Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie najlepších výsledkov odporúčame používať novšiu verziu prehliadača (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Kyselina propiónová (PPA) sa používa na štúdium úlohy mitochondriálnej dysfunkcie pri neurovývojových poruchách, ako je porucha autistického spektra. Je známe, že PPA narúša mitochondriálnu biogenézu, metabolizmus a obmenu. Účinky PPA na mitochondriálnu dynamiku, štiepenie a fúziu však zostávajú problematické kvôli komplexnej časovej povahe týchto mechanizmov. V tejto štúdii používame komplementárne kvantitatívne zobrazovacie techniky na skúmanie toho, ako PPA ovplyvňuje mitochondriálnu ultraštruktúru, morfológiu a dynamiku v neurónom podobných bunkách SH-SY5Y. PPA (5 mM) spôsobila významný pokles mitochondriálnej plochy (p < 0,01), priemeru a obvodu Feretovej telieska (p < 0,05) a plochy 2 (p < 0,01). Analýza lokátora mitochondriálnych udalostí ukázala významný nárast (p < 0,05) udalostí štiepenia a fúzie, čím sa zachovala integrita mitochondriálnej siete v stresových podmienkach. Okrem toho bola významne znížená expresia mRNA cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) a OPA1 (p < 0,05). To ilustruje remodeláciu mitochondriálnej morfológie, biogenézy a dynamiky s cieľom udržať funkciu v stresových podmienkach. Naše údaje poskytujú nový pohľad na účinky PPA na mitochondriálnu dynamiku a zdôrazňujú užitočnosť zobrazovacích techník na štúdium komplexných regulačných mechanizmov zapojených do mitochondriálnych stresových reakcií.
Mitochondrie sú neoddeliteľnou súčasťou rôznych bunkových funkcií, ktoré presahujú ich typické úlohy v produkcii energie a biosyntéze. Mitochondriálny metabolizmus je kľúčovým regulátorom vápnikovej signalizácie, metabolickej a redoxnej homeostázy, zápalovej signalizácie, epigenetických modifikácií, proliferácie buniek, diferenciácie a programovanej bunkovej smrti1. Mitochondriálny metabolizmus je najmä kritický pre vývoj, prežitie a funkciu neurónov a je široko zapojený do rôznych prejavov neuropatológie2,3,4.
V poslednom desaťročí sa metabolický stav stal ústredným regulátorom neurogenézy, diferenciácie, dozrievania a plasticity5,6. V poslednej dobe sa mitochondriálna morfológia a dynamika stali obzvlášť dôležitými súčasťami mitózy, dynamického procesu, ktorý udržiava zásobu zdravých mitochondrií v bunkách. Mitochondriálna dynamika je regulovaná komplexnými vzájomne závislými dráhami od mitochondriálnej biogenézy a bioenergetiky až po mitochondriálne štiepenie, fúziu, transport a klírens7,8. Narušenie ktoréhokoľvek z týchto integračných mechanizmov narúša udržiavanie zdravých mitochondriálnych sietí a má hlboké funkčné dôsledky pre neurologický vývoj9,10. Dysregulácia mitochondriálnej dynamiky sa skutočne pozoruje pri mnohých psychiatrických, neurodegeneratívnych a neurovývojových poruchách vrátane porúch autistického spektra (PAS)11,12.
PAS je heterogénna neurovývojová porucha s komplexnou genetickou a epigenetickou architektúrou. Dedičnosť PAS je nespochybniteľná, ale základná molekulárna etiológia zostáva nedostatočne pochopená. Hromadiace sa údaje z predklinických modelov, klinických štúdií a multi-omických molekulárnych súborov údajov poskytujú stále viac dôkazov o mitochondriálnej dysfunkcii pri PAS13,14. Predtým sme vykonali skríning metylácie DNA v celom genóme u kohorty pacientov s PAS a identifikovali sme diferencovane metylované gény zoskupené pozdĺž mitochondriálnych metabolických dráh15. Následne sme hlásili diferenciálnu metyláciu centrálnych regulátorov mitochondriálnej biogenézy a dynamiky, ktorá bola spojená so zvýšeným počtom kópií mtDNA a zmeneným metabolickým profilom moču pri PAS16. Naše údaje poskytujú stále viac dôkazov o tom, že mitochondriálna dynamika a homeostáza zohrávajú ústrednú úlohu v patofyziológii PAS. Preto je zlepšenie mechanistického chápania vzťahu medzi mitochondriálnou dynamikou, morfológiou a funkciou kľúčovým cieľom prebiehajúceho výskumu neurologických ochorení charakterizovaných sekundárnou mitochondriálnou dysfunkciou.
Molekulárne techniky sa často používajú na štúdium úlohy špecifických génov v mitochondriálnych stresových reakciách. Tento prístup však môže byť obmedzený mnohostrannou a časovou povahou mechanizmov mitotickej kontroly. Okrem toho je diferenciálna expresia mitochondriálnych génov nepriamym indikátorom funkčných zmien, najmä preto, že sa typicky analyzuje iba obmedzený počet génov. Preto boli navrhnuté priamejšie metódy na štúdium mitochondriálnej funkcie a bioenergetiky17. Morfológia mitochondrií úzko súvisí s mitochondriálnou dynamikou. Tvar, konektivita a štruktúra mitochondrií sú rozhodujúce pre produkciu energie a prežitie mitochondrií a buniek5,18. Okrem toho sa rôzne zložky mitózy zameriavajú na zmeny v mitochondriálnej morfológii, ktoré môžu slúžiť ako užitočné koncové body mitochondriálnej dysfunkcie a poskytnúť základ pre následné mechanistické štúdie.
Mitochondriálnu morfológiu možno priamo pozorovať pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM), čo umožňuje detailné štúdium bunkovej ultraštruktúry. TEM priamo vizualizuje morfológiu, tvar a štruktúru mitochondriálnych kríst pri rozlíšení jednotlivých mitochondrií, namiesto toho, aby sa spoliehal výlučne na transkripciu génov, expresiu proteínov alebo mitochondriálne funkčné parametre v bunkových populáciách17,19,20. Okrem toho TEM uľahčuje štúdium interakcií medzi mitochondriami a inými organelami, ako je endoplazmatické retikulum a autofagozómy, ktoré hrajú kľúčovú úlohu v mitochondriálnej funkcii a homeostáze21,22. Vďaka tomu je TEM dobrým východiskovým bodom pre štúdium mitochondriálnej dysfunkcie predtým, ako sa zameria na špecifické dráhy alebo gény. Keďže mitochondriálna funkcia sa stáva čoraz relevantnejšou pre neuropatológiu, existuje jasná potreba byť schopný priamo a kvantitatívne študovať mitochondriálnu morfológiu a dynamiku v in vitro neuronálnych modeloch.
