Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu pre CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku zobrazovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Inzulínové nanočastice (NP) s vysokým obsahom náplne našli rôzne uplatnenie v rôznych dávkových formách. Cieľom tejto práce je vyhodnotiť vplyv procesov lyofilizácie a sušenia rozprašovaním na štruktúru chitosanových nanočastíc s náplňou inzulínu, s manitolom ako kryoprotektantom alebo bez neho. Kvalitu týchto nanočastíc sme tiež posúdili ich opätovným rozpustením. Pred dehydratáciou bola veľkosť častíc zosieťovaných nanočastíc chitosanu/tripolyfosfátu sodného/inzulínu optimalizovaná na 318 nm, PDI bol 0,18, účinnosť enkapsulácie bola 99,4 % a náplň bola 25,01 %. Po rekonštitúcii si všetky nanočastice, okrem tých, ktoré boli vyrobené lyofilizáciou bez použitia manitolu, zachovali svoju sférickú štruktúru častíc. V porovnaní s nanočasticami obsahujúcimi manitol dehydratovanými ktorýmkoľvek z týchto spôsobov rozprašovania, nanočastice sušené rozprašovaním bez manitolu tiež vykazovali najmenšiu priemernú veľkosť častíc (376 nm) a najvyšší obsah náplne (25,02 %) s podobnou mierou enkapsulácie (98,7 %) a PDI. (0,20) sušením alebo lyofilizáciou. Nanočastice sušené rozprašovaním bez manitolu tiež viedli k najrýchlejšiemu uvoľňovaniu inzulínu a najvyššej účinnosti bunkového vychytávania. Táto práca ukazuje, že rozprašovanie môže dehydratovať nanočastice inzulínu bez potreby kryoprotektantov v porovnaní s konvenčnými metódami lyofilizácie, čo vytvára významnú výhodu v podobe väčšej nosnosti, nižších požiadaviek na prísady a prevádzkových nákladov.
Od svojho objavenia v roku 19221,2,3 inzulín a jeho farmaceutické prípravky zachránili životy pacientov s diabetom 1. typu (T1DM) a diabetom 2. typu (T1DM). Avšak vzhľadom na svoje vlastnosti ako proteín s vysokou molekulovou hmotnosťou sa inzulín ľahko agreguje, rozkladá proteolytickými enzýmami a eliminuje sa pri prvom prechode. Ľudia s diagnózou diabetu 1. typu potrebujú inzulínové injekcie po zvyšok svojho života. Mnohí pacienti, u ktorých bola pôvodne diagnostikovaná cukrovka 2. typu, tiež potrebujú dlhodobé inzulínové injekcie. Denné inzulínové injekcie sú pre týchto jedincov vážnym zdrojom každodennej bolesti a nepohodlia s negatívnymi účinkami na duševné zdravie. V dôsledku toho sa intenzívne skúmajú iné formy podávania inzulínu, ktoré spôsobujú menšie nepohodlie, ako napríklad perorálne podávanie inzulínu5, pretože majú potenciál obnoviť kvalitu života približne 5 miliárd ľudí s diabetom na celom svete.
Technológia nanočastíc priniesla významný pokrok v pokusoch o perorálne podávanie inzulínu4,6,7. Taký, ktorý účinne zapuzdruje a chráni inzulín pred degradáciou pre cielené doručenie do špecifických miest tela. Použitie nanočasticových formulácií má však niekoľko obmedzení, najmä kvôli problémom so stabilitou suspenzií častíc. Počas skladovania môže dôjsť k určitej agregácii, čo znižuje biologickú dostupnosť nanočastíc s obsahom inzulínu8. Okrem toho je potrebné zvážiť aj chemickú stabilitu polymérnej matrice nanočastíc a inzulínu, aby sa zabezpečila stabilita inzulínových nanočastíc (NP). V súčasnosti je technológia lyofilizácie zlatým štandardom pre vytváranie stabilných NP a zároveň zabraňuje nežiaducim zmenám počas skladovania9.
Lyofilizácia však vyžaduje pridanie kryoprotektantov, aby sa zabránilo ovplyvneniu sférickej štruktúry NP mechanickým namáhaním ľadových kryštálikov. To výrazne znižuje zaťaženie inzulínovými nanočasticami po lyofilizácii, pretože kryoprotektant zaberá väčšinu hmotnostného pomeru. Preto sa vyrobené inzulínové NP často javia ako nevhodné na výrobu suchých práškových formulácií, ako sú perorálne tablety a perorálne filmy, kvôli potrebe veľkého množstva suchých nanočastíc na dosiahnutie terapeutického okna inzulínu.
Sušenie rozprašovaním je dobre známy a lacný priemyselný proces výroby suchých práškov z kvapalných fáz vo farmaceutickom priemysle10,11. Riadenie procesu tvorby častíc umožňuje správne zapuzdrenie niekoľkých bioaktívnych zlúčenín12, 13. Okrem toho sa stalo účinnou technikou na prípravu zapuzdrených proteínov na orálne podanie. Počas sušenia rozprašovaním sa voda veľmi rýchlo odparuje, čo pomáha udržiavať nízku teplotu jadra častice11,14, čo umožňuje jeho aplikáciu na zapuzdrenie zložiek citlivých na teplo. Pred sušením rozprašovaním by mal byť poťahový materiál dôkladne homogenizovaný s roztokom obsahujúcim zapuzdrené zložky11,14. Na rozdiel od lyofilizácie, homogenizácia pred zapuzdrením pri sušení rozprašovaním zlepšuje účinnosť zapuzdrenia počas dehydratácie. Keďže proces zapuzdrenia sušením rozprašovaním nevyžaduje kryoprotektanty, sušenie rozprašovaním sa môže použiť na výrobu sušených nanočastíc s vysokým obsahom náplne.
