Súčasnosť *Súčasná adresa: Kolín nad Rýnom 50931, Nemecko, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-Related Diseases (CECAD).
Neurodegenerácia mitochondriálnych ochorení sa považuje za nezvratnú, pretože metabolická plasticita neurónov je obmedzená, ale vplyv mitochondriálnej dysfunkcie na bunkovú autonómiu neuronálneho metabolizmu v tele nie je dostatočne objasnený. V tejto práci predstavujeme bunkovo ​​špecifický proteóm Purkyňových neurónov s progresívnym deficitom OXPHOS spôsobeným narušenou dynamikou mitochondriálnej fúzie. Zistili sme, že mitochondriálna dysfunkcia spustila hlbokú zmenu v oblasti proteomiky, ktorá nakoniec viedla k sekvenčnej aktivácii presných metabolických programov pred bunkovou smrťou. Neočakávane sme zistili zjavnú indukciu pyruvátkarboxylázy (PCx) a ďalších enzýmov proti starnutiu, ktoré dopĺňajú medziprodukty cyklu TCA. Inhibícia PCx zhoršila oxidačný stres a neurodegeneráciu, čo naznačuje, že ateroskleróza má ochranný účinok na neuróny, ktorým chýba OXPHOS. Obnova mitochondriálnej fúzie v terminálne degenerovaných neurónoch úplne zvráti tieto metabolické charakteristiky, čím sa zabráni bunkovej smrti. Naše zistenia identifikujú doteraz neznáme dráhy, ktoré prepožičiavajú mitochondriálnej dysfunkcii odolnosť, a ukazujú, že neurodegeneráciu je možné zvrátiť aj v neskorých štádiách ochorenia.
Ústrednú úlohu mitochondrií pri udržiavaní neuronálneho energetického metabolizmu zdôrazňujú rozsiahle neurologické symptómy spojené s ľudskými mitochondriálnymi ochoreniami. Väčšinu týchto ochorení spôsobujú génové mutácie, ktoré regulujú expresiu mitochondriálnych génov (1, 2) alebo deštrukcia génov súvisiaca s dynamikou mitochondrií, ktoré nepriamo ovplyvňujú stabilitu mitochondriálnej DNA (mtDNA) (3, 4). Práca na zvieracích modeloch ukázala, že v reakcii na mitochondriálnu dysfunkciu v okolitých tkanivách sa môžu aktivovať konzervatívne metabolické dráhy (5-7), čo poskytuje dôležité informácie pre hlbšie pochopenie patogenézy týchto komplexných ochorení. Naproti tomu naše chápanie metabolických zmien špecifických typov buniek spôsobených všeobecným zlyhaním produkcie adenozíntrifosfátu (ATP) v mozgu je zásadné (8), čo zdôrazňuje potrebu identifikovať terapeutické ciele, ktoré možno použiť na prevenciu alebo predchádzanie ochoreniam. Zabráňte neurodegenerácii (9). Nedostatok informácií spočíva v tom, že nervové bunky sa všeobecne považujú za bunky s veľmi obmedzenou metabolickou flexibilitou v porovnaní s typmi buniek okolitých tkanív (10). Vzhľadom na to, že tieto bunky zohrávajú ústrednú úlohu pri koordinácii dodávky metabolitov do neurónov s cieľom podporiť synaptický prenos a reagovať na poranenia a choroby, schopnosť prispôsobiť bunkový metabolizmus náročným podmienkam mozgového tkaniva je takmer obmedzená na gliové bunky (11-14). Okrem toho inherentná bunková heterogenita mozgového tkaniva do značnej miery bráni štúdiu metabolických zmien, ku ktorým dochádza v špecifických neuronálnych podskupinách. V dôsledku toho sa o presných bunkových a metabolických dôsledkoch mitochondriálnej dysfunkcie v neurónoch vie len málo.
Aby sme pochopili metabolické dôsledky mitochondriálnej dysfunkcie, izolovali sme Purkyňove neuróny (PN) v rôznych štádiách neurodegenerácie spôsobenej deštrukciou fúzie vonkajšej membrány mitochondrií (Mfn2). Hoci mutácie Mfn2 u ľudí sú spojené s formou dedičnej motorickej senzorickej neuropatie známej ako Charcot-Marie-Tooth typ 2A (15), podmienená deštrukcia Mfn2 u myší je dobre známou metódou indukcie oxidačnej fosforylácie (OXPHOS) dysfunkcie. Rôzne neuronálne podtypy (16-19) a výsledný neurodegeneratívny fenotyp sú sprevádzané progresívnymi neurologickými príznakmi, ako sú poruchy pohybu (18, 19) alebo cerebelárna ataxia (16). Použitím kombinácie kvantitatívnej proteomiky (LFQ) bez značenia, metabolomiky, zobrazovacích a virologických metód sme ukázali, že progresívna neurodegenerácia silne indukuje pyruvátkarboxylázu (PCx) a ďalšie faktory zapojené do arteriosklerózy PN in vivo. Expresia enzýmov. Aby sme overili relevantnosť tohto zistenia, špecificky sme znížili expresiu PCx v neuroneurópskych bunkách s deficitom Mfn2 a zistili sme, že táto operácia zhoršila oxidačný stres a urýchlila neurodegeneráciu, čím dokázali, že azoospermia spôsobuje bunkovú smrť. Metabolická adaptabilita. Silná expresia MFN2 môže úplne zachrániť terminálnu degeneratívnu neuroneurópsku bunku s ťažkým deficitom OXPHOS, masívnou spotrebou mitochondriálnej DNA a zjavne narušenou mitochondriálnou sieťou, čo ďalej zdôrazňuje, že táto forma neurodegenerácie sa môže zotaviť aj v pokročilom štádiu ochorenia pred bunkovou smrťou.
Na vizualizáciu mitochondrií v neuronálnych bunkách s knockoutom Mfn2 sme použili myší kmeň, ktorý umožňuje mitochondriám závislým od Cre zacieliť expresiu žltého fluorescenčného proteínu (YFP) (mtYFP) (20) Cre a in vivo sme skontrolovali mitochondriálnu morfológiu. Zistili sme, že deštrukcia génu Mfn2 v neuronálnych bunkách vedie k postupnému deleniu mitochondriálnej siete (obrázok S1A) a najskoršia zmena bola zistená vo veku 3 týždňov. Naproti tomu podstatná degenerácia vrstvy buniek neuronálnych buniek, o čom svedčí strata imunofarbenia kalbindínom, sa začala až vo veku 12 týždňov (obrázok 1, A a B). Časový nesúlad medzi najskoršími zmenami v mitochondriálnej morfológii a viditeľným nástupom neuronálnej smrti nás podnietil k skúmaniu metabolických zmien vyvolaných mitochondriálnou dysfunkciou pred bunkovou smrťou. Vyvinuli sme stratégiu založenú na fluorescenčne aktivovanom triedení buniek (FACS) na izoláciu PN exprimujúcich YFP (YFP+) (obrázok 1C) a u kontrolných myší (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP: :L7-cre), ďalej označovanú ako CTRL (obrázok S1B). Optimalizácia stratégie hradlovania založená na relatívnej intenzite signálu YFP nám umožňuje purifikovať telo YFP+ (YFPhigh) PN od ne-PN (YFPneg) (obrázok S1B) alebo od predpokladaných fluorescenčných axónových/dendritických fragmentov (YFPlow; obrázok S1D, vľavo), čo bolo potvrdené konfokálnym mikroskopom (obrázok S1D, vpravo). Aby sme overili identitu klasifikovanej populácie, vykonali sme LFQ proteomiku a potom analýzu hlavných komponentov a zistili sme, že existuje jasné oddelenie medzi bunkami YFPhigh a YFPneg (obrázok S1C). Bunky YFPhigh vykazovali čisté obohatenie známych PN markerov (t. j. Calb1, Pcp2, Grid2 a Itpr3) (21, 22), ale žiadne obohatenie proteínov bežne exprimovaných v neurónoch alebo iných typoch buniek (obrázok 1D). Porovnanie medzi vzorkami v klasifikovaných bunkách YFPhigh zozbieraných v nezávislých experimentoch ukázalo korelačný koeficient > 0,9, čo dokazuje dobrú reprodukovateľnosť medzi biologickými replikátmi (obrázok S1E). Stručne povedané, tieto údaje potvrdili náš plán akútnej a špecifickej izolácie uskutočniteľných PN. Keďže použitý systém L7-cre indukuje mozaikovú rekombináciu v prvom týždni po pôrode (23), začali sme s vyraďovaním myší z CTRL a podmieneným zberom neurónov (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). Po dokončení rekombinácie sa to nazýva Mfn2cKO vo veku 4 týždňov. Ako koncový bod sme zvolili vek 8 týždňov, keď bola PN vrstva neporušená napriek zjavnej mitochondriálnej fragmentácii (obrázok 1B a obrázok S1A). Celkovo sme kvantifikovali 3013 proteínov, z ktorých približne 22 % bolo založených na anotáciách MitoCarta 2.0 na základe mitochondriálneho proteómu ako mitochondrie (obrázok 1E) (obrázok 1E) (24). Analýza diferenciálnej génovej expresie vykonaná v 8. týždni ukázala, že iba 10,5 % všetkých proteínov malo významné zmeny (obrázok 1F a obrázok S1F), z ktorých 195 proteínov bolo down-regulovaných a 120 proteínov bolo up-regulovaných (obrázok 1F). Stojí za zmienku, že „analýza inovatívnych dráh“ tohto súboru údajov ukazuje, že diferencovane exprimované gény patria prevažne do obmedzeného súboru špecifických metabolických dráh (obrázok 1G). Je zaujímavé, že hoci zníženie regulácie dráh súvisiacich s OXPHOS a vápnikovou signalizáciou potvrdzuje indukciu mitochondriálnej dysfunkcie v PN s deficitom fúzie, iné kategórie, ktoré zahŕňajú hlavne metabolizmus aminokyselín, sú významne zvýšené, čo je v súlade s metabolizmom, ktorý prebieha v mitochondriálnych PN. Prepojenie je konzistentné.
(A) Reprezentatívne konfokálne fotografie cerebelárnych rezov myší CTRL a Mfn2cKO vykazujúcich progresívnu stratu PN (kalbindín, sivá); jadrá boli kontrastne farbené s DAPI. (B) Kvantifikácia (A) (jednosmerná analýza rozptylu, ***P<0,001; n = 4 až 6 kruhov od troch myší). (C) Experimentálny pracovný postup. (D) Rozloženie markerov špecifických pre Purkyňove (hore) a iné typy buniek na tepelnej mape (v strede). (E) Vennov diagram znázorňujúci počet mitochondriálnych proteínov identifikovaných v klasifikovanej PN. (F) Sopkový graf diferencovane exprimovaných proteínov v neurónoch Mfn2cKO po 8 týždňoch (hraničná hodnota významnosti 1,3). (G) Analýza dráhy kreativity ukazuje päť najdôležitejších dráh zvýšenej (červená) a zníženej (modrá) regulácie v Mfn2cKO PN klasifikovanej ako 8 týždňov. Zobrazená je priemerná úroveň expresie každého detegovaného proteínu. Tepelná mapa v odtieňoch sivej: upravená hodnota P. ns, nie je dôležité.
