Článok je súčasťou výskumnej témy „Pokročilé bioremediačné technológie a procesy recyklácie syntetických organických zlúčenín (SOC). Zobraziť všetkých 14 článkov
Nízkomolekulárne polycyklické aromatické uhľovodíky (PAU), ako je naftalén a substituované naftalény (metylnaftalén, kyselina naftoová, 1-naftyl-N-metylkarbamát atď.), sa široko používajú v rôznych priemyselných odvetviach a sú genotoxické, mutagénne a/alebo karcinogénne pre organizmy. Tieto syntetické organické zlúčeniny (SOC) alebo xenobiotiká sa považujú za prioritné znečisťujúce látky a predstavujú vážnu hrozbu pre globálne životné prostredie a verejné zdravie. Intenzita ľudských činností (napr. splyňovanie uhlia, rafinácia ropy, emisie z vozidiel a poľnohospodárske aplikácie) určuje koncentráciu, osud a transport týchto všadeprítomných a perzistentných zlúčenín. Okrem fyzikálnych a chemických metód úpravy/odstraňovania sa ako bezpečná, nákladovo efektívna a sľubná alternatíva objavili aj zelené a ekologické technológie, ako je bioremediácia, ktoré využívajú mikroorganizmy schopné úplne degradovať POC alebo ich premeniť na netoxické vedľajšie produkty. Rôzne bakteriálne druhy patriace do kmeňa Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia a Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus a Paenibacillus) a Actinobacteria (Rhodococcus a Arthrobacter) v pôdnej mikrobiote preukázali schopnosť degradovať rôzne organické zlúčeniny. Metabolické štúdie, genomika a metagenomická analýza nám pomáhajú pochopiť katabolickú komplexnosť a rozmanitosť prítomnú v týchto jednoduchých formách života, ktoré možno ďalej využiť na efektívnu biodegradáciu. Dlhodobá existencia PAH viedla k vzniku nových degradačných fenotypov prostredníctvom horizontálneho prenosu génov s použitím genetických prvkov, ako sú plazmidy, transpozóny, bakteriofágy, genomické ostrovčeky a integračné konjugačné prvky. Systémová biológia a genetické inžinierstvo špecifických izolátov alebo modelových spoločenstiev (konzorcií) môžu umožniť komplexnú, rýchlu a efektívnu bioremediáciu týchto PAH prostredníctvom synergických účinkov. V tejto recenzii sa zameriavame na rôzne metabolické dráhy a diverzitu, genetické zloženie a diverzitu a bunkové reakcie/adaptácie baktérií degradujúcich naftalény a substituované naftalény. To poskytne ekologické informácie pre terénne aplikácie a optimalizáciu kmeňov pre efektívnu bioremediáciu.
Rýchly rozvoj priemyselných odvetví (petrochemický, poľnohospodársky, farmaceutický, textilný farbivý, kozmetický atď.) prispel ku globálnej ekonomickej prosperite a zlepšeniu životnej úrovne. Tento exponenciálny rozvoj viedol k produkcii veľkého množstva syntetických organických zlúčenín (SOC), ktoré sa používajú na výrobu rôznych produktov. Medzi tieto cudzie zlúčeniny alebo SOC patria polycyklické aromatické uhľovodíky (PAH), pesticídy, herbicídy, zmäkčovadlá, farbivá, liečivá, organofosfáty, spomaľovače horenia, prchavé organické rozpúšťadlá atď. Sú emitované do atmosféry, vodných a suchozemských ekosystémov, kde majú viacrozmerný vplyv a spôsobujú škodlivé účinky na rôzne bioformy prostredníctvom zmeny fyzikálno-chemických vlastností a štruktúry spoločenstiev (Petrie a kol., 2015; Bernhardt a kol., 2017; Sarkar a kol., 2020). Mnohé aromatické znečisťujúce látky majú silný a deštruktívny vplyv na mnohé neporušené ekosystémy/ostrovy biodiverzity (napr. koralové útesy, arktické/antarktické ľadové štíty, vysokohorské jazerá, hlbokomorské sedimenty atď.) (Jones 2010; Beyer a kol. 2020; Nordborg a kol. 2020). Nedávne geomikrobiologické štúdie ukázali, že ukladanie syntetických organických látok (napr. aromatických znečisťujúcich látok) a ich derivátov na povrchoch umelých konštrukcií (zastavané prostredie) (napr. lokality kultúrneho dedičstva