V tomto článku skúmame mitochondriálnu dynamiku v neuronálnom modeli mitochondriálnej dysfunkcie pri poruche autistického spektra. Predtým sme informovali o diferenciálnej metylácii propionyl-CoA karboxylázy beta (PCCB) v ASD15, podjednotke mitochondriálneho enzýmu propionyl-CoA karboxylázy PCC. Je známe, že dysregulácia PCC spôsobuje toxickú akumuláciu propionylových derivátov, vrátane kyseliny propiónovej (PPA)23,24,25. Ukázalo sa, že PPA narúša neuronálny metabolizmus a mení správanie in vivo a je zavedeným zvieracím modelom na štúdium neurovývojových mechanizmov zapojených do ASD26,27,28. Okrem toho sa uvádza, že PPA narúša mitochondriálny membránový potenciál, biogenézu a dýchanie in vitro a široko sa používa na modelovanie mitochondriálnej dysfunkcie v neurónoch29,30. Vplyv mitochondriálnej dysfunkcie indukovanej PPA na mitochondriálnu morfológiu a dynamiku však zostáva nedostatočne pochopený.
Táto štúdia využíva komplementárne zobrazovacie techniky na kvantifikáciu účinkov PPA na mitochondriálnu morfológiu, dynamiku a funkciu v bunkách SH-SY5Y. Najprv sme vyvinuli metódu TEM na vizualizáciu zmien v mitochondriálnej morfológii a ultraštruktúre17,31,32. Vzhľadom na dynamickú povahu mitochondrií33 sme tiež použili analýzu lokalizátora mitochondriálnych udalostí (MEL) na kvantifikáciu zmien v rovnováhe medzi štiepnymi a fúznymi udalosťami, počtom a objemom mitochondrií pri strese PPA. Nakoniec sme skúmali, či sú mitochondriálna morfológia a dynamika spojené so zmenami v expresii génov zapojených do biogenézy, štiepenia a fúzie. Naše údaje spolu ilustrujú výzvu objasniť komplexnosť mechanizmov regulujúcich mitochondriálnu dynamiku. Zdôrazňujeme užitočnosť TEM pri štúdiu mitochondriálnej morfológie ako merateľného konvergentného koncového bodu mitózy v bunkách SH-SY5Y. Okrem toho zdôrazňujeme, že údaje TEM poskytujú najbohatšie informácie v kombinácii so zobrazovacími technikami, ktoré tiež zachytávajú dynamické udalosti v reakcii na metabolický stres. Ďalšia charakterizácia molekulárnych regulačných mechanizmov, ktoré podporujú mitózu neuronálnych buniek, môže poskytnúť dôležitý pohľad na mitochondriálnu zložku nervového systému a neurodegeneratívne ochorenia.
Na vyvolanie mitochondriálneho stresu boli bunky SH-SY5Y ošetrené PPA s použitím 3 mM a 5 mM propionátu sodného (NaP). Pred TEM boli vzorky podrobené kryogénnej príprave vzoriek pomocou vysokotlakového zmrazovania a následného zmrazovania (Obr. 1a). Vyvinuli sme automatizovaný postup analýzy mitochondriálneho obrazu na meranie ôsmich morfologických parametrov mitochondriálnych populácií v troch biologických replikátoch. Zistili sme, že ošetrenie PPA významne zmenilo štyri parametre: plochu 2, plochu, obvod a Feretov priemer (Obr. 1b–e). Plocha 2 sa významne znížila pri ošetrení 3 mM aj 5 mM PPA (p = 0,0183 a p = 0,002) (Obr. 1b), zatiaľ čo plocha (p = 0,003), obvod (p = 0,0106) a Feretov priemer sa všetky významne znížili. V skupine liečenej 5 mM došlo k významnému zníženiu (p = 0,0172) v porovnaní s kontrolnou skupinou (Obr. 1c–e). Významné zmenšenie plochy a obvodu ukázalo, že bunky ošetrené 5 mM PPA mali menšie, zaoblenejšie mitochondrie a že tieto mitochondrie boli menej predĺžené ako mitochondrie v kontrolných bunkách. To je tiež v súlade s významným poklesom Feretovho priemeru, nezávislého parametra, ktorý naznačuje pokles najväčšej vzdialenosti medzi okrajmi častíc. Pozorovali sa zmeny v ultraštruktúre kríst: krísty sa stali menej výraznými pod vplyvom stresu PPA (obr. 1a, panel B). Nie všetky obrázky však jasne odrážali ultraštruktúru kríst, takže sa nevykonala kvantitatívna analýza týchto zmien. Tieto TEM údaje môžu odrážať tri možné scenáre: (1) PPA zvyšuje štiepenie alebo inhibuje fúziu, čo spôsobuje zmenšenie existujúcich mitochondrií; (2) zvýšená biogenéza vytvára nové, menšie mitochondrie alebo (3) indukuje oba mechanizmy súčasne. Hoci tieto podmienky nie je možné rozlíšiť pomocou TEM, významné morfologické zmeny naznačujú zmeny v mitochondriálnej homeostáze a dynamike pod stresom PPA. Následne sme preskúmali ďalšie parametre, aby sme ďalej charakterizovali túto dynamiku a potenciálne mechanizmy, ktoré sú jej základom.
Kyselina propiónová (PPA) prestavuje mitochondriálnu morfológiu. (a) Reprezentatívne snímky z transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM), ktoré ukazujú, že veľkosť mitochondrií sa zmenšuje a mitochondrie sa zmenšujú a zaoblenejšie so zvyšujúcou sa dávkou PPA; 0 mM (neošetrené), 3 mM a 5 mM. Červené šípky označujú mitochondrie. (b–e) Bunky SH-SY5Y ošetrené PPA počas 24 hodín boli pripravené na TEM a výsledky boli analyzované pomocou Fiji/ImageJ. Štyri z ôsmich parametrov vykazovali významné rozdiely medzi kontrolnými (neošetrené, 0 mM PPA) a ošetrenými (3 mM a 5 mM PPA) bunkami. (b) Oblasť 2, (c) Plocha, (d) Obvod, (e) Feretov priemer. Na stanovenie významných rozdielov (p < 0,05) sa použila jednosmerná analýza rozptylu (kontrola vs. ošetrená) a Dunnettov test viacnásobného porovnania. Dátové body predstavujú priemernú hodnotu mitochondrií pre každú jednotlivú bunku a chybové úsečky predstavujú priemer ± SEM. Zobrazené údaje predstavujú n = 3, najmenej 24 buniek na replikáciu; celkovo bolo analyzovaných 266 snímok; * označuje p < 0,05, ** označuje p < 0,01.