Proteomické údaje ukázali, že expresia proteínov komplexov I, III a IV postupne klesala. Komplexy I, III a IV obsahovali esenciálne podjednotky kódované mtDNA, zatiaľ čo komplex II, ktorý bol kódovaný iba jadrom, zostal v podstate nezmenený (obrázok 2A a obrázok S2A). V súlade s výsledkami proteomiky imunohistochemické vyšetrenia rezov mozočkového tkaniva ukázali, že hladina podjednotky MTCO1 (podjednotka 1 mitochondriálneho cytochrómu C oxidázy) komplexu IV v PN postupne klesala (obrázok 2B). Podjednotka Mtatp8 kódovaná mtDNA bola významne znížená (obrázok S2A), zatiaľ čo ustálená hladina podjednotky ATP syntázy kódovanej jadrom zostala nezmenená, čo je v súlade so známym stabilným komplexom podzostavy ATP syntázy F1, keď je expresia mtDNA stabilná. Tvorba je konzistentná. Prerušenie (7). Vyhodnotenie hladiny mtDNA v triedených Mfn2cKO PN pomocou polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase (qPCR) potvrdilo postupný pokles počtu kópií mtDNA. V porovnaní s kontrolnou skupinou sa vo veku 8 týždňov zachovalo iba približne 20 % hladiny mtDNA (obrázok 2C). V súlade s týmito výsledkami sa na detekciu DNA použilo konfokálne mikroskopické farbenie Mfn2cKO PN, ktoré ukázalo časovo závislú spotrebu mitochondriálnych nukleotidov (obrázok 2D). Zistili sme, že iba niektorí kandidáti zapojení do degradácie mitochondriálnych proteínov a stresovej reakcie boli up-regulovaní, vrátane Lonp1, Afg3l2 a Clpx a faktorov zostavovania komplexu OXPHOS. Neboli zistené žiadne významné zmeny v hladinách proteínov zapojených do apoptózy (obrázok S2B). Podobne sme zistili, že mitochondriálne a endoplazmatické retikulové kanály zapojené do transportu vápnika vykazujú len malé zmeny (obrázok S2C). Okrem toho, hodnotenie proteínov súvisiacich s autofágiou nezistilo žiadne významné zmeny, čo je v súlade s viditeľnou indukciou autofagozómov pozorovanou in vivo imunohistochemicky a elektrónovou mikroskopiou (obrázok S3). Progresívna dysfunkcia OXPHOS u PN je však sprevádzaná zjavnými ultraštrukturálnymi mitochondriálnymi zmenami. V bunkových telách a dendritických stromoch Mfn2cKO PN vo veku 5 a 8 týždňov možno pozorovať mitochondriálne zhluky a štruktúra vnútornej membrány prešla výraznými zmenami (obrázok S4, A a B). V súlade s týmito ultraštrukturálnymi zmenami a významným poklesom mtDNA analýza akútnych mozgových rezov s tetrametylrodamín metylesterom (TMRM) ukázala, že mitochondriálny membránový potenciál v Mfn2cKO PN bol významne znížený (obrázok S4C).
(A) Analýza časového priebehu hladiny expresie komplexu OXPHOS. Zoberte do úvahy iba proteíny s P < 0,05 v 8. týždni (dvojcestná ANOVA). Prerušovaná čiara: Žiadna úprava v porovnaní s CTRL. (B) Vľavo: Príklad rezu mozočku označeného protilátkou anti-MTCO1 (mierka, 20 μm). Plocha obsadená telieskami Purkyňových buniek je pokrytá žltou farbou. Vpravo: Kvantifikácia hladín MTCO1 (jednocestná analýza rozptylu; n = 7 až 20 buniek analyzovaných od troch myší). (C) qPCR analýza počtu kópií mtDNA v zoradenej PN (jednocestná analýza rozptylu; n = 3 až 7 myší). (D) Vľavo: Príklad rezu mozočku označeného protilátkou anti-DNA (mierka, 20 μm). Plocha obsadená telieskami Purkyňových buniek je pokrytá žltou farbou. Vpravo: Kvantifikácia lézií mtDNA (jednocestná analýza rozptylu; n = 5 až 9 buniek od troch myší). (E) Príklad akútneho cerebelárneho rezu zobrazujúci mitoYFP + Purkyňove bunky (šípka) v zázname celobunkovej patch clamp metódou. (F) Kvantifikácia IV krivky. (G) Reprezentatívne záznamy injekcie depolarizačného prúdu v Purkyňových bunkách CTRL a Mfn2cKO. Horná krivka: Prvý impulz, ktorý spustil AP. Spodná krivka: Maximálna frekvencia AP. (H) Kvantifikácia postsynaptických spontánnych vstupov (sPSP). Reprezentatívna záznamová krivka a jej pomer priblíženia sú zobrazené v (I). Jednosmerná analýza rozptylu analyzovala n = 5 až 20 buniek od troch myší. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Reprezentatívne stopy spontánneho AP zaznamenaného pomocou perforovaného patch clamp režimu. Horná krivka: Maximálna frekvencia AP. Spodná krivka: priblíženie jedného AP. (K) Kvantifikujte priemernú a maximálnu frekvenciu AP podľa (J). Mann-Whitneyho test; n = 5 buniek bolo analyzovaných od štyroch myší. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM; nie je dôležité.
U 8-týždňových Mfn2cKO PN bolo zistené zjavné poškodenie OXPHOS, čo naznačuje, že fyziologická funkcia neurónov je výrazne abnormálna. Preto sme analyzovali pasívne elektrické charakteristiky neurónov s deficitom OXPHOS v 4. až 5. týždni a 7. až 8. týždni vykonaním záznamov celobunkovej patch clamp v akútnych cerebelárnych rezoch (obrázok 2E). Neočakávane bol priemerný pokojový membránový potenciál a vstupný odpor neurónov Mfn2cKO podobný ako v kontrole, hoci medzi bunkami boli jemné rozdiely (tabuľka 1). Podobne vo veku 4 až 5 týždňov neboli zistené žiadne významné zmeny vo vzťahu prúd-napätie (IV krivka) (obrázok 2F). Žiadne neuróny Mfn2cKO vo veku 7 až 8 týždňov však neprežili IV režim (krok hyperpolarizácie), čo naznačuje, že v tomto neskorom štádiu existuje jasná citlivosť na hyperpolarizačný potenciál. Naproti tomu v neurónoch Mfn2cKO sú depolarizačné prúdy, ktoré spôsobujú opakované výboje akčného potenciálu (AP), dobre tolerované, čo naznačuje, že ich celkové vzorce výbojov sa významne nelíšia od vzorcov 8-týždňových kontrolných neurónov (Tabuľka 1 a Obrázok 2G). Podobne bola frekvencia a amplitúda spontánnych postsynaptických prúdov (sPSC) porovnateľná s kontrolnou skupinou a frekvencia udalostí sa zvýšila zo 4 týždňov na 5 týždňov na 7 týždňov na 8 týždňov s podobným nárastom (Obrázok 2, H a I). ​​Obdobie synaptického dozrievania v PN (25). Podobné výsledky sa dosiahli po perforovaných PN náplastiach. Táto konfigurácia zabraňuje možnej kompenzácii bunkových defektov ATP, ako by sa to mohlo stať pri zázname celobunkových náplastí. Najmä pokojový membránový potenciál a frekvencia spontánneho spúšťania neurónov Mfn2cKO neboli ovplyvnené (Obrázok 2, J a K). Stručne povedané, tieto výsledky naznačujú, že PN so zjavnou dysfunkciou OXPHOS sa dokážu dobre vyrovnať s vysokofrekvenčnými výbojovými vzormi, čo naznačuje, že existuje kompenzačný mechanizmus, ktorý im umožňuje udržiavať takmer normálne elektrofyziologické reakcie.
Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM (jednofaktorová analýza rozptylu, Holm-Sidakov test viacnásobného porovnania; *P<0,05). Číslo jednotky je uvedené v zátvorkách.
Snažili sme sa preskúmať, či niektorá kategória v súbore proteomických údajov (obrázok 1G) obsahuje dráhy, ktoré môžu pôsobiť proti závažnému nedostatku OXPHOS, čím vysvetľujeme, prečo si postihnutá peritoneálna nervová sústava (PN) môže udržiavať takmer normálnu elektrofyziológiu (obrázok 2, E až K). Proteomická analýza ukázala, že enzýmy zapojené do katabolizmu aminokyselín s rozvetveným reťazcom (BCAA) boli významne zvýšené (obrázok 3A a obrázok S5A) a konečný produkt acetyl-CoA (CoA) alebo sukcinyl-CoA môže dopĺňať trikarboxyláty v cykle arteriosklerózy (TCA). Zistili sme, že obsah BCAA transaminázy 1 (BCAT1) aj BCAT2 sa zvýšil. Katalyzujú prvý krok katabolizmu BCAA tvorbou glutamátu z α-ketoglutarátu (26). Všetky podjednotky, ktoré tvoria komplex ketokyselinovej dehydrogenázy s rozvetveným reťazcom (BCKD), sú zvýšené (komplex katalyzuje následnú a ireverzibilnú dekarboxyláciu výsledného uhlíkového skeletu BCAA) (obrázok 3A a obrázok S5A). V triedených PN sa však nezistili žiadne zjavné zmeny v samotných BCAA, čo môže byť spôsobené zvýšeným bunkovým príjmom týchto esenciálnych aminokyselín alebo použitím iných zdrojov (glukózy alebo kyseliny mliečnej) na doplnenie cyklu TCA (obrázok S5B). PN bez OXPHOS tiež vykazovali zvýšenú aktivitu rozkladu glutamínu a transaminácie vo veku 8 týždňov, čo sa môže prejaviť zvýšenou reguláciou mitochondriálnych enzýmov glutaminázy (GLS) a glutamínpyruváttransaminázy 2 (GPT2) (obrázok 3, A a C). Stojí za zmienku, že zvýšená regulácia GLS je obmedzená na zostrihanú izoformu glutaminázy C (GLS-GAC) (zmena Mfn2cKO/CTRL je približne 4,5-násobná, P = 0,05) a jej špecifická zvýšená regulácia v rakovinových tkanivách môže podporovať mitochondriálnu bioenergiu. (27)
(A) Tepelná mapa zobrazuje násobnú zmenu hladiny proteínu pre špecifikovanú cestu po 8 týždňoch. (B) Príklad rezu mozočka označeného protilátkou anti-PCx (mierka, 20 μm). Žltá šípka ukazuje na telo Purkyňových buniek. (C) Analýza časového priebehu expresie proteínu identifikovaného ako dôležitý kandidát pre aterosklerózu (viacnásobný t-test, *FDR <5 %; n = 3 – 5 myší). (D) Hore: Schematický diagram znázorňujúci rôzne spôsoby vstupu značeného uhlíka obsiahnutého v stopovači [1-13C]pyruvát (t. j. prostredníctvom PDH alebo transarteriálnej cesty). Dole: Violinový graf zobrazuje percento jednoducho značeného uhlíka (M1) premeneného na kyselinu asparágovú, kyselinu citrónovú a kyselinu jablčnú po označení akútnych rezov mozočka [1-13C]pyruvátom (párový t-test; ** P < 0,01). (E) Komplexná analýza časového priebehu uvedenej cesty. Zohľadňujte iba proteíny s P < 0,05 po 8 týždňoch. Prerušovaná čiara: žiadna adjustovaná hodnota (dvojcestná analýza rozptylu; * P < 0,05; *** P < 0,001). Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM.
V našej analýze sa katabolizmus BCAA stal jednou z kľúčových dráh zvýšenej regulácie. Táto skutočnosť silne naznačuje, že objem ventilácie vstupujúci do cyklu TCA sa môže zmeniť u pacientov s deficitom OXPHOS v periférnych bunkách (PN). To môže predstavovať hlavnú formu neuronálneho metabolického prepojenia, ktoré môže mať priamy vplyv na neuronálnu fyziológiu a prežitie počas udržiavania závažnej dysfunkcie OXPHOS. V súlade s touto hypotézou sme zistili, že hlavný antiaterosklerotický enzým PCx je zvýšene regulovaný (Mfn2cKO/CTRL sa mení približne 1,5-krát; Obrázok 3A), čo katalyzuje premenu pyruvátu na oxaloacetát (28), o ktorom sa predpokladá, že sa nachádza v mozgovom tkanive. Expresia v je obmedzená na astrocyty (29, 30). V súlade s výsledkami proteomiky konfokálna mikroskopia ukázala, že expresia PCx bola špecificky a významne zvýšená u pacientov s deficitom OXPHOS, zatiaľ čo reaktivita PCx bola obmedzená hlavne na susedné Bergmannove gliové bunky kontroly (Obrázok 3B). Aby sme funkčne otestovali pozorovanú zvýšenú reguláciu PCx, ošetrili sme akútne cerebelárne rezy stopovačom [1-13C]pyruvát. Keď bol pyruvát oxidovaný pyruvátdehydrogenázou (PDH), jeho izotopové označenie zmizlo, ale je začlenené do medziproduktov cyklu TCA, keď je pyruvát metabolizovaný vaskulárnymi reakciami (obrázok 3D). Na podporu našich proteomických údajov sme pozorovali veľké množstvo markerov z tohto stopovača v rezoch Mfn2cKO s kyselinou asparágovou, zatiaľ čo kyselina citrónová a kyselina jablčná mali tiež mierny trend, aj keď nie významný (obrázok 3D).