a pamiatky zo žuly, kameňa, dreva a kovu) urýchľuje ich degradáciu (Gadd 2017; Liu a kol. 2018). Ľudské činnosti môžu zintenzívniť a zhoršiť biologickú degradáciu pamiatok a budov prostredníctvom znečistenia ovzdušia a klimatických zmien (Liu a kol. 2020). Tieto organické kontaminanty reagujú s vodnou parou v atmosfére a usadzujú sa na konštrukcii, čo spôsobuje fyzikálnu a chemickú degradáciu materiálu. Biodegradácia je všeobecne uznávaná ako nežiaduce zmeny vzhľadu a vlastností materiálov spôsobené živými organizmami, ktoré ovplyvňujú ich zachovanie (Pochon a Jaton, 1967). Ďalšie mikrobiálne pôsobenie (metabolizmus) týchto zlúčenín môže znížiť štrukturálnu integritu, účinnosť ochrany a kultúrnu hodnotu (Gadd, 2017; Liu a kol., 2018). Na druhej strane sa v niektorých prípadoch zistilo, že mikrobiálna adaptácia a reakcia na tieto štruktúry sú prospešné, pretože vytvárajú biofilmy a iné ochranné kôry, ktoré znižujú rýchlosť rozkladu/rozkladu (Martino, 2016). Preto si vývoj účinných dlhodobých stratégií udržateľnej ochrany kamenných, kovových a drevených pamiatok vyžaduje dôkladné pochopenie kľúčových procesov, ktoré sa v tomto procese podieľajú. V porovnaní s prírodnými procesmi (geologické procesy, lesné požiare, sopečné erupcie, rastlinné a bakteriálne reakcie) ľudské činnosti vedú k uvoľňovaniu veľkých objemov polycyklických aromatických uhľovodíkov (PAH) a iného organického uhlíka (OC) do ekosystémov. Mnohé PAU používané v poľnohospodárstve (insekticídy a pesticídy ako DDT, atrazín, karbaryl, pentachlórfenol atď.), priemysle (ropa, ropné kaly/odpady, plasty získané z ropy, PCB, zmäkčovadlá, detergenty, dezinfekčné prostriedky, fumiganty, vône a konzervačné látky), výrobkoch osobnej starostlivosti (opaľovacie krémy, dezinfekčné prostriedky, repelenty proti hmyzu a polycyklické pižmá) a munícii (výbušniny ako 2,4,6-TNT) sú potenciálne xenobiotiká, ktoré môžu mať vplyv na zdravie planéty (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna a Phale, 2008; Petrie a kol., 2015). Tento zoznam je možné rozšíriť o zlúčeniny získané z ropy (vykurovacie oleje, mazivá, asfaltény), bioplasty s vysokou molekulovou hmotnosťou a iónové kvapaliny (Amde a kol., 2015). Tabuľka 1 uvádza rôzne aromatické znečisťujúce látky a ich použitie v rôznych odvetviach. V posledných rokoch sa začali zvyšovať antropogénne emisie prchavých organických zlúčenín, ako aj oxidu uhličitého a iných skleníkových plynov (Dvorak a kol., 2017). Antropogénne vplyvy však výrazne prevyšujú tie prirodzené. Okrem toho sme zistili, že v mnohých environmentálnych prostrediach pretrváva množstvo prchavých organických zlúčenín, ktoré boli identifikované ako nové znečisťujúce látky s nepriaznivými účinkami na biómy (obrázok 1). Environmentálne agentúry, ako napríklad Agentúra na ochranu životného prostredia Spojených štátov (USEPA), zaradili mnohé z týchto znečisťujúcich látok do svojho zoznamu priorít kvôli ich cytotoxickým, genotoxickým, mutagénnym a karcinogénnym vlastnostiam. Preto sú potrebné prísne predpisy o likvidácii a účinné stratégie na spracovanie/odstraňovanie odpadu z kontaminovaných ekosystémov. Rôzne fyzikálne a chemické metódy spracovania, ako je pyrolýza, oxidačné tepelné spracovanie, prevzdušňovanie vzduchu, skládkovanie, spaľovanie atď., sú neúčinné a nákladné a vytvárajú korozívne, toxické a ťažko spracovateľné vedľajšie produkty. S rastúcim globálnym environmentálnym povedomím priťahujú mikroorganizmy schopné degradovať tieto znečisťujúce látky a ich deriváty (ako sú halogénované, nitro, alkylové a/alebo metylové) čoraz väčšiu pozornosť (Fennell a kol., 2004; Haritash a Kaushik, 2009; Phale a kol., 2020; Sarkar a kol., 2020; Schwanemann a kol., 2020). Použitie týchto pôvodných kandidátskych mikroorganizmov samostatne