Táto štúdia opisuje produkciu nanočastíc s obsahom inzulínu zosieťovaním chitosanu a tripolyfosfátu sodného pomocou metódy iónového gélu. Iónová gélácia je metóda prípravy, ktorá umožňuje produkciu nanočastíc prostredníctvom elektrostatických interakcií medzi dvoma alebo viacerými iónovými druhmi za určitých podmienok. Na dehydratáciu optimalizovaných zosieťovaných nanočastíc chitosanu/tripolyfosfátu sodného/inzulínu sa použili techniky lyofilizácie aj sušenia rozprašovaním. Po dehydratácii sa ich morfológia analyzovala pomocou SEM. Ich rekombinačná schopnosť sa hodnotila meraním ich distribúcie veľkosti, povrchového náboja, PDI, účinnosti enkapsulácie a obsahu náplne. Kvalita resolubilizovaných nanočastíc vyrobených rôznymi metódami dehydratácie sa tiež hodnotila porovnaním ich ochrany voči inzulínu, správania sa pri uvoľňovaní a účinnosti bunkového vychytávania.
Hodnota pH zmiešaného roztoku a pomer chitosanu a inzulínu sú dva kľúčové faktory, ktoré ovplyvňujú veľkosť častíc a účinnosť enkapsulácie (EE) finálnych NP, pretože priamo ovplyvňujú proces ionotropnej gélácie. Ukázalo sa, že pH zmiešaného roztoku vysoko koreluje s veľkosťou častíc a účinnosťou enkapsulácie (Obr. 1a). Ako je znázornené na Obr. 1a, so zvýšením pH zo 4,0 na 6,0 sa priemerná veľkosť častíc (nm) znížila a EE sa výrazne zvýšila, zatiaľ čo keď sa pH zvýšilo na 6,5, priemerná veľkosť častíc sa začala zvyšovať a EE zostala nezmenená. So zvyšujúcim sa pomerom chitosanu k inzulínu sa zvyšuje aj priemerná veľkosť častíc. Okrem toho sa nepozorovala žiadna zmena EE, keď boli nanočastice pripravené s hmotnostným pomerom chitosanu/inzulínu vyššom ako 2,5:1 (hmotn./hmotn.) (Obr. 1b). Preto boli na prípravu v tejto štúdii použité optimálne podmienky prípravy (pH 6,0, hmotnostný pomer chitosanu/inzulínu 2,5:1). nanočastice s obsahom inzulínu na ďalšie štúdium. Za týchto podmienok prípravy bola priemerná veľkosť častíc nanočastíc inzulínu optimalizovaná na 318 nm (obr. 1c), PDI bol 0,18, účinnosť vnorenia bola 99,4 %, zeta potenciál bol 9,8 mv a obsah inzulínu bol 25,01 % (m/m). Na základe výsledkov transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM) boli optimalizované nanočastice zhruba sférické a diskrétne s relatívne jednotnou veľkosťou (obr. 1d).
Optimalizácia parametrov inzulínových nanočastíc: (a) vplyv pH na stredný priemer a účinnosť enkapsulácie (EE) inzulínových nanočastíc (pripravených pri hmotnostnom pomere chitosanu a inzulínu 5:1); (b) chitosan a vplyv hmotnostného pomeru inzulínu na stredný priemer a účinnosť enkapsulácie (EE) inzulínových NP (pripravených pri pH 6); (c) distribúcia veľkosti častíc optimalizovaných inzulínových nanočastíc; (d) TEM mikrofotografia optimalizovaných inzulínových NP.
Je dobre známe, že chitózan je slabý polyelektrolyt s pKa 6,5. V kyslom prostredí je kladne nabitý, pretože jeho hlavná aminoskupina je protonovaná vodíkovými iónmi15. Preto sa často používa ako nosič na zapuzdrenie negatívne nabitých makromolekúl. V tejto štúdii sa chitózan použil na zapuzdrenie inzulínu s izoelektrickým bodom 5,3. Keďže sa chitózan používa ako poťahový materiál, so zvyšujúcim sa podielom sa zodpovedajúcim spôsobom zvyšuje hrúbka vonkajšej vrstvy nanočastíc, čo vedie k väčšej priemernej veľkosti častíc. Okrem toho vyššie hladiny chitózanu dokážu zapuzdriť viac inzulínu. V našom prípade bola EE najvyššia, keď pomer chitózanu a inzulínu dosiahol 2,5:1, a nedošlo k žiadnej významnej zmene EE, keď sa pomer neustále zvyšoval.
Okrem pomeru chitózanu a inzulínu zohralo pri príprave nanočastíc kľúčovú úlohu aj pH. Gan a kol. 17 skúmali vplyv pH na veľkosť častíc nanočastíc chitózanu. Zistili kontinuálny pokles veľkosti častíc, až kým pH nedosiahlo 6,0, a pri pH > 6,0 sa pozoroval významný nárast veľkosti častíc, čo je v súlade s našimi pozorovaniami. Tento jav je spôsobený tým, že so zvyšujúcim sa pH molekula inzulínu získava negatívny povrchový náboj, čím podporuje elektrostatické interakcie s komplexom chitózanu/tripolyfosfátu sodného (TPP), čo vedie k malej veľkosti častíc a vysokej EE. Keď sa však pH upravilo na 6,5, aminoskupiny na chitózane boli deprotonované, čo viedlo k skladaniu chitózanu. Vysoké pH teda vedie k menšej expozícii aminoiónov TPP a inzulínu, čo má za následok nižšie zosieťovanie, väčšiu konečnú priemernú veľkosť častíc a nižšiu EE.