V dopamínových neurónoch myší MitoPark s mitochondriálnou dysfunkciou spôsobenou dopamínovými neurónmi špecificky ničiacimi gén mitochondriálneho transkripčného faktora A (Tfam) (obrázok S6B) bola expresia PCx tiež významne zvýšená (31), čo naznačuje, že arterioskleróza vyvolaná kyselinou acetónovou je regulovaná počas dysfunkcie neuronálneho OXPHOS v tele. Za zmienku stojí, že sa zistilo, že jedinečné enzýmy (32-34), ktoré môžu byť exprimované v neurónoch, ktoré môžu byť spojené s arteriosklerózou, sú významne zvýšené v neuronálnych neurónoch bez OXPHOS, ako je propionyl-CoA karboxyláza (PCC-A), malonyl-CoA premieňa propionyl-CoA na sukcinyl-CoA a mitochondriálny jablčný enzým 3 (ME3), ktorého hlavnou úlohou je získať pyruvát z malátu (obrázok 3, A a C) (33, 35). Okrem toho sme zistili významný nárast enzýmu Pdk3, ktorý fosforyluje a tým inaktivuje PDH (36), zatiaľ čo v enzýme Pdp1, ktorý aktivuje PDH, ani v samotnom enzýmovom komplexe PDH (obrázok 3A), neboli zistené žiadne zmeny. V súlade s tým bola v PN s Mern2cKO zvýšená fosforylácia podjednotky α1 (PDHE1α) zložky pyruvátdehydrogenázy E1 komplexu PDH v Ser293 (známej inhibícii enzýmovej aktivity PDH) (obrázok S6C). Pyruvát nemá žiadny vaskulárny prístup.
Nakoniec sme zistili, že superdráha biosyntézy serínu a glycínu, súvisiaci mitochondriálny folátový (1C) cyklus a biosyntéza prolínu (obrázok 1G a obrázok S5C) sú podľa správ počas procesu aktivácie významne upregulované. Okolité tkanivá sú aktivované s mitochondriálnou dysfunkciou (5-7). Konfokálna analýza podporujúca tieto proteomické údaje ukázala, že pri PN s chýbajúcim OXPHOS boli mozočkové rezy 8-týždňových myší vystavené serínhydroxymetyltransferáze 2 (SHMT2), kľúčovému enzýmu mitochondriálneho folátového cyklu. Významná imunitná odpoveď (obrázok S5D). V 13 akútnych mozočkových rezoch inkubovaných s CU-glukózou experimenty s metabolickým sledovaním ďalej potvrdili upreguláciu biosyntézy serínu a prolínu, čo naznačuje, že tok izoforiem uhlíka na serín a prolín sa zvýšil (obrázok S5E). Keďže reakcie podporované GLS a GPT2 sú zodpovedné za syntézu glutamátu z glutamínu a transamináciu medzi glutamátom a α-ketoglutarátom, ich zvýšená regulácia naznačuje, že neuróny s deficitom OXPHOS majú zvýšený dopyt po glutamáte. To môže byť zamerané na udržanie zvýšenej biosyntézy prolínu (obrázok S5C). Na rozdiel od týchto zmien proteomická analýza cerebelárnych astrocytov z PN-špecifických myší Mfn2cKO ukázala, že tieto dráhy (vrátane všetkých antiperoxidáz) sa významne nezmenili v expresii, čo dokazuje, že toto metabolické presmerovanie je selektívne voči degradovanej PN (obr. S6, D až G).
Stručne povedané, tieto analýzy odhalili významne odlišné vzorce časovej aktivácie špecifických metabolických dráh v neuronálnych ...
8-týždňové PN s deficitom OXPHOS si môžu udržať vysokofrekvenčnú excitačnú aktivitu a podstúpiť významné metabolické opätovné prepojenie, aby kompenzovali mitochondriálnu dysfunkciu. Tento objav vyvoláva zaujímavú možnosť, že aj v tomto momente môžu tieto bunky dostať terapeutický zásah na oddialenie alebo prevenciu neurodegenerácie. Túto možnosť sme vyriešili dvoma nezávislými zásahmi. V prvej metóde sme navrhli vektor Cre-dependentného adeno-asociovaného vírusu (AAV), aby sa MFN2 mohol selektívne exprimovať v OXPHOS-deficientných PN in vivo (obrázok S7A). AAV kódujúci MFN2 a fluorescenčný reportérový gén mCherry (Mfn2-AAV) boli overené v primárnych neurónových kultúrach in vitro, čo spôsobilo expresiu MFN2 Cre-dependentným spôsobom a zachránilo mitochondriálnu morfológiu, čím sa zabránilo neuromutácii v neurónoch Mfn2cKO (obrázok S7, B, D a E). Následne sme vykonali in vivo experimenty na stereotaktické dodanie 8-týždňového Mfn2-AAV do mozočkovej kôry myší s Mfn2cKO a kontrolných myší a analyzovali sme 12-týždňové myši (obrázok 4A). Liečené myši s Mfn2cKO uhynuli (obrázok 1, A a B) (16). Vírusová transdukcia in vivo viedla k selektívnej expresii PN v niektorých mozgových kruhoch (obrázok S7, G a H). Injekcia kontrolného AAV exprimujúceho iba mCherry (Ctrl-AAV) nemala významný vplyv na stupeň neurodegenerácie u zvierat s Mfn2cKO. Naproti tomu analýza Mfn2cKO transdukovaných s Mfn2-AAV ukázala významný ochranný účinok vrstvy PN buniek (obrázok 4, B a C). Najmä hustota neurónov sa zdá byť takmer nerozoznateľná od kontrolných zvierat (obrázok 4, B a C a obrázok S7, H a I). Expresia MFN1, ale nie MFN2, je rovnako účinná pri zachraňovaní neuronálnej smrti (obrázok 4C a obrázok S7, C a F), čo naznačuje, že expresia ektopického MFN1 môže účinne doplniť nedostatok MFN2. Ďalšia analýza na úrovni jednej PN ukázala, že Mfn2-AAV do značnej miery zachránil ultraštruktúru mitochondrií, normalizoval hladiny mtDNA a zvrátil vysokú expresiu antiangiogenézneho markera PCx ​​(obrázok 4, C až E). Vizuálna kontrola zachránených myší Mfn2cKO v pokojovom stave ukázala, že ich držanie tela a motorické symptómy (pohyb S1 až S3) sa zlepšili. Záverom možno povedať, že tieto experimenty ukazujú, že oneskorené opätovné zavedenie MFN2 do PN so silným deficitom OXPHOS je dostatočné na zvrátenie spotreby mtDNA a vyvolanie aterosklerózy, čím sa zabráni degenerácii axónov a neuronálnej smrti in vivo.
(A) Schéma znázorňujúca experimentálny harmonogram injekcie AAV kódujúceho MFN2, keď je aktivovaná uvedená metabolická dráha. (B) Reprezentatívne konfokálne snímky 12 týždňov starých rezov mozočku transdukovaných v 8. týždni u myší Mfn2cKO a značených protilátkou proti kalbindínu. Vpravo: Škálovanie axónových vlákien. Mierka priblíženia axónu je 450 a 75 μm. (C) Vľavo: Kvantifikácia hustoty Purkyňových buniek v transdukčnej slučke AAV (AAV+) (jednosmerná analýza rozptylu; n = 3 myši). Vpravo: Analýza fokusu mtDNA v transdukovanej PN v 12. týždni (nepárový t-test; n = 6 buniek od troch myší). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Reprezentatívne transmisné elektrónové mikrofotografie PN rezov mozočku Mfn2cKO transdukovaných uvedenými vírusovými vektormi. Ružová maska ​​znázorňuje plochu zaberanú dendritmi a žltý bodkovaný štvorec znázorňuje priblíženie vpravo; n predstavuje jadro. Mierka, 1 μm. (E) zobrazuje príklad farbenia PCx v PN transdukovanej v 12. týždni. Mierka, 20 μm. OE, nadmerná expresia; FC, násobná zmena.
Nakoniec sme skúmali dôležitosť prežitia buniek indukovaného peroxidázou u PN, u ktorých došlo k dysfunkcii OXPHOS. Vytvorili sme mCherry kódujúcu AAV-shRNA (krátka vlásenková RNA) špecificky zacielenú na myšaciu PCx mRNA (AAV-shPCx) a injekčne sme podali vírus alebo jeho skramblovanú kontrolu (AAV-scr) do mozočka myší Mfn2cKO. Injekcia sa uskutočnila v štvrtom týždni veku (obrázok 5A), aby sa dosiahlo účinné potlačenie PCx počas obdobia, keď sa expresia PCx zvýšila (obrázok 3C) a vrstva PN buniek bola stále neporušená (obrázok 1A). Stojí za zmienku, že potlačenie PCx (obrázok S8A) vedie k významnému zrýchleniu úmrtia PN, ktoré je obmedzené na infikovaný kruh (obrázok 5, B a C). Aby sme pochopili mechanizmus metabolických účinkov vyvolaných zvýšenou reguláciou PCx, študovali sme redoxný stav neuronukleárnych neurónov (PN) po súčasnej expresii PCx a AAV-sprostredkovaného optického biosenzora Grx1-roGFP2 (obrázok S8, B až D), aby sme vyhodnotili relatívnu zmenu redoxného potenciálu peptidu (38) u glutatiónu. Následne sme vykonali dvojfotónovú fluorescenčnú doživotnú zobrazovaciu mikroskopiu (FLIM) v akútnych rezoch mozgu 7-týždňových Mfn2cKO alebo kontrolných súrodencov, aby sme zistili potenciálne zmeny v cytoplazmatickom redoxnom stave po overení podmienok FLIM (obrázok S8, E až G). Analýza ukázala významný nárast oxidačného stavu jednotlivých Mfn2cKO PN bez expresie PCx, čo sa líši od kontrolných neurónov alebo Mfn2cKO PN exprimujúcich iba premiešanú shRNA (obrázok 5, D a E). Keď bola expresia PCx znížená, percento Mfn2cKO PN vykazujúcich vysoko oxidovaný stav sa zvýšilo viac ako trikrát (obrázok 5E), čo naznačuje, že zvýšená regulácia PCx udržala redoxnú kapacitu degenerovaných neurónov.
(A) Schéma znázorňujúca experimentálny harmonogram injekcie AAV kódujúceho shPCx, keď je aktivovaná uvedená metabolická dráha. (B) Reprezentatívne konfokálne fotografie 8-týždňových rezov mozočku u myší Mfn2cKO transdukovaných a značených protilátkou proti kalcineurínu v 4. týždni. Mierka, 450 μm. (C) Kvantifikácia hustoty Purkyňových buniek v slučkách transdukovaných AAV (jednosmerná analýza rozptylu; n = 3 až 4 myši). Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM; ***P < 0,001. (D) Reprezentatívny FLIM obrázok zobrazuje priemernú dĺžku života 7-týždňových PN exprimujúcich glutatiónový redoxný senzor Grx1-roGFP2 za špecifikovaných experimentálnych podmienok. Pomer LUT (vyhľadávacia tabuľka): časový interval prežitia (v pikosekundách). Mierka, 25 μm. (E) Histogram zobrazuje rozloženie hodnôt životnosti Grx1-roGFP2 z (D) (n=158 až 368 buniek u dvoch myší za každej podmienky). Koláčový graf nad každým histogramom: zobrazuje počet buniek s výrazne dlhšími (červená, oxidovaná) alebo kratšími (modrá, skrátená) hodnotami životnosti, ktoré presahujú 1 štandardnú odchýlku priemernej hodnoty životnosti v CTRL-AAV-scr. (F) Navrhovaný model ukazuje ochranný účinok zvýšenej regulácie neuronálneho PCx.
Celkovo údaje, ktoré tu poskytujeme, ukazujú, že reexpresia MFN2 môže úplne zachrániť pokročilú neuropatiu (PN) s ťažkým deficitom OXPHOS, ťažkou depléciou mtDNA a extrémne abnormálnou ista-podobnou morfológiou, čím sa zabezpečí kontinuálny progres aj pri pokročilých ochoreniach. Neurodegenerácia poskytuje reverzibilný dôkaz štádia pred bunkovou smrťou. Tento stupeň metabolickej flexibility je ďalej zdôraznený schopnosťou neurónov indukovať aterosklerózu (prepojenie cyklu TCA), ktorá inhibuje expresiu PCx v PN bez OXPHOS a zvyšuje bunkovú smrť, čím zohráva ochrannú úlohu (obrázok 5F).