Aby sme ďalej charakterizovali, ako mitochondriálna dynamika reaguje na PPA, farbili sme mitochondrie tetrametylrodamínetylesterom (TMRE) a použili sme časozbernú mikroskopiu a MEL analýzu na lokalizáciu a kvantifikáciu mitochondrií po 24 hodinách pri 3 a 5 mM PPA. Liečba štiepnych a fúznych udalostí. (Obr. 2a). Po MEL analýze boli mitochondrie ďalej analyzované na kvantifikáciu počtu mitochondriálnych štruktúr a ich priemerného objemu. Pozorovali sme malý, ale významný nárast počtu štiepnych udalostí vyskytujúcich sa pri 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] v porovnaní so štiepením [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] a fúziou [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] a fúziou [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (<0,05)] pri 5 mM v porovnaní s kontrolou (Obr. 3b). Počet mitochondrií sa významne zvýšil pri 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] aj 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (obr. 3c), zatiaľ čo priemerný objem každej mitochondriálnej štruktúry zostal nezmenený (obr. 3c). 3d). Celkovo to naznačuje, že remodelácia mitochondriálnej dynamiky slúži ako kompenzačná reakcia, ktorá úspešne udržiava integritu mitochondriálnej siete. Zvýšenie počtu štiepnych udalostí pri 3 mM PPA naznačuje, že zvýšenie počtu mitochondrií je čiastočne spôsobené mitochondriálnym štiepením, ale vzhľadom na to, že priemerný objem mitochondrií zostáva v podstate nezmenený, nemožno vylúčiť biogenézu ako ďalšiu kompenzačnú reakciu. Tieto údaje sú však v súlade s menšími, okrúhlymi mitochondriálnymi štruktúrami pozorovanými pomocou TEM a tiež preukazujú významné zmeny v mitochondriálnej dynamike vyvolané PPA.
Kyselina propiónová (PPA) indukuje dynamickú mitochondriálnu remodeláciu, aby sa zachovala integrita siete. Bunky SH-SY5Y boli kultivované, ošetrené 3 a 5 mM PPA počas 24 hodín a farbené TMRE a Hoechst 33342, po čom nasledovala MEL analýza. (a) Reprezentatívne snímky z časozbernej mikroskopie zobrazujúce farebné a binarizované projekcie maximálnej intenzity v čase 2 (t2) pre každú podmienku. Vybrané oblasti označené na každom binárnom snímku sú zvýraznené a zobrazené v 3D v troch rôznych časových rámcoch (t1-t3) na ilustráciu dynamiky v priebehu času; fúzne udalosti sú zvýraznené zelenou farbou; štiepne udalosti sú zvýraznené zelenou farbou. Zobrazené červenou farbou. (b) Priemerný počet dynamických udalostí na podmienku. (c) Priemerný počet mitochondriálnych štruktúr na bunku. (d) Priemerný objem (µm3) každej mitochondriálnej štruktúry na bunku. Zobrazené údaje sú reprezentatívne pre n = 15 buniek na liečebnú skupinu. Zobrazené chybové úsečky predstavujú priemer ± SEM, mierka = 10 μm, * p < 0,05.
Kyselina propiónová (PPA) spôsobuje transkripčnú supresiu génov spojených s mitochondriálnou dynamikou. Bunky SH-SY5Y boli ošetrené 3 a 5 mM PPA počas 24 hodín. Relatívna kvantifikácia génov bola vykonaná pomocou RT-qPCR a normalizovaná na B2M. Gény mitochondriálnej biogenézy (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 a (d) NFE2L2. Gény mitochondriálnej fúzie a štiepenia (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 a (i) DRP1. Signifikantné rozdiely (p < 0,05) boli testované pomocou jednofaktorovej ANOVA (kontrola vs. liečba) a Dunnettovho testu viacnásobného porovnania: * označuje p < 0,05, ** označuje p < 0,01 a **** označuje p < 0,0001. Stĺpce predstavujú priemernú expresiu ± SEM. Zobrazené údaje predstavujú biologické replikáty v n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) a n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
Dáta z analýz TEM a MEL spoločne naznačujú, že PPA mení morfológiu a dynamiku mitochondrií. Tieto zobrazovacie techniky však neposkytujú prehľad o základných mechanizmoch, ktoré tieto procesy riadia. Preto sme skúmali expresiu mRNA deviatich kľúčových regulátorov mitochondriálnej dynamiky, biogenézy a mitózy v reakcii na liečbu PPA. Kvantifikovali sme onkogén bunkového myelómu (cMYC), jadrový respiračný faktor (NRF1), mitochondriálny transkripčný faktor 1 (TFAM), transkripčný faktor podobný NFE2 BZIP (NFE2L2), proteín podobný gastrínu 2 (STOML2), atrofiu zrakového nervu 1 (OPA1), mitofusín 1 (MFN1), mitofusín 2 (MFN2) a proteín súvisiaci s dynamínom 1 (DRP1) po 24 hodinách liečby 3 mM a 5 mM PPA. Pozorovali sme liečbu PPA v koncentrácii 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 a p < 0,0001) a 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) koncentrácie. (Obr. 3a–c). Pokles expresie mRNA bol závislý od dávky: expresia cMYC, NRF1 a TFAM sa pri 3 mM znížila 5,7-krát, 2,6-krát a 1,9-krát a pri 5 mM 11,2-krát, 3-krát a 2,2-krát. Naproti tomu centrálny gén redoxnej biogenézy NFE2L2 sa nezmenil pri žiadnej koncentrácii PPA, hoci sa pozoroval podobný trend zníženej expresie závislý od dávky (Obr. 3d).
Taktiež sme skúmali expresiu klasických génov zapojených do regulácie štiepenia a fúzie. Predpokladá sa, že STOML2 sa podieľa na fúzii, mitofágii a biogenéze a jeho expresia bola významne znížená (p < 0,0001) pri 3 mM (2,4-násobná zmena) a 5 mM (2,8-násobná zmena) PPA (Obr. 1). 3d). Podobne bola expresia fúzneho génu OPA1 znížená pri 3 mM (1,6-násobná zmena) a 5 mM (1,9-násobná zmena) PPA (p = 0,006 a p = 0,0024) (Obr. 3f). Nezistili sme však významné rozdiely v expresii fúznych génov MFN1, MFN2 alebo štiepneho génu DRP1 pri 24-hodinovom strese PPA (Obr. 3g–i). Okrem toho sme zistili, že hladiny štyroch fúznych a štiepnych proteínov (OPA1, MFN1, MFN2 a DRP1) sa za rovnakých podmienok nezmenili (obr. 4a–d). Je dôležité poznamenať, že tieto údaje odrážajú jeden časový bod a nemusia odrážať zmeny v expresii alebo hladinách aktivity proteínov počas skorých štádií stresu PPA. Významné zníženie expresie cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 a OPA1 však naznačuje významnú transkripčnú dysreguláciu mitochondriálneho metabolizmu, biogenézy a dynamiky. Okrem toho tieto údaje zdôrazňujú užitočnosť zobrazovacích techník na priame štúdium zmien konečného stavu mitochondriálnej funkcie.