Analýza morfologických vlastností lyofilizovaných a rozprašovaním sušených nanočastíc môže usmerniť výber lepších techník dehydratácie a tvorby prášku. Preferovaná metóda by mala zabezpečiť stabilitu liečiva, jednotný tvar častíc, vysoké množstvo liečiva a dobrú rozpustnosť v pôvodnom roztoku. V tejto štúdii sa na lepšie porovnanie týchto dvoch techník počas dehydratácie použili inzulínové nanočastíce s 1 % manitolu alebo bez neho. Manitol sa používa ako plnidlo alebo kryoprotektant v rôznych suchých práškových formuláciách na lyofilizáciu a rozprašovanie. Pri lyofilizovaných inzulínových nanočasticiach bez manitolu, ako je znázornené na obrázku 2a, sa pod skenovacou elektrónovou mikroskopiou (SEM) pozorovala vysoko porézna prášková štruktúra s veľkými, nepravidelnými a drsnými povrchmi. Po dehydratácii sa v prášku detegovalo len málo samostatných častíc (obr. 2e). Tieto výsledky naznačujú, že väčšina NP sa počas lyofilizácie bez akéhokoľvek kryoprotektantu rozložila. Pri lyofilizovaných a rozprašovaním sušených inzulínových nanočastícach obsahujúcich 1 % manitolu sa pozorovali sférické nanočastíce s hladkými povrchmi (obr. 2b, d, f, h). Inzulínové nanočastíce sušené rozprašovaním bez manitolu zostali sférické, ale... zvráskavený na povrchu (obr. 2c). Sférické a zvráskavené povrchy sú ďalej diskutované v testoch správania sa pri uvoľňovaní a bunkovej absorpcie uvedených nižšie. Na základe viditeľného vzhľadu sušených nanočastíc, tak sušené rozprašovaním bez manitolu, ako aj lyofilizované a sušené rozprašovaním s manitolom, poskytli jemné prášky nanočastíc (obr. 2f, g, h). Čím väčšia je plocha medzi povrchmi častíc, tým vyššia je rozpustnosť, a teda aj vyššia je rýchlosť uvoľňovania.
Morfológia rôznych dehydratovaných inzulínových nanočastíc: (a) SEM snímka lyofilizovaných inzulínových nanočastíc bez manitolu; (b) SEM snímka lyofilizovaných inzulínových nanočastíc s manitolom; (c) sušené rozprašovaním inzulínové nanočastíce bez manitolu; SEM snímka; (d) SEM snímka inzulínových nanočastíc sušených rozprašovaním s manitolom; (e) snímka lyofilizovaného prášku inzulínových nanočastíc bez manitolu; (f) snímka lyofilizovaných inzulínových nanočastíc s manitolom; (g) snímka sušených práškových inzulínových nanočastíc bez manitolu; (h) snímka sušených práškových inzulínových nanočastíc s manitolom.
Počas lyofilizácie manitol pôsobí ako kryoprotektant, ktorý udržiava NP v amorfnej forme a zabraňuje poškodeniu ľadovými kryštálmi19. Naproti tomu počas sušenia rozprašovaním nie je potrebný krok zmrazovania. Preto manitol v tejto metóde nie je potrebný. V skutočnosti sušené rozprašovaním nanočastice bez manitolu poskytli jemnejšie NP, ako bolo opísané predtým. Manitol však môže stále pôsobiť ako plnivo v procese sušenia rozprašovaním, čím poskytuje NP guľovitejšiu štruktúru20 (obr. 2d), čo pomáha dosiahnuť rovnomerné uvoľňovanie takýchto enkapsulovaných NP. Okrem toho je zrejmé, že niektoré veľké častice možno detegovať v lyofilizovaných aj rozprašovaním sušených inzulínových NP obsahujúcich manitol (obr. 2b,d), čo môže byť spôsobené akumuláciou manitolu v jadre častice spolu s enkapsulovaným inzulínom. Vrstva chitosanu. Stojí za zmienku, že v tejto štúdii, aby sa zabezpečilo, že sférická štruktúra zostane po dehydratácii neporušená, sa pomer manitolu a chitosanu udržiava na hodnote 5:1, takže veľké množstvo plniva môže tiež zväčšiť veľkosť častíc sušených NP.
Spektroskopia s Fourierovou transformáciou v infračervenom spektre s oslabeným úplným odrazom (FTIR-ATR) charakterizovala fyzikálnu zmes voľného inzulínu, chitosanu, chitosanu, TPP a inzulínu. Všetky dehydratované nanočastice boli charakterizované pomocou FTIR-ATR spektroskopie. Najmä intenzity pásiem 1641, 1543 a 1412 cm-1 boli pozorované v enkapsulovaných nanočasticiach lyofilizovaných s manitolom a v nanočasticiach sušených rozprašovaním s manitolom a bez manitolu (obr. 3). Ako už bolo uvedené, toto zvýšenie pevnosti bolo spojené so zosieťovaním medzi chitosanom, TPP a inzulínom. Skúmanie interakcie medzi chitosanom a inzulínom ukázalo, že v FTIR spektrách nanočastíc chitosanu s obsahom inzulínu sa pás chitosanu prekrýval s pásiom inzulínu, čím sa zvýšila intenzita karbonylu (1641 cm-1) a amínového pásu (1543 cm-1). Tripolyfosfátové skupiny TPP sú v chitosane viazané na amóniové skupiny a tvoria pás pri 1412 cm-1.