V tejto štúdii sme poskytli dôkazy o tom, že reakciou neuronálnych nervov (PN) na dysfunkciu OXPHOS je postupná konvergencia k ateroskleróze cyklu TCA prostredníctvom diferenciálnej aktivačnej dráhy aktivovanej metabolickými programami. Proteomickú analýzu sme potvrdili mnohými doplnkovými metódami a zistili sme, že pri vystavení závažnej mitochondriálnej dysfunkcii majú neuróny doteraz neznámu formu metabolickej elasticity. Na naše prekvapenie celý proces prepojenia nemusí nevyhnutne znamenať terminálny metabolický stav, ktorý postupne a ireverzibilne sprevádza neurodegeneráciu, ale naše údaje naznačujú, že môže predstavovať udržiavací neurón aj v štádiu pred bunkovou smrťou. Mechanizmus funkčnej kompenzácie. Toto zistenie naznačuje, že neuróny majú v tele značný stupeň metabolickej plasticity. Táto skutočnosť dokazuje, že neskoršie opätovné zavedenie MFN2 môže zvrátiť expresiu kľúčových metabolických markerov a zabrániť degenerácii PN. Naopak, inhibuje aterosklerózu a urýchľuje nervový systém. transsexuál.
Jedným z najfascinujúcejších zistení v našom výskume je, že neuronálne siete (PN) bez OXPHOS môžu modifikovať metabolizmus cyklu TCA zvýšením regulácie enzýmov, ktoré špecificky stimulujú arteriosklerózu. Metabolická prestavba je bežným znakom rakovinových buniek, z ktorých niektoré sa spoliehajú na glutamín ako doplnok medziproduktov cyklu TCA na produkciu redukčných ekvivalentov, ktoré riadia dýchací reťazec a udržiavajú produkciu prekurzorov biosyntézy lipidov a nukleotidov (39, 40). Nedávna štúdia ukázala, že v periférnych tkanivách s dysfunkciou OXPHOS je opätovné prepojenie metabolizmu glutamínu/glutamátu tiež významným znakom (5, 41), kde smer vstupu glutamínu do cyklu TCA závisí od závažnosti poškodenia OXPHOS (41). Chýbajú však jasné dôkazy o akejkoľvek podobnosti neuronálnej metabolickej plasticity v tele a jej možnom význame v kontexte ochorenia. V nedávnej štúdii in vitro sa ukázalo, že primárne kortikálne neuróny mobilizujú zásoby glutamátu pre neurotransmisiu, čím podporujú oxidačný metabolizmus a aterosklerózu v podmienkach metabolického stresu (42). Stojí za zmienku, že pri farmakologickej inhibícii enzýmu sukcinátdehydrogenázy cyklu TCA sa predpokladá, že karboxylácia pyruvátu udržiava syntézu oxaloacetátu v kultivovaných neurónoch cerebelárnych granulí (34). Fyziologický význam týchto mechanizmov pre mozgové tkanivo (kde sa predpokladá, že ateroskleróza je obmedzená najmä na astrocyty) má však stále dôležitý fyziologický význam (43). V tomto prípade naše údaje ukazujú, že PN poškodené OXPHOS v tele sa môžu prepnúť na degradáciu BCAA a karboxyláciu pyruvátu, čo sú dva hlavné zdroje suplementácie medziproduktov TCA. Hoci sa okrem úlohy glutamátu a GABA pre neurotransmisiu (44) navrhol aj predpokladaný príspevok katabolizmu BCAA k neuronálnemu energetickému metabolizmu, stále neexistujú žiadne dôkazy o týchto mechanizmoch in vivo. Preto je ľahké špekulovať, že dysfunkčné PN môžu automaticky kompenzovať spotrebu medziproduktov TCA poháňanú procesom asimilácie zvýšením aterosklerózy. Najmä zvýšená regulácia PCx môže byť potrebná na udržanie zvýšeného dopytu po kyseline asparágovej, čo sa predpokladá v proliferujúcich bunkách s mitochondriálnou dysfunkciou (45). Naša metabolomická analýza však neodhalila žiadne významné zmeny v rovnovážnej hladine kyseliny asparágovej v Mfn2cKO PN (obrázok S6A), čo pravdepodobne odráža rozdielne metabolické využitie kyseliny asparágovej medzi proliferujúcimi bunkami a postmitotickými neurónmi. Hoci presný mechanizmus zvýšenej regulácie PCx v dysfunkčných neurónoch in vivo je potrebné ešte charakterizovať, preukázali sme, že táto predčasná reakcia hrá dôležitú úlohu pri udržiavaní redoxného stavu neurónov, čo bolo preukázané v experimentoch FLIM na rezoch mozočka. Najmä zabránenie PN v zvýšenej regulácii PCx môže viesť k oxidovanejšiemu stavu a urýchliť bunkovú smrť. Aktivácia degradácie BCAA a karboxylácia pyruvátu nie sú spôsobmi, ako charakterizovať periférne tkanivá mitochondriálnej dysfunkcie (7). Preto sa zdajú byť prioritnou vlastnosťou neurónov s deficitom OXPHOS, aj keď nie jedinou vlastnosťou, ktorá je dôležitá pre neurodegeneráciu. .
Cerebelárne ochorenie je heterogénny typ neurodegeneratívneho ochorenia, ktoré sa zvyčajne prejavuje ako ataxia a často poškodzuje neuroneurónové nervy (PNPH) (46). Táto populácia neurónov je obzvlášť náchylná na mitochondriálnu dysfunkciu, pretože ich selektívna degenerácia u myší je dostatočná na reprodukciu mnohých motorických symptómov, ktoré charakterizujú ľudskú spinocerebelárnu ataxiu (16, 47, 48). Podľa správ je transgénny myší model s mutantným génom spojený s ľudskou spinocerebelárnou ataxiou a má mitochondriálnu dysfunkciu (49, 50), čo zdôrazňuje dôležitosť štúdia dôsledkov deficitu OXPHOS pri PNPH. Preto je obzvlášť vhodné efektívne izolovať a študovať túto jedinečnú populáciu neurónov. Vzhľadom na to, že PN sú veľmi citlivé na tlak a tvoria nízky podiel celkovej populácie cerebelárnych buniek, pre mnohé štúdie založené na omike je ich selektívna separácia ako celých buniek stále náročným aspektom. Hoci je takmer nemožné dosiahnuť absolútnu absenciu kontaminácie iných typov buniek (najmä dospelých tkanív), kombinovali sme účinný krok disociácie s FACS, aby sme získali dostatočný počet životaschopných neurónov pre následnú proteomickú analýzu a dosiahli pomerne vysoké pokrytie proteínmi (približne 3000 proteínov) v porovnaní s existujúcim súborom údajov o celom mozočku (51). Zachovaním životaschopnosti celých buniek nám metóda, ktorú tu poskytujeme, umožňuje nielen kontrolovať zmeny v metabolických dráhach v mitochondriách, ale aj kontrolovať zmeny v ich cytoplazmatických náprotivkoch, čo dopĺňa použitie mitochondriálnych membránových značiek na obohatenie bunkového typu. Nová metóda pre počet mitochondrií v komplexných tkanivách (52, 53). Metóda, ktorú popisujeme, sa netýka len štúdia Purkyňových buniek, ale možno ju ľahko aplikovať na akýkoľvek typ bunky na riešenie metabolických zmien v chorých mozgoch, vrátane iných modelov mitochondriálnej dysfunkcie.
Nakoniec sme identifikovali terapeutické okno počas tohto procesu metabolickej prestavby, ktoré dokáže úplne zvrátiť kľúčové príznaky bunkového stresu a zabrániť neuronálnej degenerácii. Preto pochopenie funkčných dôsledkov tu opísaného prepojenia môže poskytnúť zásadný pohľad na možné liečby na udržanie neuronálnej životaschopnosti počas mitochondriálnej dysfunkcie. Na úplné odhalenie použiteľnosti tohto princípu na iné neurologické ochorenia je potrebný ďalší výskum zameraný na analýzu zmien v energetickom metabolizme v iných typoch mozgových buniek.
Myši MitoPark boli opísané už skôr (31). Myši C57BL/6N s loxP obklopujúcimi gény Mfn2 boli opísané už skôr (18) a krížené s myšami L7-Cre (23). Výsledné dvojito heterozygotné potomstvo bolo potom krížené s homozygotnými myšami Mfn2loxP/Mfn2loxP za účelom generovania Purkyňových špecifických génových knockoutov pre Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). V podskupine párenia bola alela Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) zavedená prostredníctvom ďalších krížení (20). Všetky postupy na zvieratách boli vykonané v súlade s európskymi, národnými a inštitucionálnymi smernicami a schválené LandesamtfürNatur of Umwelt a Verbraucherschutz, Severné Porýnie-Vestfálsko, Nemecko. Práca na zvieratách sa riadi aj pokynmi Európskej federácie asociácií pre vedy o laboratórnych zvieratách.
Po anestézii cervikálnej dislokácie tehotnej ženy sa izoluje myšie embryo (E13). Kôra sa preparovala v Hanksovom vyváženom soľnom roztoku (HBSS) doplnenom o 10 mM Hepes a prešla cez Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium obsahujúce papaín (20 U/ml) a cysteín (1μg/ml). Tkanivo sa inkubovalo v DMEM (médiu DMEM) a disociovalo sa enzymatickým štiepením (1μg/ml) pri teplote 37 °C počas 20 minút a potom sa mechanicky rozomlelo v DMEM doplnenom o 10 % fetálneho bovinného séra. Bunky sa naočkovali na krycie sklíčka potiahnuté polylyzínom v hustote 2 × 10⁶ na 6 cm kultivačnú misku alebo v hustote 0,5 × 10⁶ buniek/cm⁻² pre zobrazovaciu analýzu. Po 4 hodinách sa médium nahradilo Neurobasalovým bezsérovým médiom obsahujúcim 1 % doplnku B27 a 0,5 mM GlutaMax. Neuróny boli potom počas celého experimentu udržiavané pri teplote 37 °C a 5 % CO2 a kŕmené raz týždenne. Na vyvolanie rekombinácie in vitro sa na ošetrenie neurónov in vitro druhý deň použili 3 μl (24-jamková kultivačná miska) alebo 0,5 μl (24-jamková platňa) nasledujúceho vírusového vektora AAV9: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, katalógové číslo 105530-AAV9) a AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalógové číslo 105545-AAV9).
Myšia komplementárna DNA Mfn1 a Mfn2 (získaná z plazmidu Addgene č. 23212 a č. 23213) je na C-konci označená sekvenciou V5 (GKPIPNPLLGLDST) a je fúzovaná s mCherry v čítacom rámci prostredníctvom sekvencie T2A. Grx1-roGFP2 je dar od Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Nahradením kazety tdTomato pomocou konvenčných klonovacích metód bola kazeta subklonovaná do hlavného reťazca pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (referenčné číslo Addgene 28306) za vzniku vektorov pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 a pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Podobná stratégia bola použitá na vytvorenie kontrolného vektora pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Na vytvorenie konštruktu AAV-shPCx je potrebný plazmidový vektor AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA]-CMV-mCherry-U6-mPcx-[shRNA#1]), ktorý obsahuje sekvenciu DNA kódujúcu shRNA zacielenú na myší PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Pod kontrolou promótora U6 sa používa mCherry pod kontrolou promótora CMV. Produkcia pomocných vektorov AAV sa uskutočnila podľa pokynov výrobcu (Cell Biolabs). Stručne povedané, použite transferový plazmid nesúci kódujúci gén mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) alebo Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), ako aj kódujúci kapsidový proteín AAV1 a pomocný proteín. Baliaci plazmidový plazmid bol prechodne transfekovaný metódou fosforečnanu vápenatého. Surový vírusový supernatant bol získaný cyklami zmrazovania a rozmrazovania v kúpeli suchý ľad/etanol a bunky boli lyzované vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Vektor AAV bol purifikovaný diskontinuálnou ultracentrifugáciou s gradientom jodixanolu (24 hodín pri 32 000 ot./min. a 4 °C) a koncentrovaný pomocou odstredivého filtra Amicon ultra-15. Genómový titer AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 kópií genómu (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX bol podľa predtým opísaného postupu (54), meraný kvantitatívnou PCR v reálnom čase (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) a AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Primárne neuróny boli zoškrabané v ľadovo studenom 1x PBS, peletované a potom homogenizované v lyzačnom pufri 0,5 % Triton X-100 / 0,5 % deoxycholátu sodného/PBS obsahujúcom fosfatázu a inhibítor proteázy (Roche). Kvantifikácia proteínov bola vykonaná pomocou testu s kyselinou bicinchonínovou (Thermo Fisher Scientific). Bielkoviny boli potom separované elektroforézou na SDS-polyakrylamidovom géli a následne blotované na polyvinylidénfluoridovú membránu (GE Healthcare). Blokujte nešpecifické miesta a inkubujte s primárnou protilátkou (podrobnosti pozri v tabuľke S1) v 5 % mlieku v TBST (Tris-pufrovaný fyziologický roztok s Tween), premytie a sekundárna protilátka v TBST inkubujte. Inkubujte s primárnou protilátkou cez noc pri +4 °C. Po premytí aplikujte sekundárnu protilátku na 2 hodiny pri izbovej teplote. Následne inkubáciou toho istého blotu s protilátkou proti β-aktínu bola potvrdená rovnaká náplň. Detekcia konverziou na chemiluminiscenciu a zosilnením chemiluminiscencie (GE Healthcare).