Hladiny proteínov fúzneho a štiepneho faktora sa po ošetrení kyselinou propiónovou (PPA) nezmenili. Bunky SH-SY5Y boli ošetrené 3 a 5 mM PPA počas 24 hodín. Hladiny proteínov boli kvantifikované Western blot analýzou a hladiny expresie boli normalizované na celkový proteín. Zobrazená je priemerná expresia proteínov a reprezentatívne Western bloty cieľového a celkového proteínu. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Stĺpce predstavujú priemer ± SEM a zobrazené údaje sú reprezentatívne pre n = 3 biologické replikáty. Viacnásobné porovnania (p < 0,05) boli vykonané pomocou jednofaktorovej analýzy rozptylu a Dunnettovho testu. Pôvodný gél a blot sú znázornené na obrázku S1.
Mitochondriálna dysfunkcia je spojená s multisystémovými ochoreniami, od metabolických, kardiovaskulárnych a svalových ochorení až po neurologické ochorenia1,10. Mnohé neurodegeneratívne a neurodegeneratívne ochorenia sú spojené s mitochondriálnou dysfunkciou, čo zdôrazňuje dôležitosť týchto organel počas celého života mozgu. Medzi tieto ochorenia patrí Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba a ASD3,4,18. Prístup k mozgovému tkanivu na štúdium týchto ochorení je však zložitý, najmä na mechanistickej úrovni, čo robí bunkové modelové systémy nevyhnutnou alternatívou. V tejto štúdii používame bunkový modelový systém s použitím buniek SH-SY5Y ošetrených PPA na zhrnutie mitochondriálnej dysfunkcie pozorovanej pri neuronálnych ochoreniach, najmä pri poruchách autistického spektra. Použitie tohto PPA modelu na štúdium mitochondriálnej dynamiky v neurónoch môže poskytnúť pohľad na etiológiu ASD.
Preskúmali sme možnosť použitia TEM na sledovanie zmien v mitochondriálnej morfológii. Je dôležité poznamenať, že TEM sa musí používať správne, aby sa maximalizovala jeho účinnosť. Príprava kryo-vzoriek umožňuje lepšiu ochranu neuronálnych štruktúr súčasnou fixáciou bunkových komponentov a znížením tvorby artefaktov34. V súlade s tým sme pozorovali, že neurónom podobné bunky SH-SY5Y mali neporušené subcelulárne organely a predĺžené mitochondrie (obr. 1a). To zdôrazňuje užitočnosť kryogénnych prípravných techník na štúdium mitochondriálnej morfológie v modeloch neuronálnych buniek. Hoci kvantitatívne merania sú kľúčové pre objektívnu analýzu údajov TEM, stále neexistuje konsenzus o tom, aké špecifické parametre by sa mali merať na potvrdenie mitochondriálnych morfologických zmien. Na základe veľkého počtu štúdií, ktoré kvantitatívne skúmali mitochondriálnu morfológiu17,31,32, sme vyvinuli automatizovaný postup analýzy mitochondriálneho obrazu, ktorý meria osem morfologických parametrov, a to: plochu, plochu2, pomer strán, obvod, kruhovitosť, stupeň, Feretov priemer a kruhovitosť.
Spomedzi nich PPA významne znížila plochu 2, plochu, obvod a Feretov priemer (obr. 1b–e). To ukázalo, že mitochondrie sa zmenšili a zaoblili, čo je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami, ktoré preukázali pokles mitochondriálnej plochy po 72 hodinách mitochondriálneho stresu indukovaného PPA30. Tieto morfologické znaky môžu naznačovať mitochondriálne štiepenie, čo je nevyhnutný proces na sekvestráciu poškodených zložiek z mitochondriálnej siete s cieľom podporiť ich degradáciu prostredníctvom mitofágie35,36,37. Na druhej strane, pokles priemernej veľkosti mitochondrií môže byť spojený so zvýšenou biogenézou, ktorá vedie k tvorbe malých vznikajúcich mitochondrií. Zvýšené štiepenie alebo biogenéza predstavuje kompenzačnú reakciu na udržanie mitózy proti mitochondriálnemu stresu. Nemožno však vylúčiť znížený rast mitochondrií, zhoršenú fúziu alebo iné stavy.
Hoci snímky s vysokým rozlíšením vytvorené pomocou TEM umožňujú stanovenie morfologických charakteristík na úrovni jednotlivých mitochondrií, táto metóda vytvára dvojrozmerné snímky v jednom časovom bode. Na štúdium dynamických reakcií na metabolický stres sme farbili mitochondrie pomocou TMRE a použili sme časozbernú mikroskopiu s MEL analýzou, ktorá umožňuje vysokovýkonnú 3D vizualizáciu zmien v mitochondriálnej sieti v priebehu času33,38. Pozorovali sme jemné, ale významné zmeny v mitochondriálnej dynamike pri strese PPA (Obr. 2). Pri 3 mM sa počet štiepnych udalostí výrazne zvýšil, zatiaľ čo fúzne udalosti zostali rovnaké ako v kontrole. Pri 5 mM PPA sa pozoroval nárast počtu štiepnych aj fúznych udalostí, ale tieto zmeny boli približne proporcionálne, čo naznačuje, že kinetika štiepenia a fúzie dosahuje rovnováhu pri vyšších koncentráciách (Obr. 2b). Priemerný objem mitochondrií zostal nezmenený pri 3 aj 5 mM PPA, čo naznačuje, že integrita mitochondriálnej siete bola zachovaná (Obr. 2d). To odráža schopnosť dynamických mitochondriálnych sietí reagovať na mierny metabolický stres a účinne udržiavať homeostázu bez toho, aby spôsobovali fragmentáciu siete. Pri 3 mM PPA je zvýšenie štiepenia dostatočné na podporu prechodu do novej rovnováhy, ale v reakcii na stres vyvolaný vyššími koncentráciami PPA je potrebná hlbšia kinetická remodelácia.
