo zvyškové mycélium. Supernatant bol zozbieraný a uskladnený pri 4 °C na ďalšie kvantitatívne stanovenie oxalátu. Na prípravu vzoriek rastlín bolo približne 0,1 g fragmentov rastlinného tkaniva trikrát extrahovaných destilovanou vodou (zakaždým 2 ml). Vzorky sa potom centrifugovali pri 2500 ot./min. počas 5 minút, supernatant sa sucho prefiltroval cez filtračný papier Whatman č. 1 a zozbieral sa na ďalšiu analýzu.
Na kvantitatívnu analýzu kyseliny šťaveľovej sa reakčná zmes pripravila v sklenenej skúmavke so zátkou v nasledujúcom poradí: 0,2 ml vzorky (alebo filtrátu kultúry PDB alebo štandardného roztoku kyseliny šťaveľovej), 0,11 ml brómfenolovej modrej (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M kyseliny sírovej (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Káhira, Egypt) a 0,176 ml 100 mM dvojchrómanu draselného (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA) a potom sa roztok zriedil destilovanou vodou na 4,8 ml, dôkladne sa premiešal a ihneď sa umiestnil do vodného kúpeľa s teplotou 60 °C. Po 10 minútach sa reakcia zastavila pridaním 0,5 ml roztoku hydroxidu sodného (NaOH; 0,75 M). Absorbancia (A600) reakčnej zmesi sa merala pri 600 nm pomocou spektrofotometra UV-160 (Shimadzu Corporation, Japonsko). PDB a destilovaná voda sa použili ako kontroly na kvantifikáciu kultivačných filtrátov a rastlinných vzoriek. Koncentrácie kyseliny šťaveľovej vo kultivačných filtrátoch, vyjadrené v mikrogramoch kyseliny šťaveľovej na mililiter média PDB (μg.mL−1), a v extraktoch listov, vyjadrené v mikrogramoch kyseliny šťaveľovej na gram čerstvej hmotnosti (μg.g−1 FW), sa stanovili pomocou kalibračnej krivky kyseliny šťaveľovej (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
V celej štúdii boli všetky experimenty navrhnuté v úplne randomizovanom dizajne (CRD) so šiestimi biologickými replikáciami na ošetrenie a piatimi kvetináčmi na biologickú replikáciu (dve rastliny na kvetináč), pokiaľ nebolo uvedené inak. Biologické replikáty boli analyzované duplicitne (dve technické replikáty). Technické replikáty boli použité na kontrolu reprodukovateľnosti toho istého experimentu, ale neboli použité v štatistickej analýze, aby sa predišlo falošným replikátom. Dáta boli štatisticky analyzované pomocou analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukey-Kramerov test na overenie významnosti rozdielu (HSD) (p ≤ 0,05). Pre experimenty in vitro boli hodnoty IC50 a IC99 vypočítané pomocou probitového modelu a boli vypočítané 95 % intervaly spoľahlivosti.
Celkovo boli zozbierané štyri izoláty z rôznych sójových polí v guvernoráte El Ghabiya v Egypte. Na PDA médiu všetky izoláty produkovali krémovo biele mycélium, ktoré sa v štádiu sklerócia rýchlo zmenilo na vatovito bielu (obrázok 1A) a potom na béžovú alebo hnedú. Sklerócie sú zvyčajne husté, čierne, guľovité alebo nepravidelného tvaru, dlhé 5,2 až 7,7 mm a s priemerom 3,4 až 5,3 mm (obrázok 1B). Hoci sa u štyroch izolátov po 10 – 12 dňoch inkubácie pri teplote 25 ± 2 °C vyvinul okrajový vzor sklerócií na okraji kultivačného média (obr. 1A), počet sklerócií na platňu sa medzi nimi významne líšil (P < 0,001), pričom izolát 3 mal najvyšší počet sklerócií (32,33 ± 1,53 sklerócií na platňu; obr. 1C). Podobne izolát č. 3 produkoval v PDB viac kyseliny šťaveľovej ako iné izoláty (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Obr. 1D). Izolát č. 3 vykazoval typické morfologické a mikroskopické vlastnosti fytopatogénnej huby Sclerotinia sclerotiorum. Napríklad na PDA kolónie izolátu č. 3 rástli rýchlo, boli krémovo biele (Obrázok 1A), reverzne béžové alebo svetlo lososovo žltohnedé a na úplné pokrytie povrchu platne s priemerom 9 cm im trvalo 6 – 7 dní pri teplote 25 ± 2 °C. Na základe vyššie uvedených morfologických a mikroskopických charakteristík bol izolát č. 3 identifikovaný ako Sclerotinia sclerotiorum.