FTIR-ATR spektrá voľného inzulínu, chitosanu, fyzikálnych zmesí chitosanu/TPP/inzulínu a NP dehydratovaných rôznymi metódami.
Tieto výsledky sú navyše v súlade s výsledkami získanými pomocou SEM, ktoré ukázali, že enkapsulované NP zostali neporušené pri striekaní aj lyofilizácii s manitolom, ale bez prítomnosti manitolu sa enkapsulované častice vytvorili iba sušením rozprašovaním. Naproti tomu spektrálne výsledky FTIR-ATR NP lyofilizovaných bez manitolu boli veľmi podobné fyzikálnej zmesi chitózanu, TPP a inzulínu. Tento výsledok naznačuje, že priečne väzby medzi chitózanom, TPP a inzulínom už nie sú prítomné v NP lyofilizovaných bez manitolu. Štruktúra NP bola počas lyofilizácie bez kryoprotektantu zničená, čo je možné vidieť na výsledkoch SEM (obr. 2a). Na základe morfológie a výsledkov FTIR dehydratovaných inzulínových NP boli na rekonštitučné experimenty použité iba lyofilizované, striekaním sušené a bezmanitolové NP a NP bez manitolu kvôli rozkladu NP bez manitolu počas dehydratácie. Diskutujte ďalej.
Dehydratácia sa používa na dlhodobé skladovanie a opätovné spracovanie na iné formulácie. Schopnosť suchých nanočastíc rekonštituovať sa po skladovaní je kľúčová pre ich použitie v rôznych formuláciách, ako sú tablety a filmy. Všimli sme si, že priemerná veľkosť častíc sušených inzulínových nanočastíc bez manitolu sa po rekonštitúcii zvýšila len mierne. Na druhej strane, veľkosť častíc sušených a lyofilizovaných inzulínových nanočastíc s manitolom sa významne zvýšila (Tabuľka 1). PDI a EE sa po rekombinácii všetkých nanočastíc v tejto štúdii významne nezmenili (p > 0,05) (Tabuľka 1). Tento výsledok naznačuje, že väčšina častíc zostala po opätovnom rozpustení neporušená. Pridanie manitolu však viedlo k výraznému zníženiu inzulínovej záťaže lyofilizovaných a sušených nanočastíc manitolu (Tabuľka 1). Naproti tomu obsah inzulínovej záťaže v nanočasticiach sušených rozprašovaním bez manitolu zostal rovnaký ako predtým (Tabuľka 1).
Je dobre známe, že množstvo nanočastíc je kritické pri použití na účely podávania liekov. Pre nanočastice s nízkym množstvom je na dosiahnutie terapeutického prahu potrebné veľmi veľké množstvo materiálu. Vysoká viskozita takýchto vysokých koncentrácií nanočastíc však vedie k nepríjemnostiam a ťažkostiam pri orálnom podávaní, respektíve injekčných formuláciách 22. Okrem toho sa inzulínové nanočastice môžu použiť aj na výrobu tabliet a viskóznych biofilmov 23, 24, čo si vyžaduje použitie veľkého množstva nanočastíc pri nízkych úrovniach množstva, čo vedie k veľkým tabletám a hrubým biofilmom, ktoré nie sú vhodné na orálne použitie. Preto sú dehydratované nanočastice s vysokým množstvom inzulínu veľmi žiaduce. Naše výsledky naznačujú, že vysoké množstvo inzulínu v nanočasticiach sušených rozprašovaním bez manitolu môže ponúknuť mnoho atraktívnych výhod pre tieto alternatívne metódy podávania.
Všetky dehydrované NP boli uchovávané v chladničke tri mesiace. Výsledky SEM ukázali, že morfológia všetkých dehydrovaných NP sa počas trojmesačného skladovania významne nezmenila (obr. 4). Po rekonštitúcii vo vode všetky NP vykazovali mierny pokles EE a uvoľnili približne malé množstvo (~5 %) inzulínu počas trojmesačného skladovania (tabuľka 2). Priemerná veľkosť častíc všetkých nanočastíc sa však zvýšila. Veľkosť častíc NP sušených rozprašovaním bez manitolu sa zvýšila na 525 nm, zatiaľ čo veľkosť častíc NP sušených rozprašovaním a lyofilizovaných NP s manitolom sa zvýšila na 872 a 921 nm (tabuľka 2).
Morfológia rôznych dehydratovaných inzulínových nanočastíc skladovaných tri mesiace: (a) SEM snímka lyofilizovaných inzulínových nanočastíc s manitolom; (b) SEM snímka sušených rozprašovaním inzulínových nanočastíc bez manitolu; (c) bez manitolu. SEM snímky sušených rozprašovaním inzulínových nanočastíc.