Počet mitochondrií sa zvýšil pri oboch koncentráciách stresu PPA, ale priemerný objem mitochondrií sa významne nezmenil (obr. 2c). Môže to byť spôsobené zvýšenou biogenézou alebo zvýšeným delením; avšak pri absencii významného poklesu priemerného objemu mitochondrií je pravdepodobnejšie, že sa biosyntéza zvyšuje. Údaje na obrázku 2 však podporujú existenciu dvoch kompenzačných mechanizmov: zvýšenie počtu štiepnych udalostí, čo je v súlade so zvýšenou reguláciou mitochondriálneho štiepenia, a zvýšenie počtu udalostí, čo je v súlade s mitochondriálnou biogenézou. Dynamická kompenzácia mierneho stresu môže v konečnom dôsledku pozostávať zo simultánnych procesov zahŕňajúcich štiepenie, fúziu, biogenézu a mitofágiu. Hoci predchádzajúci autori preukázali, že PPA zvyšuje mitózu30,39 a mitofágiu29, my poskytujeme dôkazy o remodelácii dynamiky mitochondriálneho štiepenia a fúzie v reakcii na PPA. Tieto údaje potvrdzujú morfologické zmeny pozorované pomocou TEM a poskytujú ďalší pohľad na mechanizmy spojené s mitochondriálnou dysfunkciou indukovanou PPA.
Keďže ani TEM, ani MEL analýza neposkytli priamy dôkaz o mechanizmoch regulácie génov, ktoré sú základom pozorovaných morfologických zmien, skúmali sme expresiu RNA génov zapojených do mitochondriálneho metabolizmu, biogenézy a dynamiky. Protoonkogén cMYC je transkripčný faktor zapojený do regulácie mitochondrií, glykolýzy, metabolizmu aminokyselín a mastných kyselín40. Okrem toho je známe, že cMYC reguluje expresiu takmer 600 mitochondriálnych génov zapojených do mitochondriálnej transkripcie, translácie a zostavovania komplexov, vrátane NRF1 a TFAM41. NRF1 a TFAM sú dva centrálne regulátory mitózy, ktoré pôsobia v smere toku od PGC-1α a aktivujú replikáciu mtDNA. Táto dráha je aktivovaná signalizáciou cAMP a AMPK a je citlivá na energetický výdaj a metabolický stres. Skúmali sme tiež NFE2L2, redoxný regulátor mitochondriálnej biogenézy, aby sme zistili, či účinky PPA môžu byť sprostredkované oxidačným stresom.
Hoci expresia NFE2L2 zostala nezmenená, zistili sme konzistentný, na dávke závislý pokles expresie cMYC, NRF1 a TFAM po 24 hodinách liečby 3 mM a 5 mM PPA (obr. 3a–c). Zníženie expresie cMYC bolo predtým hlásené ako reakcia na mitochondriálny stres42 a naopak, zníženie expresie cMYC môže spôsobiť mitochondriálnu dysfunkciu remodeláciou mitochondriálneho metabolizmu, sieťovej konektivity a membránovej polarizácie43. Je zaujímavé, že cMYC sa tiež podieľa na regulácii mitochondriálneho štiepenia a fúzie42,43 a je známe, že zvyšuje fosforyláciu DRP1 a lokalizáciu mitochondrií počas bunkového delenia44, ako aj sprostredkováva mitochondriálnu morfologickú remodeláciu v neuronálnych kmeňových bunkách45. Fibroblasty s deficitom cMYC skutočne vykazujú zníženú veľkosť mitochondrií, čo je v súlade so zmenami vyvolanými stresom PPA43. Tieto údaje ilustrujú zaujímavý, ale zatiaľ nejasný vzťah medzi cMYC a mitochondriálnou dynamikou a poskytujú zaujímavý cieľ pre budúce štúdie remodelácie vyvolanej stresom PPA.
Zníženie NRF1 a TFAM je v súlade s úlohou cMYC ako dôležitého transkripčného aktivátora. Tieto údaje sú tiež v súlade s predchádzajúcimi štúdiami na ľudských bunkách rakoviny hrubého čreva, ktoré ukazujú, že PPA znížila expresiu mRNA NRF1 po 22 hodinách, čo bolo spojené s depléciou ATP a zvýšením ROS46. Títo autori tiež uviedli, že expresia TFAM sa zvýšila po 8,5 hodinách, ale vrátila sa na východiskové úrovne po 22 hodinách. Naproti tomu Kim a kol. (2019) ukázali, že expresia mRNA TFAM bola po 4 hodinách stresu PPA v bunkách SH-SY5Y významne znížená; po 72 hodinách však bola expresia proteínu TFAM významne zvýšená a počet kópií mtDNA bol významne zvýšený. Pokles počtu génov mitochondriálnej biogenézy, ktorý sme pozorovali po 24 hodinách, teda nevylučuje možnosť, že zvýšenie počtu mitochondrií je spojené s aktiváciou biogenézy v skorších časových bodoch. Predchádzajúce štúdie ukázali, že PPA významne zvyšuje reguláciu mRNA a proteínu PGC-1α v bunkách SH-SY5Y po ​​4 hodinách a 30 minútach, zatiaľ čo kyselina propiónová zvyšuje mitochondriálnu biogenézu v teľacích hepatocytoch prostredníctvom PGC-1α po 12 hodinách a 39 minútach. Je zaujímavé, že PGC-1α nie je len priamym transkripčným regulátorom NRF1 a TFAM, ale bolo preukázané, že reguluje aj aktivitu MFN2 a DRP1 reguláciou štiepenia a fúzie47. Celkovo to zdôrazňuje úzke prepojenie mechanizmov regulujúcich mitochondriálne kompenzačné reakcie indukované PPA. Naše údaje navyše odrážajú významnú dysreguláciu transkripčnej regulácie biogenézy a metabolizmu pri strese PPA.
Gény STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 a DRP1 patria medzi centrálne regulátory mitochondriálneho štiepenia, fúzie a dynamiky37,48,49. Existuje mnoho ďalších génov zapojených do mitochondriálnej dynamiky, avšak STOML2, OPA1 a MFN2 boli predtým zistené ako diferencovane metylované v kohortách ASD16 a niekoľko nezávislých štúdií zaznamenalo zmeny v týchto transkripčných faktoroch v reakcii na mitochondriálny stres50,51.52. Expresia OPA1 aj STOML2 bola významne znížená ošetrením 3 mM a 5 mM PPA (obr. 3e, f). OPA1 je jedným z klasických regulátorov mitochondriálnej fúzie prostredníctvom priamej interakcie s MFN1 a 2 a hrá úlohu v remodelácii krist a mitochondriálnej morfológii53. Presná úloha STOML2 v mitochondriálnej dynamike zostáva nejasná, ale dôkazy naznačujú, že hrá úlohu v mitochondriálnej fúzii, biogenéze a mitofágii.