Neuróny predtým nasiate na krycie sklíčka boli fixované 4 % paraformaldehydom (PFA)/PBS v stanovenom časovom bode pri izbovej teplote počas 10 minút. Krycie sklíčka boli najskôr permeované 0,1 % Triton X-100/PBS počas 5 minút pri izbovej teplote a potom v blokovacom pufri [3 % hovädzí sérový albumín (BSA)/PBS]. Na druhý deň boli krycie sklíčka premyté blokovacím pufrom a inkubované s príslušnou sekundárnou protilátkou konjugovanou s fluorofórom počas 2 hodín pri izbovej teplote; nakoniec boli vzorky dôkladne premyté v PBS s 4',6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI), kontrastne farbené a potom fixované na podložnom sklíčku mikroskopu pomocou Aqua-Poly/Mount.
Myši (samce a samice) boli anestetizované intraperitoneálnou injekciou ketamínu (130 mg/kg) a xylazínu (10 mg/kg) a subkutánne im bol podaný karprofénový analgetikum (5 mg/kg). Myši boli umiestnené do stereotaktického prístroja (Kopf) vybaveného teplou podložkou. Lebka bola odkrytá a pomocou zubnej vŕtačky bola zjemnená časť mozočkovej kôry zodpovedajúca mis kosti (od lambda: chvost 1,8, laterálny 1, zodpovedajúci lalokom IV a V). Pomocou zakrivenej ihly injekčnej striekačky sa opatrne vytvoril malý otvor v lebke, aby sa nenarušila vaskulatúra pod ňou. Potom sa do mikrootvoru (od -1,3 do -1 na ventrálnej strane tvrdej pleny mozgovej) pomaly zaviedla tenká sklenená kapilára a do mikroinjektora (Narishige) sa pomocou manuálnych striekačiek (Narishige) niekoľkokrát pri nízkom tlaku v priebehu 10 až 20 minút vstreklo 200 až 300 nl AAV. Po infúzii sa kapilára umiestni na ďalších 10 minút, aby sa vírus mohol úplne rozšíriť. Po odstránení kapilár sa koža starostlivo zašije, aby sa minimalizoval zápal rany a umožnilo sa zvieraťu zotavenie. Zvieratá boli po operácii niekoľko dní liečené analgetikami (kaspofén), počas ktorých bol ich fyzický stav starostlivo sledovaný a potom boli v stanovenom čase utratené. Všetky postupy boli vykonané v súlade s európskymi, národnými a inštitucionálnymi smernicami a boli schválené LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Severné Porýnie-Vestfálsko, Nemecko.
Zvieratá boli anestetizované ketamínom (100 mg/kg) a xylazínom (10 mg/kg) a srdce bolo najprv perfundované 0,1 M PBS a potom 4 % PFA v PBS. Tkanivo bolo preparované a fixované v 4 % PFA/PBS cez noc pri 4 °C. Na prípravu sagitálnych rezov (hrúbka 50 μm) z fixovaného mozgu v PBS bol použitý vibračný nôž (Leica Microsystems GmbH, Viedeň, Rakúsko). Pokiaľ nebolo uvedené inak, farbenie voľne plávajúcich rezov sa uskutočnilo podľa vyššie uvedeného postupu (13) pri izbovej teplote a miešaní. Stručne povedané, najprv boli získané rezy permeabilizované 0,5 % Triton X-100/PBS počas 15 minút pri izbovej teplote; pre niektoré epitopy (Pcx a Shmt2) v tris-EDTA pufri pri 80 °C (pH 9) sa rezy namiesto tohto kroku zahrievali 25 minút. Následne boli rezy inkubované s primárnou protilátkou (pozri tabuľku S1) v blokovacom pufri (3 % BSA/PBS) pri teplote 4 °C cez noc za miešania. Nasledujúci deň boli rezy premyté blokovacím pufrom a inkubované s príslušnou sekundárnou protilátkou konjugovanou s fluorofórom počas 2 hodín pri izbovej teplote; nakoniec boli rezy dôkladne premyté v PBS, kontrastne farbené s DAPI a potom fixované s AquaPolymount na mikroskopickom podložnom sklíčku.
Na zobrazenie vzorky sa použil laserový skenovací konfokálny mikroskop (TCS SP8-X alebo TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) vybavený bielym laserom a 405-diódovým ultrafialovým laserom. Excitáciou fluoroforu a zberom signálu pomocou hybridného detektora (HyDs) sa na zber stohovaných snímok zodpovedajúcich Nyquistovmu vzorkovaniu v sekvenčnom režime použil softvér LAS-X: pre nekvantitatívne panely ide o vysoko dynamické signály (napríklad v somatických bunkách a dendritoch) (mtYFP). Na detekciu počtu PN v režime BrightR sa použije hradlovanie od 0,3 do 6 ns na zníženie pozadia.
Zobrazovanie triedených buniek v reálnom čase. Po triedení v médiu Neurobasal-A obsahujúcom 1 % doplnku B27 a 0,5 mM GlutaMax boli bunky okamžite nasiate na sklenené podložné sklíčka potiahnuté poly-l-lyzínom (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalógové číslo 80826) a potom udržiavané pri teplote 37 °C a 5 % CO2 počas 1 hodiny, aby sa bunky usadili. Zobrazovanie v reálnom čase sa uskutočnilo na laserovom skenovacom konfokálnom mikroskope Leica SP8 vybavenom bielym laserom, HyD, olejovým objektívom s numerickou apertúrou 63×[1,4 (NA)] a vyhrievacím stolíkom.
Myš bola rýchlo anestetizovaná oxidom uhličitým a dekapitovaná, mozog bol rýchlo vybratý z lebky a narezaný na sagitálne rezy s hrúbkou 200 μm (pre experiment so značením 13C) alebo 275 μm (pre experimenty s dvoma fotónmi) naplnené nasledujúcimi materiálmi. Zmrzlina (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Nemecko) je naplnená nasledujúcimi látkami: 125 mM ľadovo vychladený, uhlíkom nasýtený (95 % O2 a 5 % CO2) nízkokapacitný + umelý mozgovomiechový mok (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosfátový tlmivý roztok sodíka, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukóza, 0,5 mM CaCl2 a 3,5 mM MgCl2 (osmotický tlak 310 až 330 mmol). Získané rezy mozgu sa prenesú do predinkubačných komôr obsahujúcich médium s vyšším obsahom Ca2+ ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosfátový tlmivý roztok sodný, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM D-glukóza, 1,0 mM CaCl2 a 2,0 mM MgCl2) s pH 7,4 a koncentráciou 310 až 320 mmol.
Počas zobrazovacieho procesu boli rezy presunuté do vyhradenej zobrazovacej miestnosti a experiment sa vykonával za kontinuálnej perfúzie ACSF pri konštantnej teplote 32 °C až 33 °C. Na zobrazovanie rezov sa použil multifotónový laserový skenovací mikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) vybavený objektívom Leica 25x (NA 0,95, voda) a titán-safírový laser (Chameleon Vision II, Coherent). Modul FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Zmeny v cytoplazmatickom redoxnom stave PN boli merané dvojfotónovou FLIM v sagitálnych rezoch mozgu, kde biosenzor Grx1-roGFP2 cielene sledoval PN. Vo vrstve PN je akvizičné pole vybrané približne 50 až 80 μm pod povrchom rezu, aby sa zabezpečila prítomnosť životaschopnej PN (t. j. absencia guľôčkovej štruktúry alebo neuronálnych morfologických zmien pozdĺž dendritov) a dvojito pozitívny senzor roGFP2 a AAV kódujúci shRNA PCx alebo jej kontrolnú sekvenciu (každý koexprimujúci mCherry). Zbierajte snímky z jedného vrstvenia s 2x digitálnym zoomom [excitačná vlnová dĺžka: 890 nm; 512 nm 512 pixelov]. Detekcia: interná HyD, filtračná skupina fluoresceín izotiokyanátu (FITC)] a spriemerovanie obrazu v priebehu 2 až 3 minút sa používa na zabezpečenie dostatočného množstva fotónov (celkovo 1000 fotónov) na fitovanie krivky. Citlivosť sondy Grx1-roGFP2 a overenie podmienok FLIM sa vykonali monitorovaním hodnoty dĺžky života roGFP2 po pridaní exogénneho 10 mM H2O2 do perfúzneho ACSF (na maximalizáciu oxidácie, čo vedie k predĺženiu dĺžky života) a následnom pridaní 2 mM ditiotreitolu (minimalizácia stupňa redukcie, čo vedie k skráteniu dĺžky života) (obrázok S8, D až G). Na analýzu získaných výsledkov sa použil softvér FLIMfit 5.1.1, fitovanie jednej exponenciálnej krivky rozpadu celého obrazu na nameranú IRF (funkcia odozvy prístroja) a χ2 je približne 1. Na výpočet dĺžky života jednej PN sa manuálne nakreslila maska ​​okolo nervového tela a na kvantifikáciu sa použila priemerná dĺžka života v každej maske.
Analýza mitochondriálneho potenciálu. Po inkubácii akútnej sekcie so 100 nM TMRM priamo pridaným do perfundovaného ACSF počas 30 minút boli zmeny mitochondriálneho potenciálu PN merané dvojfotónovým mikroskopom. Zobrazovanie TMRM sa uskutočnilo excitáciou sondy pri 920 nm a použitím interného HyD (tetrametylrodamín izotiokyanát: 585/40 nm) na zber signálov; použitím rovnej excitačnej vlnovej dĺžky, ale s použitím iného interného HyD (FITC: 525/50) na zobrazenie mtYFP. Na vyhodnotenie mitochondriálneho potenciálu na úrovni jednotlivých buniek použite doplnok Image Calculator od ImageJ. Stručne povedané, rovnica doplnok: signál = min (mtYFP, TMRM) sa používa na identifikáciu mitochondriálnej oblasti, ktorá zobrazuje signál TMRM v Purkyňovom somálskom syndróme v konfokálnom obraze s jedným vrstvením zodpovedajúceho kanála. Potom sa kvantifikuje plocha pixelu vo výslednej maske a potom sa normalizuje na zodpovedajúcom prahovom jednovrstvovom obraze mtYFP kanála, aby sa získala mitochondriálna frakcia znázorňujúca mitochondriálny potenciál.
Obrázok bol dekonvoluovaný pomocou softvéru Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Pre naskenované obrázky dlaždíc sa montáž jednej dlaždice vytvorí pomocou algoritmu automatického spájania, ktorý poskytuje softvér LAS-X. Po kalibrácii obrazu sa na ďalšie spracovanie obrazu a rovnomerné nastavenie jasu a kontrastu použije program ImageJ a Adobe Photoshop. Na grafickú prípravu sa použije Adobe Illustrator.