Okrem toho sa v rekonštituovaných inzulínových nanočasticiach sušených rozprašovaním s manitolom a lyofilizovaných (obr. S2) pozorovali zrazeniny. Môže to byť spôsobené tým, že veľké častice sa vo vode správne nesuspendujú. Všetky vyššie uvedené výsledky ukazujú, že technika sušenia rozprašovaním dokáže chrániť inzulínové nanočastice pred dehydratáciou a že vysoké množstvo inzulínových nanočastíc je možné dosiahnuť bez akýchkoľvek plnív alebo kryoprotektantov.
Retencia inzulínu bola testovaná v médiu s pH = 2,5 s pepsínom, trypsínom a α-chymotrypsínom, aby sa demonštrovala ochranná schopnosť nanočastíc (NP) proti enzymatickému tráveniu po dehydratácii. Retencia inzulínu v dehydratovaných NP bola porovnaná s retenciou čerstvo pripravených NP a voľný inzulín bol použitý ako negatívna kontrola. V tejto štúdii voľný inzulín preukázal rýchlu elimináciu inzulínu do 4 hodín vo všetkých troch enzymatických ošetreniach (Obr. 5a–c). Naproti tomu testovanie eliminácie inzulínu v lyofilizovaných NP s manitolom a v sušených rozprašovaním s manitolom alebo bez manitolu preukázalo významne vyššiu ochranu týchto NP proti enzymatickému tráveniu, ktorá bola podobná ochrane čerstvo pripravených inzulínových NP (obrázok 1).5a-c). S pomocou nanočastíc v pepsíne, trypsíne a α-chymotrypsíne bolo možné chrániť viac ako 50 %, 60 % a 75 % inzulínu do 4 hodín (Obr. 5a–c). Táto schopnosť chrániť inzulín môže zvýšiť pravdepodobnosť vyššej absorpcie inzulínu do krvného obehu25. Tieto výsledky naznačujú, že rozprašovanie... Sušenie s manitolom alebo bez manitolu a lyofilizácia s manitolom môžu zachovať schopnosť NP chrániť pred inzulínom po dehydratácii.
Ochranné a uvoľňovacie správanie dehydratovaných nanočastíc inzulínu: (a) ochrana inzulínu v roztoku pepsínu; (b) ochrana inzulínu v roztoku trypsínu; (c) ochrana inzulínu roztokom α-chymotrypsínu; (d) uvoľňovacie správanie dehydratovaných nanočastíc v roztoku s pH = 2,5; (e) uvoľňovacie správanie dehydratovaných nanočastíc v roztoku s pH = 6,6; (f) uvoľňovacie správanie dehydratovaných nanočastíc v roztoku s pH = 7,0.
Čerstvo pripravené a rekonštituované suché inzulínové NP boli inkubované v rôznych pufroch (pH = 2,5, 6,6, 7,0) pri teplote 37 °C, simulujúc pH prostredie žalúdka, dvanástnika a hornej časti tenkého čreva, aby sa preskúmal vplyv inzulínu na inzulínovú rezistenciu. Správanie pri uvoľňovaní v rôznych prostrediach. Fragment gastrointestinálneho traktu. Pri pH = 2,5 vykazovali inzulínom naplnené NP a resolubilizované suché inzulínové NP počiatočné prudké uvoľňovanie v priebehu prvej hodiny, po ktorom nasledovalo pomalé uvoľňovanie počas nasledujúcich 5 hodín (obr. 5d). Toto rýchle uvoľňovanie na začiatku je s najväčšou pravdepodobnosťou výsledkom rýchlej povrchovej desorpcie proteínových molekúl, ktoré nie sú úplne imobilizované vo vnútornej štruktúre častice. Pri pH = 6,5 vykazovali inzulínom naplnené NP a rekonštituované suché inzulínové NP plynulé a pomalé uvoľňovanie počas 6 hodín, pretože pH testovaného roztoku bolo podobné pH roztoku pripraveného s NP (obr. 5e). Pri pH = 7 boli NP nestabilné a takmer úplne sa rozložili v priebehu prvých dvoch hodín (obr. 5f). Je to preto, že deprotonácia chitosanu prebieha pri vyššom pH, čo vedie k menej kompaktnej polymérnej sieti a uvoľňovaniu naplneného inzulínu.
Okrem toho, inzulínové NP sušené rozprašovaním bez manitolu vykazovali rýchlejší profil uvoľňovania ako ostatné dehydrované NP (Obr. 5d–f). Ako už bolo opísané, rekonštituované inzulínové NP sušené bez manitolu vykazovali najmenšiu veľkosť častíc. Malé častice poskytujú väčší povrch, takže väčšina relevantného liečiva bude na povrchu častíc alebo v jeho blízkosti, čo vedie k rýchlemu uvoľňovaniu liečiva26.
Cytotoxicita NP bola skúmaná MTT testom. Ako je znázornené na obrázku S4, všetky dehydratované NP nemali významný vplyv na životaschopnosť buniek pri koncentráciách 50 – 500 μg/ml, čo naznačuje, že všetky dehydratované NP možno bezpečne použiť na dosiahnutie terapeutického okna.