Obrázok 1. Charakteristika a patogenita izolátov S. sclerotiorum z bežných strukovín. (A) Rast mycélia štyroch izolátov S. sclerotiorum na médiu PDA, (B) sklerócie štyroch izolátov S. sclerotiorum, (C) počet sklerócií (na platňu), (D) sekrécia kyseliny šťaveľovej na médiu PDB (μg.mL−1) a (E) závažnosť ochorenia (%) štyroch izolátov S. sclerotiorum na citlivej komerčnej odrode strukovín Giza 3 v skleníkových podmienkach. Hodnoty predstavujú priemer ± štandardná odchýlka piatich biologických opakovaní (n = 5). Rôzne písmená označujú štatisticky významné rozdiely medzi ošetreniami (p < 0,05). (F–H) Typické príznaky bielej plesne sa objavili na nadzemných stonkách a silikátoch 10 dní po inokulácii izolátom č. 3 (dpi). (I) Evolučná analýza oblasti interného transkribovaného spaceru (ITS) izolátu S. sclerotiorum č. 3 bola vykonaná metódou maximálnej pravdepodobnosti a porovnaná s 20 referenčnými izolátmi/kmeňmi získanými z databázy Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Čísla nad zhlukovacími čiarami označujú pokrytie oblasti (%) a čísla pod zhlukovacími čiarami označujú dĺžku vetvy.
Okrem toho, na potvrdenie patogenity, boli štyri získané izoláty S. sclerotiorum použité na inokuláciu náchylného komerčného kultivaru fazule Giza 3 v skleníkových podmienkach, čo je v súlade s Kochovými postulátmi (Obr. 1E). Hoci všetky získané izoláty húb boli patogénne a mohli infikovať zelenú fazuľu (kultivátor Giza 3), čo spôsobovalo typické príznaky bielej plesne na všetkých nadzemných častiach (Obr. 1F), najmä na stonkách (Obr. 1G) a strukoch (Obr. 1H) 10 dní po inokulácii (dpi), izolát 3 bol najagresívnejším izolátom v dvoch nezávislých experimentoch. Izolát 3 mal najvyššiu závažnosť ochorenia (%) na rastlinách fazule (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 a 76,7 ± 3,1 7, 14 a 21 dní po infekcii; Obrázok 1F).
Identifikácia najinvazívnejšieho izolátu S. sclerotiorum č. 3 bola ďalej potvrdená na základe sekvenovania interného transkribovaného medzerníka (ITS) (obr. 1I). Fylogenetická analýza medzi izolátom č. 3 a 20 referenčnými izolátmi/kmeňmi ukázala vysokú podobnosť (> 99 %). Za zmienku stojí, že izolát S. sclerotiorum č. 3 (533 bp) má vysokú podobnosť s americkým izolátom S. sclerotiorum LPM36 izolovaným zo suchých semien hrachu (prístupové číslo GenBank MK896659.1; 540 bp) a čínskym izolátom S. sclerotiorum YKY211 (prístupové číslo GenBank OR206374.1; 548 bp), ktorý spôsobuje hnilobu stonky fialovej (Matthiola incana), pričom všetky sú zoskupené samostatne v hornej časti dendrogramu (obrázok 1I). Nová sekvencia bola uložená v databáze NCBI a pomenovaná „Sclerotinia sclerotiorum – izolát YN-25“ (prístupové číslo GenBank PV202792). Je zrejmé, že izolát 3 je najinvazívnejší izolát; preto bol tento izolát vybraný na štúdium vo všetkých nasledujúcich experimentoch.