STOML2 sa podieľa na udržiavaní mitochondriálnej respiračnej väzby a tvorby komplexov dýchacích reťazcov54,55 a preukázalo sa, že výrazne mení metabolické vlastnosti rakovinových buniek56. Štúdie ukázali, že STOML2 podporuje mitochondriálny membránový potenciál a biogenézu prostredníctvom interakcie s BAN a kardiolipínom 55, 57, 58. Okrem toho nezávislé štúdie ukázali, že interakcia medzi STOML2 a PINK1 reguluje mitofágiu59,60. Je pozoruhodné, že STOML2 priamo interaguje s MFN2 a stabilizuje ho a tiež hrá dôležitú úlohu pri stabilizácii dlhých izoforiem OPA1 inhibíciou proteázy zodpovednej za degradáciu OPA153,61,62. Zníženie expresie STOML2 pozorované v reakciách PPA môže spôsobiť, že tieto fúzne proteíny budú náchylnejšie na degradáciu prostredníctvom dráh závislých od ubikvitínu a proteazómu48. Hoci presná úloha STOML2 a OPA1 v dynamickej odpovedi na PPA nie je jasná, znížená expresia týchto fúznych génov (obrázok 3) môže narušiť rovnováhu medzi štiepením a fúziou a viesť k zníženiu veľkosti mitochondrií (obrázok 3). 1).
Na druhej strane, expresia proteínu OPA1 zostala po 24 hodinách nezmenená, zatiaľ čo hladiny mRNA a proteínov MFN1, MFN2 alebo DRP1 sa po ošetrení PPA významne nezmenili (obr. 3g-i, obr. 4). To môže naznačovať, že nedošlo k žiadnym zmenám v regulácii týchto faktorov zapojených do mitochondriálnej fúzie a štiepenia. Stojí však za zmienku, že každý z týchto štyroch génov je tiež regulovaný posttranskripčnými modifikáciami (PTM), ktoré riadia aktivitu proteínu. OPA1 má osem alternatívnych zostrihových variantov, ktoré sú proteolyticky štiepené v mitochondriách za vzniku dvoch odlišných izoform 63. Rovnováha medzi dlhými a krátkymi izoformami v konečnom dôsledku určuje úlohu OPA1 v mitochondriálnej fúzii a udržiavaní mitochondriálnej siete64. Aktivita DRP1 je regulovaná fosforyláciou vápnik/kalmodulín-dependentnej proteínkinázy II (CaMKII), zatiaľ čo degradácia DRP1 je regulovaná ubikvitináciou a SUMOyláciou65. Nakoniec, DRP1 aj MFN1/2 sú GTPázy, takže aktivita môže byť ovplyvnená rýchlosťou produkcie GTP v mitochondriách 66. Preto, hoci expresia týchto proteínov zostáva konštantná, nemusí to odrážať nezmenenú aktivitu alebo lokalizáciu proteínov 67, 68. Existujúce repertoáre PTM proteínov často slúžia ako prvá obranná línia zodpovedná za sprostredkovanie akútnych stresových reakcií. V prítomnosti mierneho metabolického stresu v našom modeli je pravdepodobné, že PTM podporuje zvýšenú aktivitu fúznych a štiepnych proteínov, aby sa dostatočne obnovila mitochondriálna integrita bez potreby dodatočnej aktivácie týchto génov na úrovni mRNA alebo proteínu.
Vyššie uvedené údaje spoločne zdôrazňujú komplexnú a časovo závislú reguláciu mitochondriálnej morfológie a výzvy spojené s objasnením týchto mechanizmov. Na štúdium génovej expresie je najprv potrebné identifikovať špecifické cieľové gény v dráhe. Naše údaje však ukazujú, že gény v tej istej dráhe nereagujú rovnakým spôsobom na rovnaký stres. Predchádzajúce štúdie dokonca ukázali, že rôzne gény v tej istej dráhe môžu vykazovať rôzne časové profily odozvy30,46. Okrem toho existujú komplexné posttranskripčné mechanizmy, ktoré narúšajú vzťah medzi transkripciou a funkciou génov. Proteomické štúdie môžu poskytnúť prehľad o vplyve PTM a funkcie proteínov, ale predstavujú aj výzvy vrátane metód s nízkou priepustnosťou, vysokého pomeru signálu k šumu a nízkeho rozlíšenia.
V tejto súvislosti má štúdium mitochondriálnej morfológie pomocou TEM a MEL veľký potenciál riešiť základné otázky o vzťahu medzi mitochondriálnou dynamikou a funkciou a o tom, ako to ovplyvňuje ochorenie. Najdôležitejšie je, že TEM poskytuje priamu metódu na meranie mitochondriálnej morfológie ako konvergentného koncového bodu mitochondriálnej dysfunkcie a dynamiky51. MEL tiež poskytuje priamu metódu na vizualizáciu štiepnych a fúznych udalostí v trojrozmernom bunkovom prostredí, čo umožňuje kvantifikáciu dynamickej mitochondriálnej remodelácie aj bez zmien v génovej expresii33. V tejto práci zdôrazňujeme užitočnosť mitochondriálnych zobrazovacích techník pri sekundárnych mitochondriálnych ochoreniach. Tieto ochorenia sú typicky charakterizované chronickým miernym metabolickým stresom, ktorý sa vyznačuje jemnou remodeláciou mitochondriálnych sietí, a nie akútnym mitochondriálnym poškodením. Mitochondriálna kompenzácia potrebná na udržanie mitózy pri chronickom strese má však hlboké funkčné dôsledky. V kontexte neurovedy môže lepšie pochopenie týchto kompenzačných mechanizmov poskytnúť dôležité informácie o pleiotropnej neuropatológii spojenej s mitochondriálnou dysfunkciou.