alebo v zmiešaných kultúrach (kolóniách) na odstraňovanie aromatických znečisťujúcich látok má výhody z hľadiska environmentálnej bezpečnosti, nákladov, účinnosti, účinnosti a udržateľnosti. Výskumníci tiež skúmajú integráciu mikrobiálnych procesov s elektrochemickými redoxnými metódami, konkrétne bioelektrochemickými systémami (BES), ako sľubnú technológiu na čistenie/odstraňovanie znečisťujúcich látok (Huang a kol., 2011). Technológia BES priťahuje čoraz väčšiu pozornosť vďaka svojej vysokej účinnosti, nízkym nákladom, environmentálnej bezpečnosti, prevádzke pri izbovej teplote, biokompatibilným materiálom a schopnosti získavať cenné vedľajšie produkty (napr. elektrinu, palivo a chemikálie) (Pant a kol., 2012; Nazari a kol., 2020). Príchod vysokokapacitného sekvenovania genómu a omických nástrojov/metód poskytol množstvo nových informácií o genetickej regulácii, proteomike a fluxomike reakcií rôznych degradačných mikroorganizmov. Kombinácia týchto nástrojov so systémovou biológiou ďalej prehĺbila naše chápanie výberu a doladenia cieľových katabolických dráh v mikroorganizmoch (t. j. metabolického dizajnu) s cieľom dosiahnuť efektívnu a účinnú biodegradáciu. Na navrhnutie účinných stratégií bioremediacie s použitím vhodných kandidátskych mikroorganizmov musíme pochopiť biochemický potenciál, metabolickú diverzitu, genetické zloženie a ekológiu (autoekológia/synekológia) mikroorganizmov.
Obr. 1. Zdroje a dráhy nízkomolekulárnych PAH cez rôzne prostredia a rôzne faktory ovplyvňujúce biotu. Prerušované čiary predstavujú interakcie medzi prvkami ekosystému.
V tejto recenzii sme sa pokúsili zhrnúť údaje o degradácii jednoduchých PAH, ako je naftalén a substituované naftalény, rôznymi bakteriálnymi izolátmi, pričom sme sa zamerali na metabolické dráhy a diverzitu, enzýmy zapojené do degradácie, zloženie/obsah a diverzitu génov, bunkové reakcie a rôzne aspekty bioremediácie. Pochopenie biochemických a molekulárnych úrovní pomôže pri identifikácii vhodných hostiteľských kmeňov a ich ďalšom genetickom inžinierstve pre účinnú bioremediáciu takýchto prioritných znečisťujúcich látok. To pomôže pri vývoji stratégií pre vytvorenie lokálne špecifických bakteriálnych konzorcií pre účinnú bioremediáciu.
Prítomnosť veľkého počtu toxických a nebezpečných aromatických zlúčenín (spĺňajúcich Huckelovo pravidlo 4n + 2π elektróny, n = 1, 2, 3, …) predstavuje vážnu hrozbu pre rôzne environmentálne médiá, ako je vzduch, pôda, sedimenty a povrchové a podzemné vody (Puglisi a kol., 2007). Tieto zlúčeniny majú jednoduché benzénové kruhy (monocyklické) alebo viacnásobné benzénové kruhy (polycyklické) usporiadané lineárne, uhlovo alebo zhlukovo a vykazujú stabilitu (stabilita/nestabilita) v prostredí vďaka vysokej negatívnej rezonančnej energii a inertnosti (inertnosti), čo možno vysvetliť ich hydrofóbnosťou a redukovaným stavom. Keď je aromatický kruh ďalej nahradený metylovými (-CH3), karboxylovými (-COOH), hydroxylovými (-OH) alebo sulfonátovými (-HSO3) skupinami, stáva sa stabilnejším, má silnejšiu afinitu k makromolekulám a je bioakumulatívny v biologických systémoch (Seo a kol., 2009; Phale a kol., 2020). Niektoré nízkomolekulárne polycyklické aromatické uhľovodíky (LMWAH), ako napríklad naftalén a jeho deriváty [metylnaftalén, kyselina naftoová, naftalénsulfonát a 1-naftyl-N-metylkarbamát (karbaryl)], boli Agentúrou na ochranu životného prostredia USA zaradené do zoznamu prioritných organických znečisťujúcich látok ako genotoxické, mutagénne a/alebo karcinogénne (Cerniglia, 1984). Uvoľňovanie tejto triedy NM-PAH do životného prostredia môže viesť k bioakumulácii týchto zlúčenín na všetkých úrovniach potravinového reťazca, čím ovplyvňuje zdravie ekosystémov (Binkova a kol., 2000; Srogi, 2007; Quinn a kol., 2009).