Analýza fokusu mtDNA. Počet lézií mtDNA bol kvantifikovaný na cerebelárnych rezoch označených protilátkami proti DNA pomocou konfokálneho mikroskopu. Každá cieľová oblasť bola vytvorená pre telo bunky a jadro každej bunky a príslušná plocha bola vypočítaná pomocou pluginu Multi Measure (softvér ImageJ). Odčítaním plochy jadra od plochy tela bunky sa získa cytoplazmatická plocha. Nakoniec bol na automatickú kvantifikáciu cytoplazmatických bodov DNA indikujúcich mtDNA na prahovom obraze použitý plugin Analyze Particles (softvér ImageJ) a získané výsledky boli normalizované na priemer PN myší CTRL. Výsledky sú vyjadrené ako priemerný počet nukleozidov na bunku.
Analýza expresie proteínov. Na vyhodnotenie expresie proteínov v PN na úrovni jednotlivých buniek použite doplnok Image Calculator od ImageJ. Stručne povedané, v jednovrstvovom konfokálnom obraze zodpovedajúceho kanála sa pomocou rovnice: signál = min (mtYFP, protilátka) identifikuje mitochondriálna oblasť, ktorá vykazuje imunoreaktivitu na určitú protilátku v Purkinovej chorobe. Potom sa kvantifikuje plocha pixelu vo výslednej maske a následne sa normalizuje na zodpovedajúcom prahovom jednovrstvovom obraze mtYFP kanála, aby sa získala mitochondriálna frakcia zobrazeného proteínu.
Analýza hustoty Purkyňových buniek. Na vyhodnotenie hustoty Purkyňových buniek sa použil plugin Cell Counter programu ImageJ vydelením počtu spočítaných Purkyňových buniek dĺžkou cerebelárneho kruhu, ktorý spočítané bunky obsadzujú.
Príprava a odber vzoriek. Mozgy z kontrolnej skupiny a myší Mfn2cKO boli fixované v 2 % PFA/2,5 % glutaraldehydu v 0,1 M fosfátovom pufri (PB) a potom boli pripravené koronálne rezy s použitím nálevníkov (Leica Mikrosysteme GmbH, Viedeň, Rakúsko) (hrúbka 50 až 60 μm). Následne boli fixované v PB pufri v 1 % tetraoxide a 1,5 % ferokyanide draselnom pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Rezy boli trikrát premyté destilovanou vodou a potom farbené 70 % etanolom obsahujúcim 1 % uranylacetátu počas 20 minút. Rezy boli potom dehydratované v odstupňovanom alkohole a zaliate do epoxidovej živice Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, katalógové číslo 14040) medzi silikónom potiahnutými sklenenými podložnými sklíčkami a nakoniec pri 60 °C polymerizované v peci počas 48 hodín. Bola vybraná oblasť mozočkovej kôry a na mikroskope Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viedeň, Rakúsko) boli narezané ultratenké rezy s hrúbkou 50 nm a odobraté na medenú štrbinovú mriežku s rozmermi 2×1 mm potiahnutú polystyrénovou fóliou. Rezy boli farbené roztokom 4 % uranylacetátu v H2O počas 10 minút, niekoľkokrát premyté H2O, potom Reynoldsovým citrátom olovnatým v H2O počas 10 minút a následne niekoľkokrát premyté H2O. Mikrofotografie boli zhotovené transmisným elektrónovým mikroskopom Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) s použitím digitálnej kamery TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Nemecko).
U myší infikovaných AAV bol mozog oddelený a narezaný na 1 mm hrubý sagitálny rez a mozoček bol vyšetrený pomocou fluorescenčného mikroskopu na identifikáciu kruhu infikovaného AAV (t. j. exprimujúceho mCherry). Používajú sa iba experimenty, v ktorých injekcia AAV vedie k veľmi vysokej transdukčnej účinnosti vrstvy Purkyňových buniek (t. j. takmer celej vrstvy) v najmenej dvoch po sebe nasledujúcich cerebelárnych kruhoch. Slučka transdukovaná AAV bola mikrodisekovaná na nočnú postfixáciu (4 % PFA a 2,5 % glutaraldehydu v 0,1 M kokoátovom pufri) a ďalej spracovaná. Na vloženie EPON bolo fixované tkanivo premyté 0,1 M kokoátovým pufrom sodným (Applichem) a inkubované s 2 % OsO4 (os, Science Services; Caco) v 0,1 M kokoátovom pufri sodnom (Applichem) počas 4 hodín, potom premyté počas 2 hodín. Opakujte 3-krát s 0,1 M kokamidovým pufrom. Následne sa na inkubáciu každého etanolového roztoku pri teplote 4 °C počas 15 minút použila vzostupná séria etanolu, aby sa tkanivo dehydratovalo. Tkanivo sa prenieslo do propylénoxidu a inkubovalo sa cez noc v EPON (Sigma-Aldrich) pri teplote 4 °C. Tkanivo sa umiestnilo do čerstvého EPON pri izbovej teplote na 2 hodiny a potom sa zalialo do 62 °C na 72 hodín. Na narezanie ultratenkých rezov s hrúbkou 70 nm sa použil ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) a diamantový nôž (Diatome, Biel, Švajčiarsko) a farbili sa 1,5 % uranylacetátom počas 15 minút pri teplote 37 °C a potom sa farbili roztokom citrátu olovnatého 4 minúty. Elektrónové mikrofotografie sa zhotovili pomocou transmisného elektrónového mikroskopu JEM-2100 Plus (JEOL) vybaveného kamerou Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) a softvérom DigitalMicrograph (Gatan). Na analýzu sa elektrónové mikrofotografie získali s digitálnym zoomom 5000× alebo 10 000×.
Morfologická analýza mitochondrií. Pre všetky analýzy boli kontúry jednotlivých mitochondrií manuálne načrtnuté na digitálnych obrázkoch pomocou softvéru ImageJ. Analyzujú sa rôzne morfologické parametre. Hustota mitochondrií je vyjadrená ako percento získané vydelením celkovej mitochondriálnej plochy každej bunky plochou cytoplazmy (plocha cytoplazmy = plocha bunky - plocha bunkového jadra) × 100. Kruhovitosť mitochondrií sa vypočíta pomocou vzorca [4π∙(plocha/obvod 2)]. Analyzovala sa morfológia mitochondrií a rozdelila sa do dvoch kategórií („tubulárne“ a „blistrové“) podľa ich hlavných tvarov.
Analýza počtu a hustoty autofagozómov/lyzozómov. Na manuálne vyznačenie kontúr každého autofagozómu/lyzozómu v digitálnom obraze použite softvér ImageJ. Plocha autofagozómov/lyzozómov sa vyjadruje ako percento vypočítané vydelením celkovej plochy štruktúry autofagozómov/lyzozómov každej bunky plochou cytoplazmy (plocha cytoplazmy = plocha bunky - plocha jadra) × 100. Hustota autofagozómov/lyzozómov sa vypočíta vydelením celkového počtu počtom štruktúr autofagozómov/lyzozómov na bunku (z hľadiska cytoplazmatickej plochy) (plocha cytoplazmy = plocha bunky - plocha jadra).
Značenie pre akútne rezy a prípravu vzoriek. Pri experimentoch, ktoré vyžadujú značenie glukózou, preneste akútne rezy mozgu do predinkubačných komôr, ktoré obsahujú nasýtený uhlík (95 % O2 a 5 % CO2), ACSF s vysokým obsahom Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosfátový tlmivý roztok s obsahom fosforečnanu sodného, ​​25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukózy, 1,0 mM CaCl2 a 2,0 mM MgCl2, upravené na pH 7,4 a 310 až 320 mOsm), v ktorom je glukóza substitúciou 13C6-glukózy (Eurisotop, katalógové číslo CLM-1396). Pri experimentoch, ktoré vyžadujú značenie pyruvátom, sa rezy akútneho mozgu prenesú do roztoku ACSF s vyšším obsahom Ca2 + (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosforečnanový tlmivý roztok sodný, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukóza, 1,0 mM CaCl2 a pridaním 2,0 mM MgCl2, úpravou pH na 7,4 a rozmedzím od 310 do 320 mOsm) a pridaním 1 mM 1-[1-13C]pyruvátu (Eurisotop, katalógové číslo CLM-1082). Rezy sa inkubujú 90 minút pri teplote 37 °C. Na konci experimentu sa rezy rýchlo premyjú vodným roztokom (pH 7,4) obsahujúcim 75 mM uhličitanu amónneho a potom sa homogenizujú v zmesi acetonitril (ACN):metanol:voda v pomere 40:40:20 (v:v:v). Po 30 minútach inkubácie rezov na ľade sa vzorky centrifugovali pri 21 000 g počas 10 minút pri teplote 4 °C a číry supernatant sa vysušil v koncentrátore SpeedVac. Výsledná sušená metabolitová peleta sa skladovala pri teplote -80 °C až do analýzy.
Analýza aminokyselín značených 13C pomocou kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou. Pre analýzu kvapalinovou chromatografiou s hmotnostnou spektrometriou (LC-MS) bol metabolitový pelet resuspendovaný v 75 μl vody triedy LC-MS (Honeywell). Po centrifugácii pri 21 000 g počas 5 minút pri 4 °C bolo 20 μl vyčíreného supernatantu použitých na analýzu toku aminokyselín, zatiaľ čo zvyšok extraktu bol okamžite použitý na analýzu aniónov (pozri nižšie). Analýza aminokyselín bola vykonaná pomocou predtým opísaného protokolu derivatizácie benzoylchloridu (55, 56). V prvom kroku bolo k 20 μl extraktu metabolitu pridaných 10 μl 100 mM uhličitanu sodného (Sigma-Aldrich) a potom bolo k ACN triedy LC pridaných 10 μl 2 % benzoylchloridu (Sigma-Aldrich). Vzorka bola krátko vortexovaná a potom centrifugovaná pri 21 000 g počas 5 minút pri 20 °C. Preneste vyčistený supernatant do 2 ml fľaštičky s automatickým vzorkovačom s kužeľovou sklenenou vložkou (objem 200 μl). Vzorky boli analyzované pomocou ultravysokoúčinného LC systému Acquity iClass (Waters) pripojeného k vysokorozlišovaciemu presnému hmotnostnému spektrometru Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Na analýzu boli 2 μl derivatizovanej vzorky vstreknuté do vysokopevnostnej silikagélovej T3 kolóny s rozmermi 100 × 1,0 mm (Waters) obsahujúcej častice s veľkosťou 1,8 μm. Prietok je 100 μl/min a pufrovací systém pozostáva z pufra A (10 mM mravčan amónny a 0,15 % kyselina mravčia vo vode) a pufra B (ACN). Gradient je nasledovný: 0 % B v čase 0 minút; 0 % B. 0 až 15 % B v čase 0 až 0,1 minúty; 15 až 17 % B v čase 0,1 až 0,5 minúty; B pri 17 až 55 % pri 0,5 až 14 minútach; B pri 55 až 70 % pri 14 až 14,5 minútach; pri 14,5 až 70 až 100 % B pri 18 minútach; 100 % B pri 18 až 19 minútach; 100 až 0 % B pri 19 až 19,1 minútach; 0 % B pri 19,1 až 28 minútach (55, 56). Hmotnostný spektrometer QE-HF pracuje v režime pozitívnej ionizácie s hmotnostným rozsahom m/z (pomer hmotnosť/náboj) 50 až 750. Použité rozlíšenie je 60 000 a získaný iónový cieľ s riadením zosilnenia (AGC) je 3 × 106 a maximálny iónový čas je 100 milisekúnd. Zdroj vyhrievanej elektrosprejovej ionizácie (ESI) pracuje pri rozprašovacom napätí 3,5 kV, kapilárnej teplote 250 °C, prietoku vzduchu v plášti 60 AU (ľubovoľné jednotky) a pomocnom prietoku vzduchu 20 AU. 250 °C. Šošovka S je nastavená na 60 AU.