Pečeň je hlavným orgánom, prostredníctvom ktorého inzulín vykonáva svoje fyziologické funkcie. Bunky HepG2 sú bunkovou líniou ľudského hepatómu, ktorá sa bežne používa ako model absorpcie hepatocytmi in vitro. V tomto prípade boli bunky HepG2 použité na posúdenie bunkovej absorpcie nanočastíc dehydratovaných metódami lyofilizácie a sušenia rozprašovaním. Bunková absorpcia bola stanovená konfokálnym laserovým skenovaním pomocou prietokovej cytometrie a videnia po niekoľkých hodinách inkubácie s voľným FITC inzulínom v koncentrácii 25 μg/ml, čerstvo pripravenými nanočasticami s obsahom FITC inzulínu a dehydratovanými nanočasticami s obsahom FITC inzulínu pri rovnakých koncentráciách inzulínu. Boli vykonané pozorovania kvantitatívnou mikroskopiou (CLSM). Lyofilizované nanočastice bez manitolu boli počas dehydratácie zničené a neboli v tomto teste hodnotené. Intenzity intracelulárnej fluorescencie čerstvo pripravených nanočastíc s obsahom inzulínu, lyofilizovaných nanočastíc s manitolom a nanočastíc sušených rozprašovaním s manitolom a bez manitolu (obr. 6a) boli 4,3, 2,6, 2,4 a 4,1-krát vyššie ako u voľných nanočastíc. Skupina FITC-inzulín, v uvedenom poradí. (Obr. 6b). Tieto výsledky naznačujú, že enkapsulovaný inzulín je v bunkovej absorpcii účinnejší ako voľný inzulín, najmä kvôli menšej veľkosti nanočastíc s obsahom inzulínu, ktoré boli v štúdii vytvorené.
Absorpcia bunkami HepG2 po 4 hodinách inkubácie s čerstvo pripravenými NP a dehydratovanými NP: (a) Distribúcia absorpcie FITC-inzulínu bunkami HepG2. (b) Geometrický priemer intenzít fluorescencie analyzovaných prietokovou cytometriou (n = 3), *P < 0,05 v porovnaní s voľným inzulínom.
Podobne snímky CLSM ukázali, že intenzity fluorescencie FITC čerstvo pripravených nanočastíc s obsahom FITC inzulínu a nanočastíc sušených rozprašovaním s obsahom FITC inzulínu (bez manitolu) boli oveľa silnejšie ako intenzity ostatných vzoriek (obr. 6a). Okrem toho, s pridaním manitolu vyššia viskozita roztoku zvýšila odolnosť voči bunkovému vychytávaniu, čo viedlo k zníženej proliferácii inzulínu. Tieto výsledky naznačujú, že nanočastice sušené rozprašovaním bez manitolu vykazovali najvyššiu účinnosť bunkového vychytávania, pretože ich veľkosť častíc bola po opätovnom rozpustení menšia ako veľkosť častíc lyofilizovaných nanočastíc.
Chitosan (priemerná molekulová hmotnosť 100 KDa, 75 – 85 % deacetylovaný) bol zakúpený od spoločnosti Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Tripolyfosfát sodný (TPP) bol zakúpený od spoločnosti VWR (Radnor, Pensylvánia, USA). Rekombinantný ľudský inzulín použitý v tejto štúdii bol od spoločnosti Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Ľudský inzulín značený fluoresceín izotiokyanátom (FITC) a 4',6-diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid (DAPI) boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Bunková línia HepG2 bola získaná od spoločnosti ATCC (Manassas, Virgínia, USA). Všetky ostatné činidlá boli analytickej alebo chromatografickej kvality.
Pripravte 1 mg/ml roztok CS rozpustením v dvojnásobne destilovanej vode (DD voda) obsahujúcej 0,1 % kyseliny octovej. Pripravte 1 mg/ml roztoky TPP a inzulínu rozpustením v DD vode a 0,1 % kyseline octovej. Predemulzia sa pripravila pomocou vysokorýchlostného homogenizátora Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Postup prípravy je nasledovný: najprv sa 2 ml roztoku TPP pridajú k 4 ml roztoku inzulínu a zmes sa mieša 30 minút a dôkladne sa premieša. Potom sa zmiešaný roztok po kvapkách pridá do roztoku CS pomocou injekčnej striekačky za vysokorýchlostného miešania (10 000 ot./min.). Zmesi sa udržiavajú za vysokorýchlostného miešania (15 000 ot./min.) v ľadovom kúpeli 30 minút a ich pH sa upraví na určité, aby sa získali zosieťované inzulínové NP. Na ďalšiu homogenizáciu a zníženie veľkosti častíc inzulínových NP sa sonikovali ďalších 30 minút v... ľadový kúpeľ s použitím sonikátora so sondou (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Nemecko).
Inzulínové NPS boli testované na Z-priemerný priemer, index polydisperzity (PDI) a zeta potenciál pomocou meraní dynamického rozptylu svetla (DLS) s použitím Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Rakúsko) ich zriedením v DD vode pri teplote 25 °C. Morfológia a distribúcia veľkosti boli charakterizované transmisným elektrónovým mikroskopom (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokio, Japonsko) a snímky boli následne analyzované pomocou zobrazovacieho softvéru Hitachi (Hitachi, Tokio, Japonsko). Na posúdenie účinnosti enkapsulácie (EE) a nosnosti (LC) inzulínových NP boli NP pipetované do ultrafiltračných skúmaviek s hraničnou molekulovou hmotnosťou 100 kDa a centrifugované pri 500 xg počas 30 minút. Neenkapsulovaný inzulín vo filtráte bol kvantifikovaný pomocou HPLC systému Agilent 1100 Series (Agilent, Santa Clara, Kalifornia, USA) pozostávajúceho z kvartérnej pumpy, automatického vzorkovača, ohrievača kolóny a DAD detektora. Inzulín bol analyzovaný. pomocou kolóny C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) a detekcia pri 214 nm. Mobilná fáza bola acetonitril a voda s obsahom 0,1 % TFA, gradientové pomery od 10/90 do 100/0, a čas pôsobenia bol 10 minút. Mobilná fáza bola čerpaná prietokom 1,0 ml/min. Teplota kolóny bola nastavená na 20 °C. Vypočítajte percentá EE a LC pomocou rovníc (1) a rovnice (2).