Zdroje a cesty PAH do bioty sú primárne prostredníctvom migrácie a interakcií medzi rôznymi zložkami ekosystému, ako sú pôda, podzemná voda, povrchová voda, plodiny a atmosféra (Arey a Atkinson, 2003). Obrázok 1 znázorňuje interakcie a distribúciu rôznych PAH s nízkou molekulovou hmotnosťou v ekosystémoch a ich cesty k biote/expozícii človeka. PAH sa ukladajú na povrchoch v dôsledku znečistenia ovzdušia a prostredníctvom migrácie (driftu) emisií z vozidiel, priemyselných výfukových plynov (splyňovanie uhlia, spaľovanie a výroba koksu) a ich ukladania. Priemyselné činnosti, ako je výroba syntetických textílií, farbív a farieb; konzervácia dreva; spracovanie gumy; výroba cementu; výroba pesticídov; a poľnohospodárske aplikácie sú hlavnými zdrojmi PAH v suchozemských a vodných systémoch (Bamforth a Singleton, 2005; Wick a kol., 2011). Štúdie ukázali, že pôdy v prímestských a mestských oblastiach, v blízkosti diaľnic a vo veľkých mestách sú náchylnejšie na polycyklické aromatické uhľovodíky (PAH) v dôsledku emisií z elektrární, vykurovania domácností, zaťaženia ovzdušia a cestnej dopravy a stavebných činností (Suman a kol., 2016). (2008) ukázali, že hladiny PAH v pôde v blízkosti ciest v New Orleans v Louisiane v USA dosahovali až 7189 μg/kg, zatiaľ čo v otvorenom priestore dosahovali iba 2404 μg/kg. Podobne boli v oblastiach v blízkosti lokalít splyňovania uhlia v niekoľkých amerických mestách hlásené hladiny PAH až 300 μg/kg (Kanaly a Harayama, 2000; Bamforth a Singleton, 2005). V pôdach z rôznych indických miest, ako je Dillí (Sharma a kol., 2008), Ágra (Dubey a kol., 2014), Bombaj (Kulkarni a Venkataraman, 2000) a Visakhapatnam (Kulkarni a kol., 2014), sa uvádzajú vysoké koncentrácie PAU. Aromatické zlúčeniny sa ľahšie adsorbujú na pôdne častice, organickú hmotu a ílové minerály, čím sa stávajú hlavnými zachytávačmi uhlíka v ekosystémoch (Srogi, 2007; Peng a kol., 2008). Hlavnými zdrojmi PAU vo vodných ekosystémoch sú zrážky (vlhké/suché zrážky a vodná para), mestský odtok, vypúšťanie odpadových vôd, dopĺňanie podzemných vôd atď. (Srogi, 2007). Odhaduje sa, že približne 80 % PAU v morských ekosystémoch pochádza zo zrážok, sedimentácie a vypúšťania odpadu (Motelay-Massei a kol., 2006; Srogi, 2007). Vyššie koncentrácie PAH v povrchových vodách alebo priesakových vodách zo skládok tuhého odpadu nakoniec prenikajú do podzemných vôd, čo predstavuje vážne ohrozenie verejného zdravia, pretože viac ako 70 % populácie v južnej a juhovýchodnej Ázii pije podzemnú vodu (Duttagupta a kol., 2019). Nedávna štúdia Duttaguptu a kol. (2020) o analýzach riek (32) a podzemných vôd (235) zo Západného Bengálska v Indii zistila, že odhadom 53 % mestských obyvateľov a 44 % vidieckych obyvateľov (spolu 20 miliónov obyvateľov) môže byť vystavených naftalénu (4,9 – 10,6 μg/l) a jeho derivátom. Rozdielne spôsoby využívania pôdy a zvýšená ťažba podzemných vôd sa považujú za hlavné faktory riadiace vertikálny transport (advekciu) PAH s nízkou molekulovou hmotnosťou v podpovrchových vodách. Zistilo sa, že poľnohospodársky odtok, vypúšťanie komunálnych a priemyselných odpadových vôd a vypúšťanie tuhého odpadu/smetia sú ovplyvnené PAH v riečnych povodiach a podzemných sedimentoch. Atmosférické zrážky ďalej zhoršujú znečistenie PAH. Vysoké koncentrácie PAU a ich alkylových derivátov (celkovo 51) boli hlásené v riekach/povodiach po celom svete, ako sú rieky Fraser, Louan, Denso, Missouri, Anacostia, Ebro a Delaware (Yunker a kol., 2002; Motelay-Massei a kol., 2006; Li a kol., 2010; Amoako