Antibakteriálna aktivita diamínu L-ornitínu (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemecko) v rôznych koncentráciách (12,5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/l) proti izolátu 3 S. sclerotiorum bola skúmaná in vitro. Je pozoruhodné, že L-ornitín mal antibakteriálny účinok a postupne inhiboval radiálny rast hýf S. sclerotiorum spôsobom závislým od dávky (obrázok 2A, B). Pri najvyššej testovanej koncentrácii (125 mg/l) preukázal L-ornitín najvyššiu mieru inhibície rastu mycélia (99,62 ± 0,27 %; obrázok 2B), čo bolo ekvivalentné komerčnému fungicídu Rizolex-T (miera inhibície 99,45 ± 0,39 %; obrázok 2C) pri najvyššej testovanej koncentrácii (10 mg/l), čo naznačuje podobnú účinnosť.
Obrázok 2. Antibakteriálna aktivita L-ornitínu proti Sclerotinia sclerotiorum in vitro. (A) Porovnanie antibakteriálnej aktivity rôznych koncentrácií L-ornitínu proti S. sclerotiorum s komerčným fungicídom Rizolex-T (10 mg/l). (B, C) Miera inhibície (%) rastu mycélia S. sclerotiorum po ošetrení rôznymi koncentráciami L-ornitínu (12,5, 25, 50, 75, 100 a 125 mg/l) alebo Rizolex-T (2, 4, 6, 8 a 10 mg/l). Hodnoty predstavujú priemer ± štandardná odchýlka piatich biologických opakovaní (n = 5). Rôzne písmená označujú štatistické rozdiely medzi ošetreniami (p < 0,05). (D, E) Regresná analýza L-ornitínu a komerčného fungicídu Rizolex-T pomocou Probitového modelu. Regresná priamka probitového modelu je zobrazená ako plná modrá čiara a interval spoľahlivosti (95 %) je zobrazený ako prerušovaná červená čiara.
Okrem toho bola vykonaná probitová regresná analýza a zodpovedajúce grafy sú uvedené v tabuľke 1 a na obrázkoch 2D,E. Stručne povedané, prijateľná hodnota sklonu (y = 2,92x − 4,67) a súvisiace významné štatistické údaje (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 a p < 0,0001; obrázok 2D) L-ornitínu naznačovali zvýšenú antifungálnu aktivitu proti S. sclerotiorum v porovnaní s komerčným fungicídom Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 a p < 0,0001) (tabuľka 1).
Tabuľka 1. Hodnoty polovičnej maximálnej inhibičnej koncentrácie (IC50) a IC99 (mg/l) L-ornitínu a komerčného fungicídu „Rizolex-T“ proti S. sclerotiorum.
Celkovo L-ornitín (250 mg/l) významne znížil vývoj a závažnosť bielej plesne na ošetrených rastlinách fazule obyčajnej v porovnaní s neošetrenými rastlinami infikovanými S. sclerotiorum (kontrola; obrázok 3A). Stručne povedané, hoci závažnosť ochorenia neošetrených infikovaných kontrolných rastlín sa postupne zvyšovala (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 a 92,33 ± 3,06 %), L-ornitín významne znížil závažnosť ochorenia (%) počas celého experimentu (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 a 26,36 ± 3,07) 7, 14 a 21 dní po ošetrení (dpt) (obrázok 3A). Podobne, keď boli rastliny fazule infikované S. sclerotiorum ošetrené 250 mg/l L-ornitínu, plocha pod krivkou progresie ochorenia (AUDPC) sa znížila z 1274,33 ± 33,13 v neošetrenej kontrole na 281,03 ± 7,95, čo bolo o niečo menej ako v prípade pozitívnej kontroly s fungicídom Rizolex-T 50 mg/l (183,61 ± 7,71; obr. 3B). Rovnaký trend sa pozoroval aj v druhom experimente.
Obr. 3. Vplyv exogénnej aplikácie L-ornitínu na vývoj bielej hniloby fazule obyčajnej spôsobenej Sclerotinia sclerotiorum v skleníkových podmienkach. (A) Krivka progresie ochorenia bielej plesne fazule obyčajnej po ošetrení 250 mg/l L-ornitínu. (B) Plocha pod krivkou progresie ochorenia (AUDPC) bielej plesne fazule obyčajnej po ošetrení L-ornitínom. Hodnoty predstavujú priemer ± štandardná odchýlka piatich biologických opakovaní (n = 5). Rôzne písmená označujú štatisticky významné rozdiely medzi ošetreniami (p < 0,05).