Naše údaje v konečnom dôsledku zdôrazňujú užitočnosť zobrazovacích techník na pochopenie funkčných dôsledkov komplexných interakcií medzi génovou expresiou, modifikáciami proteínov a aktivitou proteínov, ktoré riadia neuronálnu mitochondriálnu dynamiku. Na modelovanie mitochondriálnej dysfunkcie v neuronálnom bunkovom modeli sme použili PPA, aby sme získali prehľad o mitochondriálnej zložke ASD. Bunky SH-SY5Y ošetrené PPA vykazovali zmeny v mitochondriálnej morfológii: mitochondrie sa stali malými a okrúhlymi a krísty boli pri pozorovaní pomocou TEM zle definované. Analýza MEL ukazuje, že tieto zmeny sa vyskytujú súbežne so zvýšením počtu štiepnych a fúznych udalostí, aby sa udržala mitochondriálna sieť v reakcii na mierny metabolický stres. Okrem toho PPA významne narúša transkripčnú reguláciu mitochondriálneho metabolizmu a homeostázy. Identifikovali sme cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 a OPA1 ako kľúčové mitochondriálne regulátory narušené stresom PPA a môžu zohrávať úlohu pri sprostredkovaní zmien v mitochondriálnej morfológii a funkcii vyvolaných PPA. Na lepšiu charakterizáciu časových zmien v génovej expresii a aktivite proteínov, lokalizácii a posttranslačných modifikáciách vyvolaných PPA sú potrebné ďalšie štúdie. Naše údaje zdôrazňujú komplexnosť a vzájomnú závislosť regulačných mechanizmov sprostredkujúcich mitochondriálnu stresovú reakciu a demonštrujú užitočnosť TEM a iných zobrazovacích techník pre cielenejšie mechanistické štúdie.
Bunková línia SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) bola zakúpená od spoločnosti Sigma-Aldrich. Bunky SH-SY5Y boli pestované v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu/živnej zmesi F-12 (DMEM/F-12) a L-glutamínu (SC09411, ScienCell) v 25 cm2 bankách doplnených 20 % fetálnym bovinným sérom (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) a 1 % penicilín-streptomycínom (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) pri teplote 37 °C, 5 % CO2. Bunky boli subkultivované do 80 % konfluencie s použitím 0,05 % trypsín-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugované pri 300 g a nanesené na platne s hustotou približne 7 × 105 buniek/ml. Všetky experimenty boli vykonané na nediferencovaných bunkách SH-SY5Y medzi pasážami 19–22. PPA sa podáva ako NaP. Prášok NaP (CAS č. 137-40-6, chemický vzorec C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) sa rozpustí v teplej vode MilliQ na koncentráciu 1 M a skladuje sa pri teplote 4 °C. V deň ošetrenia sa tento roztok zriedi 1 M PPA na 3 mM a 5 mM PPA v bezsérovom médiu (DMEM/F-12 s L-glutamínom). Koncentrácie ošetrenia pre všetky experimenty boli bez PPA (0 mM, kontrola), 3 mM a 5 mM PPA. Experimenty sa uskutočnili v najmenej troch biologických replikátoch.
Bunky SH-SY5Y boli nasadené do baniek s objemom 25 cm5 rýchlosťou 5,5 × 105 buniek/ml a pestované 24 hodín. Pred 24 hodinami inkubácie bol do banky pridaný PPA roztok. Bunkové pelety boli zozbierané podľa bežných protokolov subkultúry cicavčích tkanív (opísaných vyššie). Bunkové pelety boli resuspendované v 100 µl 2,5% glutaraldehydu, 1× PBS a uskladnené pri teplote 4 °C až do spracovania. Bunky SH-SY5Y boli krátko centrifugované, aby sa bunky peletovali a odstránil sa 2,5% roztok glutaraldehydu, 1× PBS. Sediment bol resuspendovaný v 4% agarózovom géli pripravenom v destilovanej vode (pomer objemu agarózy k objemu sedimentu je 1:1). Kúsky agarózy boli umiestnené na mriežky na plochých platniach a potiahnuté 1-hexadecénom pred zmrazením pod vysokým tlakom. Vzorky boli zmrazené v 100% suchom acetóne pri teplote -90 °C počas 24 hodín. Teplota sa potom zvýšila na -80 °C a pridal sa roztok 1 % oxidu osmia a 0,1 % glutaraldehydu. Vzorky sa skladovali pri teplote -80 °C počas 24 hodín. Potom sa teplota postupne zvyšovala na izbovú teplotu počas niekoľkých dní: z –80 °C na –50 °C počas 24 hodín, na –30 °C počas 24 hodín, na –10 °C počas 24 hodín a nakoniec na izbovú teplotu.
Po kryogénnej príprave boli vzorky impregnované živicou a pomocou ultramikrotómu Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems) boli vyrobené ultratenké rezy (∼100 nm). Rezy boli farbené 2 % uranylacetátom a citrátom olovnatým. Vzorky boli pozorované pomocou transmisného elektrónového mikroskopu FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (predtým FEI), Eindhoven, Holandsko) pracujúceho pri 200 kV (vysielač Lab6) a CCD kamery Gatan (Gatan, Spojené kráľovstvo) vybavenej energetickým filtrom Tridiem.
V každej technickej replikácii bolo získaných najmenej 24 snímok jednotlivých buniek, čo predstavuje celkovo 266 snímok. Všetky snímky boli analyzované pomocou makra Region of Interest (ROI) a makra Mitochondria. Mitochondriálne makro je založené na publikovaných metódach17,31,32 a umožňuje poloautomatické dávkové spracovanie TEM snímok vo Fiji/ImageJ69. Stručne povedané: obraz je invertovaný a prevrátený pomocou odčítania pozadia kotúľajúcej sa gule (polomer 60 pixelov) a pásmového filtra FFT (s použitím hornej a dolnej hranice 60 a 8 pixelov) a potlačenia vertikálnych čiar s toleranciou orientácie 5 %. Spracovaný obraz je automaticky prahovaný pomocou algoritmu maximálnej entropie a je vygenerovaná binárna maska. Boli extrahované oblasti obrazu spojené s manuálne vybranými ROI v surových TEM snímkach, charakterizujúce mitochondrie a vylučujúce plazmatickú membránu a ďalšie oblasti s vysokým kontrastom. Pre každú extrahovanú oblasť záujmu (ROI) boli analyzované binárne častice väčšie ako 600 pixelov a pomocou vstavaných meracích funkcií Fiji/ImageJ boli merané plocha, obvod, hlavné a vedľajšie osi častíc, Feretov priemer, zaoblenosť a kruhovitosť. Podľa Merrilla, Flippa a Stracka (2017) boli z týchto údajov vypočítané plocha 2, pomer strán častíc (pomer hlavnej a vedľajšej osi) a tvarový faktor (FF), kde FF = obvod 2/4pí x plocha. Definíciu parametrického vzorca možno nájsť v práci Merrilla, Flippa a Stracka (2017). Uvedené makrá sú dostupné na GitHub (pozri Vyhlásenie o dostupnosti údajov). V priemere bolo na jedno ošetrenie PPA analyzovaných približne 5 600 častíc, čo predstavuje celkovo približne 17 000 častíc (údaje nie sú zobrazené).