Analýza organických kyselín značených 13C pomocou aniónovej chromatografie-MS. Zvyšná zrazenina metabolitov (55 μl) sa analyzovala pomocou iónového chromatografického systému Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) pripojeného k hmotnostnému spektrometru QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Stručne povedané, 5 μl extraktu metabolitov sa vstreklo do kolóny Dionex IonPac AS11-HC vybavenej HPLC (2 mm × 250 mm, veľkosť častíc 4 μm, Thermo Fisher Scientific) v režime čiastočnej slučky s plniacim pomerom 1. ) Predkolóna Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Teplota kolóny sa udržiava na 30 °C a automatický vzorkovač je nastavený na 6 °C. Na vytvorenie gradientu hydroxidu draselného pomocou generátora eluentu sa použije patróna s hydroxidom draselným dodávaná s deionizovanou vodou. Separácia metabolitov pri prietoku 380 μl/min s použitím nasledujúceho gradientu: 0 až 3 minúty, 10 mM KOH; 3 až 12 minút, 10 až 50 mM KOH; 12 až 19 minút, 50 až 100 mM KOH; 19 až 21 minút, 100 mM KOH; 21 až 21,5 minúty, 100 až 10 mM KOH. Kolóna bola znovu ekvilibrovaná pri 10 mM KOH počas 8,5 minúty.
Eluované metabolity sa po kolóne zmiešajú s prúdom izopropanolu s prietokom 150 μl/min a potom sa privedú do hmotnostného spektrometra s vysokým rozlíšením pracujúceho v režime negatívnej ionizácie. MS monitoruje hmotnostný rozsah od m/z 50 do 750 s rozlíšením 60 000. AGC je nastavené na 1 × 106 a maximálny iónový čas sa udržiava na 100 ms. Vyhrievaný zdroj ESI pracoval pri rozprašovacom napätí 3,5 kV. Ostatné nastavenia zdroja iónov sú nasledovné: teplota kapiláry 275 °C; prietok plynu plášťa 60 AU; prietok pomocného plynu 20 AU pri 300 °C a nastavenie šošovky S na 60 AU.
Analýza dát metabolitov značených 13C. Na analýzu dát pomeru izotopov použite softvér TraceFinder (verzia 4.2, Thermo Fisher Scientific). Identita každej zlúčeniny bola overená spoľahlivou referenčnou zlúčeninou a nezávisle analyzovaná. Na vykonanie analýzy obohatenia izotopmi bola plocha extrahovaného iónového chromatogramu (XIC) každého izotopu 13C (Mn) extrahovaná z [M + H] +, kde n je číslo uhlíka cieľovej zlúčeniny, použitej na analýzu aminokyselín, alebo [MH] + sa používa na analýzu aniónov. Hmotnostná presnosť XIC je menšia ako päť častíc na milión a presnosť RT je 0,05 minúty. Analýza obohatenia sa vykonáva výpočtom pomeru každého detegovaného izotopu k súčtu všetkých izotopov zodpovedajúcej zlúčeniny. Tieto pomery sú uvedené ako percentuálne hodnoty pre každý izotop a výsledky sú vyjadrené ako molárne percento obohatenia (MPE), ako bolo opísané predtým (42).
Zmrazená neurónová peleta sa homogenizovala v ľadovo chladnom 80 % metanole (v/v), vortexovala a inkubovala pri teplote -20 °C počas 30 minút. Vzorku opäť vortexovala a miešala pri teplote +4 °C počas 30 minút. Vzorka sa centrifugovala pri 21 000 g počas 5 minút pri teplote 4 °C a potom sa výsledný supernatant zozbieral a vysušil pomocou koncentrátora SpeedVac pri teplote 25 °C na následnú analýzu. Ako je opísané vyššie, LC-MS analýza sa vykonala na aminokyselinách triedených buniek. Pomocou TraceFinder (verzia 4.2, Thermo Fisher Scientific) sa vykonala analýza údajov s použitím monoizotopovej hmotnosti každej zlúčeniny. Kvantilová normalizácia údajov o metabolitoch sa vykonala pomocou softvérového balíka preprocessCore (57).
Príprava rezov. Myš bola rýchlo anestetizovaná oxidom uhličitým a dekapitovaná, mozog bol rýchlo vybratý z lebky a na jej rozrezanie na sagitálne rezy s hrúbkou 300 až 375 μm bol použitý vibračný nôž naplnený ľadom (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Nemecko). Splyňovanie za studena s uhlíkom (95 % O2 a 5 % CO2). Nízky obsah Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosforečnanový tlmivý roztok sodný, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukóza, 1,0 mM CaCl2 a 6,0 mM MgCl2. Upravené pH na 7,4 a 310 až 330 mOsm). Získané rezy mozgu preneste do komory obsahujúcej vyšší obsah Ca2+ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM fosfátový tlmivý roztok sodný, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM D-glukózy, 4,0 mM CaCl2 a 3,5 mM MgCl2) s pH 7,4 a tlakom 310 až 320 mOsm. Rezy skladujte 20 až 30 minút, aby sa mohli pred zaznamenaním obnoviť.
záznam. Na všetky záznamy sa použil mikroskopický stolík vybavený pevnou záznamovou komorou a objektívom s 20-násobným zväčšením pre imerzné použitie vo vode (Scientifica). Predpokladané Purkyňove bunky boli identifikované (i) veľkosťou tela, (ii) anatomickým umiestnením mozočka a (iii) expresiou fluorescenčného reportérového génu mtYFP. Pipeta s odporom hrotu 5 až 11 megaohmov sa vyťahovala pomocou borosilikátovej sklenenej kapiláry (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Nemecko) a horizontálnej pipety Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA. Všetky záznamy sa uskutočnili pomocou zosilňovača ELC-03XS npi patch clamp (npi electronic GmbH, Tam, Nemecko), ktorý bol riadený softvérom Signal (verzia 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Spojené kráľovstvo). Experiment sa zaznamenával pri vzorkovacej frekvencii 12,5 kHz. Signál je filtrovaný dvoma krátkopriepustnými Besselovými filtrami s medznými frekvenciami 1,3 a 10 kHz. Kapacita membrány a pipety je kompenzovaná kompenzačným obvodom pomocou zosilňovača. Všetky experimenty boli vykonané pod kontrolou kamery Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Nemecko), ktorá bola riadená softvérom Hokawo (verzia 2.8, Hamamatsu, Gerden, Nemecko).
Rutinná konfigurácia a analýza celých buniek. Bezprostredne pred zaznamenávaním naplňte pipetu vnútorným roztokom obsahujúcim nasledujúce látky: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM glukonát draselný, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanozíntrifosfát (GTP) (Na) a 10,0 mM kreatinínfosfát boli upravené na pH 7,25 a osmotický tlak bol 290 mOsm (sacharóza). Bezprostredne po aplikácii sily 0 pA na pretrhnutie membrány bol zmeraný pokojový membránový potenciál. Vstupný odpor sa meria aplikáciou hyperpolarizovaných prúdov -40, -30, -20 a -10 pA. Zmerajte veľkosť napäťovej odozvy a na výpočet vstupného odporu použite Ohmov zákon. Spontánna aktivita bola zaznamenávaná v napäťovom svorkovom zariadení počas 5 minút a sPSC bol identifikovaný a meraný v programe Igor Pro (verzia 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) pomocou poloautomatického rozpoznávacieho skriptu. IV krivka a ustálený prúd sa merajú upínaním batérie na rôzne potenciály (od -110 mV) a zvyšovaním napätia v krokoch po 5 mV. Produkcia AP (AP) bola testovaná aplikáciou depolarizačného prúdu. Bunku upevnite na -70 mV počas aplikácie depolarizačného prúdového impulzu. Upravte veľkosť kroku každej záznamovej jednotky samostatne (10 až 60 pA). Vypočítajte maximálnu frekvenciu AP manuálnym spočítaním impulzných špičiek, ktoré spôsobujú najvyššiu frekvenciu AP. Prah AP sa analyzuje pomocou druhej derivácie depolarizačného impulzu, ktorý ako prvý spustí jeden alebo viac AP.
Konfigurácia a analýza perforovanej vzorky. Vykonajte záznam perforovanej vzorky pomocou štandardných protokolov. Použite pipetu bez obsahu ATP a GTP, ktorá neobsahuje nasledujúce zložky: 128 mM glukonát K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA a 2 mM MgCl2 a upravte pH na 7,2 (pomocou KOH). ATP a GTP sú z intracelulárneho roztoku vynechané, aby sa zabránilo nekontrolovanej permeabilite bunkovej membrány. Pipeta s perforovanou vzorkou sa naplní vnútorným roztokom obsahujúcim amfotericín (približne 200 až 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich), aby sa získal záznam s perforovanou vzorkou. Amfotericín bol rozpustený v dimetylsulfoxide (konečná koncentrácia: 0,1 až 0,3 %; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Použitá koncentrácia DMSO nemala významný vplyv na študované neuróny. Počas procesu dierovania sa kontinuálne monitoroval odpor kanála (Ra) a experiment sa začal po stabilizácii amplitúdy Ra a AP (20 – 40 minút). Spontánna aktivita sa merala v napäťových a/alebo prúdových svorkách počas 2 až 5 minút. Analýza dát sa vykonala pomocou programov Igor Pro (verzia 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (verzia 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) a GraphPad Prism (verzia 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Na identifikáciu spontánnych AP sa používa doplnok IgorPro NeuroMatic v3.0c. AP sa identifikujú automaticky pomocou daného prahu, ktorý sa nastavuje individuálne pre každý záznam. Pomocou intervalu hrotov sa určí frekvencia hrotov s maximálnou okamžitou frekvenciou hrotov a priemernou frekvenciou hrotov.
Izolácia PN. Adaptáciou na predtým publikovaný protokol boli PN purifikované z mozočka myši v špecifikovanom štádiu (58). Stručne povedané, mozoček bol vypreparovaný a rozdrvený v ľadovo chladnom disociačnom médiu [bez HBSS Ca2+ a Mg2+, doplnené o 20 mM glukózy, penicilínu (50 U/ml) a streptomycínu (0,05 mg/ml)] a potom bolo médium natrávené v papaíne [HBSS, doplnené o 1-cysteín·HCl (1 mg/ml), papaín (16 U/ml) a deoxyribonukleázu I (DNáza I; 0,1 mg/ml)]. Ošetrenie po dobu 30 minút pri teplote 30 °C. Najprv premyte tkanivá v médiu HBSS obsahujúcom vaječný hlien (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) a DNázu (0,1 mg/ml) pri izbovej teplote, aby sa zabránilo enzymatickému štiepeniu, a potom v médiu HBSS obsahujúcom 20 mM glukózy. Jemným rozomletím v HBSS sa uvoľnili jednotlivé bunky, penicilín (50 U/ml), streptomycín (0,05 mg/ml) a DNáza (0,1 mg/ml). Výsledná bunková suspenzia sa prefiltrovala cez 70 μm bunkové sitko, potom sa bunky peletovali centrifugáciou (1110 ot./min., 5 minút, 4 °C) a resuspendovali v triediacom médiu [HBSS, doplnené 20 mM glukózou, 20 % fetálnym bovinným sérom, penicilínom (50 U/ml) a streptomycínom (0,05 mg/ml)]; vyhodnoťte životaschopnosť buniek pomocou propídiumjodidu a upravte hustotu buniek na 1 × 106 až 2 × 106 buniek/ml. Pred prietokovou cytometriou bola suspenzia prefiltrovaná cez 50 μm bunkové sitko.
Prietokový cytometer. Triedenie buniek sa uskutočnilo pri teplote 4 °C s použitím prístroja FACSAria III (BD Biosciences) a softvéru FACSDiva (BD Biosciences, verzia 8.0.1). Bunková suspenzia sa triedila pomocou 100 μm trysky pod tlakom 20 psi rýchlosťou ~2800 udalostí/s. Keďže tradičné kritériá hradlovania (veľkosť buniek, bimodálna diskriminácia a charakteristiky rozptylu) nedokážu zabezpečiť správnu izoláciu PN od iných typov buniek, stratégia hradlovania sa nastavuje na základe priameho porovnania intenzity YFP a autofluorescencie u myší mitoYFP+ ​​​​a kontrolných myší mitoYFP −. YFP sa excituje ožiarením vzorky laserovým lúčom s vlnovou dĺžkou 488 nm a signál sa deteguje pomocou pásmového filtra s vlnovou dĺžkou 530/30 nm. U myší mitoYFP+ ​​​​sa na rozlíšenie fragmentov neuronálneho tela a axónu používa aj relatívna sila reportérového génu Rosa26-mitoYFP. 7-AAD sa excituje žltým laserom s vlnovou dĺžkou 561 nm a detekuje sa pásmovým filtrom s vlnovou dĺžkou 675/20 nm, aby sa vylúčili odumreté bunky. Aby sa súčasne oddelili astrocyty, bunková suspenzia sa zafarbila ACSA-2-APC, potom sa vzorka ožiarila laserovým lúčom s vlnovou dĺžkou 640 nm a na detekciu signálu sa použil pásmový filter s vlnovou dĺžkou 660/20 nm.