Na optimalizáciu nanočastíc inzulínu boli testované rôzne pomery CS/inzulín v rozmedzí od 2,0 do 4,0. Počas prípravy boli pridané rôzne množstvá roztoku CS, pričom zmes inzulínu/TPP bola udržiavaná konštantná. Nanočastice inzulínu boli pripravené v rozmedzí pH 4,0 až 6,5 starostlivou kontrolou pH zmesi po pridaní všetkých roztokov (inzulín, TPP a CS). EE a veľkosť častíc nanočastíc inzulínu boli hodnotené pri rôznych hodnotách pH a hmotnostných pomeroch CS/inzulín, aby sa optimalizovala tvorba nanočastíc inzulínu.
Optimalizované inzulínové NP boli umiestnené na hliníkovú nádobu a prikryté tkanivom, ktoré bolo utiahnuté páskou. Následne boli skrutkované nádoby umiestnené do lyofilizátora Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) vybaveného táckovým sušičom. Teplota a vákuum boli nastavené na -10 °C, 0,350 Torr počas prvých 2 hodín a 0 °C a 0,120 Torr počas zostávajúcich 22 hodín z 24 hodín, aby sa získali suché inzulínové NP.
Na výrobu enkapsulovaného inzulínu bol použitý rozprašovací sušič Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Švajčiarsko). Zvolené parametre sušenia boli: teplota 100 °C, prietok vstupnej zmesi 3 l/min a prietok plynu 4 l/min.
Nanočastice inzulínu pred a po dehydratácii boli charakterizované pomocou FTIR-ATR spektroskopie. Dehydratované nanočastice, ako aj voľný inzulín a chitosan, boli analyzované pomocou spektrofotometra Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) vybaveného univerzálnym ATR vzorkovacím príslušenstvom (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Priemery signálu boli získané zo 16 skenov s rozlíšením 4 cm2 vo frekvenčnom rozsahu 4000 – 600 cm2.
Morfológia suchých inzulínových nanočastíc bola hodnotená pomocou SEM snímok lyofilizovaných a rozprašovaním sušených inzulínových nanočastíc zachytených elektrónovým mikroskopom s fokusovaným iónovým lúčom (FIB-SEM) Helios NanoLab 650 (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Hlavným použitým parametrom bolo napätie 5 keV a prúd 30 mA.
Všetky dehydratované inzulínové NP boli znovu rozpustené v dehydratovanej vode. Veľkosť častíc, PDI, EE a LC boli opäť testované s použitím rovnakej metódy, aká bola spomenutá vyššie, aby sa posúdila ich kvalita po dehydratácii. Stabilita anhydroinzulínových NP bola tiež meraná testovaním vlastností NP po dlhodobom skladovaní. V tejto štúdii boli všetky NP po dehydratácii skladované v chladničke tri mesiace. Po troch mesiacoch skladovania boli NP testované na morfologickú veľkosť častíc, PDI, EE a LC.
Na vyhodnotenie účinnosti inzulínu pri ochrane NP po dehydratácii rozpustite 5 ml rekonštituovaných NP v 45 ml obsahujúcom simulovanú žalúdočnú tekutinu (pH 1,2, obsahujúcu 1 % pepsínu), črevnú tekutinu (pH 6,8, obsahujúcu 1 % trypsínu) alebo roztok chymotrypsínu (100 g/ml, vo fosfátovom pufri, pH 7,8). Inkubovali sa pri teplote 37 °C s rýchlosťou miešania 100 ot./min. V rôznych časových bodoch sa odobralo 500 μl roztoku a koncentrácia inzulínu sa stanovila pomocou HPLC.
Správanie čerstvo pripravených a dehydrovaných inzulínových nanočastíc pri uvoľňovaní in vitro bolo testované metódou dialyzačného vaku (hranica molekulovej hmotnosti 100 kDa, Spectra Por Inc.). Čerstvo pripravené a rekonštituované suché nanočastice boli dialyzované v tekutinách s pH 2,5, pH 6,6 a pH 7,0 (0,1 M fosfátom pufrovaný fyziologický roztok, PBS), aby sa simulovalo pH prostredie žalúdka, dvanástnika a hornej časti tenkého čreva. Všetky vzorky boli inkubované pri teplote 37 °C za neustáleho trepania pri 200 ot./min. Tekutinu mimo 5 ml dialyzačného vaku odsávajte v nasledujúcich časoch: 0,5, 1, 2, 3, 4 a 6 hodín a objem ihneď doplňte čerstvým dialyzátom. Kontaminácia inzulínom v tekutine bola analyzovaná pomocou HPLC a rýchlosť uvoľňovania inzulínu z nanočastíc bola vypočítaná z pomeru uvoľneného voľného inzulínu k celkovému inzulínu zapuzdrenému v nanočasticiach (rovnica 3).