Exogénna aplikácia 250 mg/l L-ornitínu postupne zvyšovala výšku rastlín (obr. 4A), počet vetiev na rastlinu (obr. 4B) a počet listov na rastlinu (obr. 4C) po 42 dňoch. Zatiaľ čo komerčný fungicíd Rizolex-T (50 mg/l) mal najväčší vplyv na všetky študované nutričné ​​parametre, exogénna aplikácia 250 mg/l L-ornitínu mala druhý najväčší účinok v porovnaní s neošetrenými kontrolami (obr. 4A–C). Na druhej strane, ošetrenie L-ornitínom nemalo významný vplyv na obsah fotosyntetických pigmentov chlorofylu a (obr. 4D) a chlorofylu b (obr. 4E), ale mierne zvýšilo celkový obsah karotenoidov (0,56 ± 0,03 mg/g surovej hmotnosti) v porovnaní s negatívnou kontrolou (0,44 ± 0,02 mg/g surovej hmotnosti) a pozitívnou kontrolou (0,46 ± 0,02 mg/g surovej hmotnosti; obr. 4F). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že L-ornitín nie je fytotoxický pre ošetrené strukoviny a dokonca môže stimulovať ich rast.
Obr. 4. Vplyv aplikácie exogénneho L-ornitínu na rastové charakteristiky a fotosyntetické pigmenty listov fazule infikovaných Sclerotinia sclerotiorum v skleníkových podmienkach. (A) Výška rastliny (cm), (B) Počet vetiev na rastlinu, (C) Počet listov na rastlinu, (D) Obsah chlorofylu a (mg g-1 surovej hmotnosti), (E) Obsah chlorofylu b (mg g-1 surovej hmotnosti), (F) Celkový obsah karotenoidov (mg g-1 surovej hmotnosti). Hodnoty predstavujú priemer ± štandardná odchýlka piatich biologických opakovaní (n = 5). Rôzne písmená označujú štatisticky významné rozdiely medzi ošetreniami (p < 0,05).
Histochemická lokalizácia reaktívnych foriem kyslíka (ROS; vyjadrených ako peroxid vodíka [H2O2]) a voľných radikálov (vyjadrených ako superoxidové anióny [O2•−]) in situ ukázala, že exogénna aplikácia L-ornitínu (250 mg/l) významne znížila akumuláciu H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; obr. 5A) a O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; obr. 5B) v porovnaní s akumuláciou neošetrených infikovaných rastlín (173,31 ± 12,06 a 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) a rastlín ošetrených 50 mg/l komerčného fungicídu Rizolex-T (170,12 ± 9,50 a 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) po 72 hodinách. Vysoké hladiny H2O2 a O2•− sa akumulovali pri vysokom tlaku vody (hpt) (Obr. 5A, B). Podobne test s malondialdehydom (MDA) na báze TCA ukázal, že rastliny fazule infikované S. sclerotiorum akumulovali vo svojich listoch vyššie hladiny MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g from wt) (Obr. 5C). Exogénna aplikácia L-ornitínu však významne znížila lipidovú peroxidáciu, o čom svedčí zníženie obsahu MDA v ošetrených rastlinách (33,08 ± 4,00 nmol.g from wt).
Obr. 5. Vplyv aplikácie exogénneho L-ornitínu na hlavné markery oxidačného stresu a neenzymatické antioxidačné obranné mechanizmy v listoch fazule infikovaných S. sclerotiorum 72 hodín po infekcii v skleníkových podmienkach. (A) Peroxid vodíka (H2O2; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (B) superoxidový anión (O2•−; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (C) malondialdehyd (MDA; nmol g−1 FW) pri 72 hpt, (D) celkové rozpustné fenoly (mg GAE g−1 FW) pri 72 hpt, (E) celkové rozpustné flavonoidy (mg RE g−1 FW) pri 72 hpt, (F) celkové voľné aminokyseliny (mg g−1 FW) pri 72 hpt a (G) obsah prolínu (mg g−1 FW) pri 72 hpt. Hodnoty predstavujú priemer ± štandardnú odchýlku (priemer ± SD) 5 biologických opakovaní (n = 5). Rôzne písmená označujú štatisticky významné rozdiely medzi liečbami (p < 0,05).