Zozbierané bunky boli peletované centrifugáciou (1110 ot./min., 5 minút, 4 °C) a skladované pri teplote -80 °C až do použitia. Myši Mfn2cKO a ich mláďatá z vrhu boli klasifikované v ten istý deň, aby sa minimalizovala variabilita postupu. Prezentácia a analýza údajov FACS boli vykonané pomocou softvéru FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Ako je uvedené vyššie (59), na izoláciu DNA z vytriedených neurónov pre následnú kvantifikáciu mtDNA sa používa real-time PCR. Linearita a prahová citlivosť boli najprv testované pomocou qPCR na rôznom počte buniek. Stručne povedané, odoberte 300 PN v lyzačnom pufri pozostávajúcom z 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5 % Tween 20 a proteinázy K (200 ng/ml) a inkubujte pri teplote 55 °C počas 120 minút. Bunky boli ďalej inkubované pri teplote 95 °C počas 10 minút, aby sa zabezpečila úplná inaktivácia proteinázy K. Pomocou sondy TaqMan (Thermo Fisher) špecifickej pre mt-Nd1 bola mtDNA meraná semikvantitatívnou PCR v systéme 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). gény mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalógové číslo AIVI3E8) a 18S (Thermo Fisher Scientific, katalógové číslo Hs99999901_s1).
Príprava vzorky proteómu. Zahrievaním roztoku na 95 °C počas 10 minút a sonikáciou v lyzačnom pufri [6 M guanidínchlorid, 10 mM tris(2-karboxyetyl)fosfín hydrochlorid, 10 mM chlóracetamid a 100 mM Tris-Lyse zmrazené neurónové pelety v HCl]. Na Bioruptore (Diagenode) počas 10 minút (30 sekúnd pulz / 30 sekúnd pauza). Vzorka bola zriedená v pomere 1:10 v 20 mM tris-HCl (pH 8,0), zmiešaná s 300 ng trypsínového zlata (Promega) a inkubovaná cez noc pri 37 °C, aby sa dosiahlo úplné trávenie. Na druhý deň bola vzorka centrifugovaná pri 20 000 g počas 20 minút. Supernatant bol zriedený 0,1 % kyselinou mravčou a roztok bol odsolený pomocou vlastnoručne vyrobených StageTips. Vzorka bola vysušená v prístroji SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) pri teplote 45 °C a potom bol peptid suspendovaný v 0,1 % kyseline mravčej. Všetky vzorky boli pripravené súčasne tou istou osobou. Na analýzu vzoriek astrocytov bolo 4 μg odsolených peptidov označených tandemovou hmotnostnou značkou (TMT10plex, katalógové číslo 90110, Thermo Fisher Scientific) s pomerom peptidu k činidlu TMT 1:20. Na značenie TMT bolo 0,8 mg činidla TMT resuspendovaných v 70 μl bezvodého ACN a vysušený peptid bol rekonštituovaný v 9 μl 0,1 M TEAB (trietylamóniumbikarbonát), do ktorého bolo pridaných 7 μl činidla TMT v ACN. Koncentrácia bola 43,75 %. Po 60 minútach inkubácie bola reakcia ukončená 2 μl 5 % hydroxylamínu. Značené peptidy boli zozbierané, vysušené, resuspendované v 200 μl 0,1% kyseliny mravčej (FA), rozdelené na dve časti a potom odsolené pomocou vlastnoručne vyrobených StageTipov. Pomocou ultra vysokoúčinného kvapalinového chromatografu UltiMate 3000 (ultra vysokoúčinný kvapalinový chromatograf UltiMate 3000) bola jedna z dvoch polovíc frakcionovaná na chromatografickej kolóne Acquity s rozmermi 1 mm x 150 mm naplnenej časticami C18 s veľkosťou 130 Å1,7 μm (Waters, katalógové číslo SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific. Peptidy boli separované pri prietoku 30 μl/min, separované od 1% do 50% pufra B počas 85 minút s postupným gradientom 96 minút, od 50% do 95% pufra B počas 3 minút, potom 8 minút pre 95% pufor B; Pufor A je 5 % ACN a 10 mM hydrogenuhličitanu amónneho (ABC) a pufor B je 80 % ACN a 10 mM ABC. Frakcie zbierajte každé 3 minúty a spojte ich do dvoch skupín (1 + 17, 2 + 18 atď.) a vysušte ich vo vákuovej centrifúge.
Analýza LC-MS/MS. Pre hmotnostnú spektrometriu boli peptidy (číslo r119.aq) separované na analytickej kolóne PicoFrit s priemerom 25 cm a vnútorným priemerom 75 μm (nová objektívová šošovka, číslo dielu PF7508250) vybavenej 1,9 μm médiom ReproSil-Pur 120 C18-AQ (Dr. Maisch, mat), použite EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Nemecko). Kolóna bola udržiavaná pri teplote 50 °C. Pufre A a B sú 0,1 % kyselina mravčia vo vode a 0,1 % kyselina mravčia v 80 % ACN. Peptidy boli separované od 6 % do 31 % pufra B počas 65 minút a od 31 % do 50 % pufra B počas 5 minút s gradientom 200 nl/min. Eluované peptidy boli analyzované na hmotnostnom spektrometri Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Meranie m/z peptidového prekurzora sa vykonáva s rozlíšením 120 000 v rozsahu 350 až 1 500 m/z. Použitím 27 % normalizovanej energie zrážky sa na štiepenie pomocou disociácie C pasce s vysokou energiou (HCD) vyberie najsilnejší prekurzor s nábojovým stavom 2 až 6. Čas cyklu je nastavený na 1 s. Hodnota m/z peptidového fragmentu sa merala v iónovej pasci s použitím najmenšieho cieľa AGC 5 × 104 a maximálneho času vstrekovania 86 ms. Po fragmentácii bol prekurzor na 45 sekúnd umiestnený na zoznam dynamického vylúčenia. Peptidy značené TMT boli separované na 50 cm, 75 μm kolóne Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, katalógové číslo 164942) a migračné spektrá boli analyzované na hmotnostnom spektrometri Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) vybavenom zariadením FAIMS (Thermo Fisher Scientific) pracujúcim pri dvoch kompenzačných napätiach −50 a −70 V. Na meranie signálu TMT reportovaných iónov sa používa MS3 vybraný na základe synchronizačného prekurzora. Separácia peptidov sa uskutočnila na prístroji EASY-nLC 1200 s použitím 90 % lineárnej gradientovej elúcie s koncentráciou pufra 6 % až 31 %; pufor A bol 0,1 % FA a pufor B bol 0,1 % FA a 80 % ACN. Analytická kolóna sa prevádzkuje pri teplote 50 °C. Na rozdelenie pôvodného súboru podľa kompenzačného napätia FAIMS sa použije FreeStyle (verzia 1.6, Thermo Fisher Scientific).
Identifikácia a kvantifikácia proteínov. Pomocou integrovaného vyhľadávača Andromeda boli pôvodné dáta analyzované pomocou programu MaxQuant verzie 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Okrem sekvencií Cre rekombinázy a YFP získaných z Aequorea victoria boli spektrá peptidových fragmentov vyhľadávané pre kanonickú sekvenciu a izoformnú sekvenciu myšieho referenčného proteómu (ID proteómu UP000000589, stiahnuté z UniProt v máji 2017). Oxidácia metionínu a N-terminálna acetylácia proteínu boli nastavené ako variabilné modifikácie; metylácia cysteín-karbamoylu bola nastavená ako fixné modifikácie. Parametre štiepenia sú nastavené na „špecificita“ a „trypsín/P“. Minimálny počet peptidov a razor peptidov použitých na identifikáciu proteínu je 1; minimálny počet unikátnych peptidov je 0. Za podmienok porovnávania peptidových máp bola miera identifikácie proteínu 0,01. Možnosť „Druhý peptid“ je povolená. Na prenos úspešných identifikácií medzi rôznymi pôvodnými súbormi použite možnosť „zhoda medzi behmi“. Pre kvantifikáciu bez značenia (LFQ) použite minimálny pomer LFQ s hodnotou 1 (60). Intenzita LFQ sa filtruje pre aspoň dve platné hodnoty v aspoň jednej genotypovej skupine v každom časovom bode a extrapoluje sa z normálneho rozdelenia so šírkou 0,3 a posunom nadol o 1,8. Na analýzu výsledkov LFQ použite výpočtovú platformu Perseus (https://maxquant.net/perseus/) a R (https://r-project.org/). Na analýzu diferenciálnej expresie sa použil obojsmerný stredne silný t-test zo softvérového balíka limma (61). Exploratívna analýza údajov sa vykonala pomocou ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally a pheatmap. Proteomické údaje založené na TMT sa analyzovali pomocou MaxQuant verzie 1.6.10.43. Vyhľadajte nespracované proteomické údaje z databázy ľudskej proteomiky UniProt, ktorá bola stiahnutá v septembri 2018. Analýza zahŕňa korekčný faktor izotopovej čistoty poskytnutý výrobcom. Na analýzu diferenciálnych výrazov použite limma v jazyku R. Pôvodné dáta, výsledky vyhľadávania v databáze a pracovný postup a výsledky analýzy dát sú uložené v aliancii ProteomeXchange prostredníctvom partnerského repozitára PRIDE s identifikátorom dátovej sady PXD019690.
Funkčné anotácie obohacujú analýzu. Na určenie bohatosti termínov funkčných anotácií v súbore údajov po 8 týždňoch bol použitý nástroj Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) (obrázok 1). Stručne povedané, kvantitatívny zoznam proteínov získaný z analýzy údajov LC-MS/MS (tandemová hmotnostná spektrometria) sa používa s nasledujúcimi kritériami filtrovania: Ako druh a pozadie je vybraný Mus musculus a kategória zobrazuje hodnotu P upravenú Benjaminim pre obohatenie 0,05 alebo nižšie, ktorá sa považuje za významnú. V tomto grafe je zobrazených päť najvyšších nadbytočných kategórií v každom klastri na základe upravenej hodnoty P. Pomocou viacnásobného t-testu, s použitím dvojstupňového lineárneho boost programu podľa Benjaminiho, Kriegera a Yekutieliho (Q = 5 %), sa vykonáva analýza expresie proteínov v čase na dôležitých kandidátoch identifikovaných v každej kategórii a každý riadok sa analyzuje samostatne. Nie je potrebné používať konzistentnú štandardnú odchýlku.
Aby sme porovnali výsledky tejto štúdie s publikovanými databázami a vytvorili Vennov diagram na obrázku 1, skombinovali sme kvantitatívny zoznam proteínov s anotáciami MitoCarta 2.0 (24). Na vytvorenie diagramu sme použili online nástroj Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Podrobné informácie o štatistických postupoch použitých pri proteomickej analýze nájdete v príslušnej časti Materiály a metódy. Pre všetky ostatné experimenty nájdete podrobné informácie v príslušnej legende. Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM a všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou softvéru GraphPad Prism 8.1.2.
Doplňujúce materiály k tomuto článku nájdete na stránke http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný podľa podmienok licencie Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ktorá umožňuje použitie, distribúciu a reprodukciu v akomkoľvek médiu, pokiaľ konečné použitie nie je na komerčný zisk a predpokladom je, že pôvodné dielo je správne. Zdroj.
Poznámka: Žiadame vás o poskytnutie vašej e-mailovej adresy iba preto, aby osoba, ktorú odporúčate stránke, vedela, že chcete, aby videla daný e-mail a že nejde o spam. Nebudeme zaznamenávať žiadne e-mailové adresy.
Táto otázka sa používa na overenie, či ste návštevník, a na zabránenie automatického odosielania spamu.
Autori E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomická analýza dysfunkčných neurónov odhalila, že metabolické programy sú aktivované, aby pôsobili proti neurodegenerácii.
Autori E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomická analýza dysfunkčných neurónov odhalila, že metabolické programy sú aktivované, aby pôsobili proti neurodegenerácii.
©2020 American Association for the Advancement of Science. všetky práva vyhradené. AAAS je partnerom HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.