Bunky ľudskej hepatocelulárnej karcinómovej bunkovej línie HepG2 boli pestované v miskách s priemerom 60 mm s použitím Dulbeccovho modifikovaného Eagleho média (DMEM) obsahujúceho 10 % fetálneho bovinného séra, 100 IU/ml penicilínu a 100 μg/ml streptomycínu29. Kultúry boli udržiavané pri teplote 37 °C, 95 % relatívnej vlhkosti a 5 % CO2. Pre testy absorpcie boli bunky HepG2 nasiate v množstve 1 × 105 buniek/ml na 8-jamkový systém komorových sklíčok Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, NY, USA). Pre testy cytotoxicity boli nasiate do 96-jamkových platní (Corning, NY, USA) v hustote 5 × 104 buniek/ml.
MTT test sa použil na vyhodnotenie cytotoxicity čerstvo pripravených a dehydratovaných inzulínových NP30. Bunky HepG2 boli nasadené do 96-jamkových platní s hustotou 5 × 10⁴ buniek/ml a kultivované 7 dní pred testovaním. Inzulínové NP boli zriedené na rôzne koncentrácie (50 až 500 μg/ml) v kultivačnom médiu a potom podané bunkám. Po 24 hodinách inkubácie boli bunky 3-krát premyté PBS a inkubované s médiom obsahujúcim 0,5 mg/ml MTT ďalšie 4 hodiny. Cytotoxicita bola hodnotená meraním enzymatickej redukcie žltého tetrazóliového MTT na purpurový formazan pri 570 nm pomocou spektrofotometra Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Švajčiarsko).
Účinnosť bunkového vychytávania NP bola testovaná konfokálnou laserovou skenovacou mikroskopiou a prietokovou cytometriou. Každá jamka systému Nunc Lab-Tek s komorovým sklíčkom bola ošetrená voľným FITC-inzulínom, NP s FITC-inzulínom a rekonštituovanými 25 μg/ml dehydratovanými NP FITC-inzulínu v rovnakej koncentrácii a inkubovaná 4 hodiny. Bunky boli 3-krát premyté PBS a fixované 4% paraformaldehydom. Jadrá boli farbené 4',6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI). Lokalizácia inzulínu bola pozorovaná pomocou laserového skenovacieho/dvojfotónového konfokálneho mikroskopu Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japonsko). Pre prietokovú cytometriu boli rovnaké koncentrácie 10 μg/ml voľného FITC-inzulínu, NP s FITC-inzulínom a resolubilizovaných dehydratovaných NP FITC-inzulínu pridané do 96-jamkových platní nasiatych bunkami HepG2 a inkubované 4 hodiny. Po 4 hodinách inkubácie boli bunky odstránené a 3-krát premyté FBS. 5 × 10⁴ buniek na vzorku bolo analyzovaných prietokovým cytometrom BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Spojené štáty).
Všetky hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka. Porovnania medzi všetkými skupinami boli hodnotené pomocou jednofaktorovej ANOVA alebo t-testu pomocou IBM SPSS Statistics 26 pre Mac (IBM, Endicott, New York, USA) a hodnota p < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.
Táto štúdia demonštruje flexibilitu a schopnosť sušenia rozprašovaním dehydratovať zosieťované nanočastice chitosanu/TPP/inzulínu s lepšou rekonštitúciou v porovnaní so štandardnými metódami sušenia mrazom s použitím objemových činidiel alebo kryoprotektantov a s vyššou nosnosťou. Optimalizované nanočastice inzulínu dosiahli priemernú veľkosť častíc 318 nm a účinnosť enkapsulácie 99,4 %. Výsledky SEM a FTIR po dehydratácii ukázali, že sférická štruktúra sa zachovala iba v nanočasticiach sušených rozprašovaním s manitolom a bez neho a lyofilizovaných s manitolom, ale lyofilizované nanočastice bez manitolu sa počas dehydratácie rozložili. V teste schopnosti rekonštitúcie vykazovali nanočastice inzulínu sušené rozprašovaním bez manitolu najmenšiu priemernú veľkosť častíc a najvyššie zaťaženie po rekonštitúcii. Správanie sa pri uvoľňovaní všetkých týchto dehydratovaných nanočastíc ukázalo, že sa rýchlo uvoľňovali v roztokoch s pH = 2,5 a pH = 7 a boli veľmi stabilné v roztoku s pH = 6,5. V porovnaní s inými znovu rozpustenými dehydratovanými nanočasticami vykazovali nanočastice sušené rozprašovaním bez manitolu najrýchlejšie... uvoľňovanie. Tento výsledok je v súlade s výsledkom pozorovaným v teste bunkovej absorpcie, pretože nanočastice sušené rozprašovaním bez manitolu si takmer úplne zachovali účinnosť bunkovej absorpcie čerstvo pripravených nanočastíc. Tieto výsledky naznačujú, že suché inzulínové nanočastice pripravené sušením rozprašovaním bez manitolu sú najvhodnejšie na ďalšie spracovanie na iné bezvodé liekové formy, ako sú perorálne tablety alebo bioadhezívne filmy.
Z dôvodu problémov s duševným vlastníctvom nie sú súbory údajov vygenerované a/alebo analyzované počas aktuálnej štúdie verejne dostupné, ale sú k dispozícii od príslušných autorov na základe odôvodnenej žiadosti.
Kagan, A. Diabetes 2. typu: spoločenský a vedecký pôvod, zdravotné komplikácie a dôsledky pre pacientov a ďalších. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. a Jiang, P. Vývoj enkapsulácie inzulínu: je teraz možné perorálne podávanie? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. a Dass, CR. Nedávny pokrok v perorálnych lipozómových systémoch s obsahom inzulínu na liečbu cukrovky. Interpretácia. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).