Bunky SH-SH5Y boli umiestnené do 8-komorových kultivačných misiek (ThermoFisher, #155411), aby sa umožnila adhézia cez noc, a potom boli inkubované s farbením TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) a Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Snímky boli získané pomocou laserov s vlnovou dĺžkou 405 nm a 561 nm počas 10 minút a nespracované snímky boli získané ako z-stacky obsahujúce 10 obrazových mikrofotografií s a-krokom 0,2 μm medzi obrazovými snímkami v 12 po sebe nasledujúcich časových bodoch. Snímky boli zhromaždené pomocou platformy Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 s vysokým rozlíšením (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko) s použitím objektívu LCI Plan Apochromate 100x/1,4 Oil DIC M27. Obrázky boli analyzované v ImageJ pomocou predtým opísaného postupu a pluginu ImageJ na meranie fúznych a štiepnych udalostí, priemerného počtu mitochondriálnych štruktúr a priemerného objemu mitochondrií na bunku33. Makrá MEL sú dostupné na GitHub (pozri Vyhlásenie o dostupnosti údajov).
Bunky SH-SY5Y boli pestované na šesťjamkových platniach s hustotou 0,3 × 106 buniek/ml počas 24 hodín pred ošetrením. RNA bola extrahovaná pomocou protokolu Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) s miernymi úpravami: pred odstránením sa do každej jamky pridalo 300 μl lyzačného pufra RNA a každá vzorka sa lyzovala ako posledný krok s 30 μl vody bez DNázy/RNázy. Všetky vzorky boli skontrolované na kvantitu a kvalitu pomocou UV-Vis spektrofotometra NanoDrop ND-1000. Celkový proteín z bunkových lyzátov bol získaný pomocou 200 μl lyzačného pufra RIPA a koncentrácia proteínu bola kvantifikovaná pomocou Bradfordovho proteínového testu70.
Syntéza cDNA sa uskutočnila pomocou súpravy Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) podľa pokynov výrobcu s niekoľkými úpravami. cDNA sa syntetizovala v 20 μl reakciách s použitím 0,7 až 1 μg celkovej RNA. Priméry boli vybrané z predtým publikovaných prác 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabuľka S1) a sprievodné sondy boli navrhnuté pomocou nástroja PrimerQuest od spoločnosti Integrated DNA Technologies. Všetky sledované gény boli normalizované na jadrový gén B2M. Génová expresia STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC a OPA1 sa merala pomocou RT-qPCR. Master mix obsahoval polymerázu LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM priame a reverzné priméry, cDNA a vodu v PCR kvalite, čím sa získal konečný objem 10 μl pre každú reakciu. Expresia génov delenia a štiepenia (DRP1, MFN1/2) sa merala pomocou multiplexných testov TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) sa použil podľa pokynov výrobcu s menšími úpravami. Multiplexný RT-qPCR master mix obsahuje 1X LUNA Taq polymerázu, 10 μM priame a reverzné priméry, 10 μM sondu, cDNA a vodu PCR kvality, čoho výsledkom je konečný objem 20 μl pre každú reakciu. RT-qPCR sa uskutočnila pomocou Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG – sériové číslo: R0618110). Podmienky cyklovania sú uvedené v tabuľke S1. Všetky vzorky cDNA sa amplifikovali v troch opakovaniach a štandardná krivka sa vygenerovala pomocou série desaťnásobných riedení. Z analýzy boli odstránené odľahlé hodnoty s prahovou štandardnou odchýlkou ​​cyklu (Ct) > 0,5, aby sa zabezpečila reprodukovateľnosť údajov30,72. Relatívna génová expresia bola vypočítaná pomocou metódy 2-ΔΔCt79.
Vzorky proteínov (60 μg) boli zmiešané s Laemmliho nanášacím pufrom v pomere 2:1 a analyzované na 12 % bezfarebnom proteínovom géli (Bio-Rad #1610184). Proteíny boli prenesené na PVDF (polyvinylidénfluoridovú) membránu (#170-84156, Bio-Rad) pomocou systému Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Membrána bola blokovaná a inkubovaná s príslušnými primárnymi protilátkami (OPA1, MFN1, MFN2 a DRP1) (riedené 1:1000) počas 48 hodín, po čom nasledovala inkubácia so sekundárnymi protilátkami (1:10 000) počas 1 hodiny. Membrány boli potom zobrazené pomocou Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) a zaznamenané pomocou systému Bio-Rad ChemiDoc MP. Na Western blot analýzu bol použitý ImageLab verzie 6.1. Pôvodný gél a blot sú znázornené na obrázku S1. Informácie o protilátkach sú uvedené v tabuľke S2.
Súbory údajov sú prezentované ako priemer a štandardná chyba priemeru (SEM) najmenej troch nezávislých vzoriek. Súbory údajov boli testované na normalitu pomocou Shapiro-Wilksovho testu (pokiaľ nie je uvedené inak) pred predpokladom Gaussovho rozdelenia a rovnakých štandardných odchýlok a pokračovaním v analýzach. Okrem analýzy súboru údajov boli na určenie významnosti (p < 0,05) použité aj Fisherov MEL LSD test (p < 0,05), jednofaktorová ANOVA (priemer liečby vs. kontroly) a Dunnettov test viacnásobného porovnania. Signifikantné hodnoty p sú v grafe zobrazené ako *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Všetky štatistické analýzy a grafy boli vykonané a vygenerované pomocou GraphPad Prism 9.4.0.
Makrá Fiji/ImageJ pre analýzu snímok TEM sú verejne dostupné na GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Mitochondrial Event Locator (MEL) je verejne dostupné na GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM a Vijaya A. Mitochondrie: hlavné regulátory metabolizmu, homeostázy, stresu, starnutia a epigenetiky. Indonézština. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Mnohostranná mitochondriálna dysfunkcia pri schizofrénii, komplex I ako možný patologický cieľ. Schizofrénia. zdroj. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. a Beal, MF Mitochondriálna dysfunkcia pri Parkinsonovej chorobe. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG a Mehta V. Stresované mitochondrie: ciele invázie pri Alzheimerovej chorobe. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF a Ferreira GK Mitochondrie a mozog: bioenergetika a ďalšie. Neurotoxíny. zdroj. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. a kol. Pleiotropné mitochondrie: vplyv mitochondrií na vývoj neurónov a ochorenia. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. a Morais, VA Mitochondriálna biogenéza v neurónoch: ako a kde. Medzinárodnosť. J. Mohr. Veda. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. a Zhao, J. Regulácia mitochondriálnej dynamiky cicavcov: príležitosti a výzvy. front. endokrinný. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. a Slack, RS Mitochondriálna dynamika v regulácii neurogenézy: od vyvíjajúceho sa mozgu po dospelý mozog. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).