a kol., 2011; Kim a kol., 2018). V sedimentoch povodia rieky Gangy sa ako najvýznamnejšie zistili naftalén a fenantrén (zistené v 70 % vzoriek) (Duttagupta a kol., 2019). Štúdie navyše ukázali, že chlórovanie pitnej vody môže viesť k tvorbe toxickejších okysličených a chlórovaných PAU (Manoli a Samara, 1999). PAH sa hromadia v obilninách, ovocí a zelenine v dôsledku ich príjmu rastlinami z kontaminovaných pôd, podzemných vôd a zrážok (Fismes a kol., 2002). Mnohé vodné organizmy, ako sú ryby, mušle, škeble a krevety, sú kontaminované PAH konzumáciou kontaminovaných potravín a morskej vody, ako aj cez tkanivá a kožu (Mackay a Fraser, 2000). Metódy varenia/spracovania, ako je grilovanie, pečenie, údenie, vyprážanie, sušenie, pečenie a varenie na drevenom uhlí, môžu tiež viesť k významnému množstvu PAH v potravinách. To do značnej miery závisí od výberu údiarneho materiálu, obsahu fenolických/aromatických uhľovodíkov, postupu varenia, typu ohrievača, obsahu vlhkosti, prívodu kyslíka a teploty spaľovania (Guillén a kol., 2000; Gomes a kol., 2013). Polycyklické aromatické uhľovodíky (PAH) boli tiež zistené v mlieku v rôznych koncentráciách (0,75 – 2,1 mg/l) (Girelli a kol., 2014). Akumulácia týchto PAH v potravinách závisí aj od fyzikálno-chemických vlastností potravín, zatiaľ čo ich toxické účinky súvisia s fyziologickými funkciami, metabolickou aktivitou, absorpciou, distribúciou a rozložením v tele (Mechini a kol., 2011).
Toxicita a škodlivé účinky polycyklických aromatických uhľovodíkov (PAH) sú známe už dlho (Cherniglia, 1984). Nízkomolekulárne polycyklické aromatické uhľovodíky (LMW-PAH) (dva až tri kruhy) sa môžu kovalentne viazať na rôzne makromolekuly, ako sú DNA, RNA a proteíny, a sú karcinogénne (Santarelli a kol., 2008). Vzhľadom na svoju hydrofóbnu povahu sú oddelené lipidovými membránami. U ľudí cytochróm P450 monooxygenázy oxidujú PAH na epoxidy, z ktorých niektoré sú vysoko reaktívne (napr. baediol epoxid) a môžu viesť k transformácii normálnych buniek na malígne (Marston a kol., 2001). Okrem toho sú transformačné produkty PAH, ako sú chinóny, fenoly, epoxidy, dioly atď., toxickejšie ako pôvodné zlúčeniny. Niektoré PAH a ich metabolické medziprodukty môžu ovplyvniť hormóny a rôzne enzýmy v metabolizme, čím nepriaznivo ovplyvňujú rast, centrálny nervový systém, reprodukčný a imunitný systém (Swetha a Phale, 2005; Vamsee-Krishna a kol., 2006; Oostingh a kol., 2008). Bolo hlásené, že krátkodobá expozícia PAH s nízkou molekulovou hmotnosťou spôsobuje zhoršenú funkciu pľúc a trombózu u astmatikov a zvyšuje riziko rakoviny kože, pľúc, močového mechúra a gastrointestinálneho traktu (Olsson a kol., 2010; Diggs a kol., 2011). Štúdie na zvieratách tiež ukázali, že expozícia PAH môže mať nepriaznivé účinky na reprodukčnú funkciu a vývoj a môže spôsobiť kataraktu, poškodenie obličiek a pečene a žltačku. Ukázalo sa, že rôzne produkty biotransformácie PAH, ako sú dioly, epoxidy, chinóny a voľné radikály (katióny), tvoria adukty s DNA. Ukázalo sa, že stabilné adukty menia replikačný mechanizmus DNA, zatiaľ čo nestabilné adukty môžu depurinovať DNA (hlavne na adenín a niekedy na guanín); obe môžu generovať chyby, ktoré vedú k mutáciám (Schweigert a kol. 2001). Okrem toho, chinóny (benzo-/pan-) môžu generovať reaktívne formy kyslíka (ROS), čo spôsobuje fatálne poškodenie DNA a iných makromolekúl, čím ovplyvňuje funkciu/životaschopnosť tkanív (Ewa a Danuta 2017). Bolo hlásené, že chronická expozícia nízkym koncentráciám pyrénu, bifenylu a naftalénu spôsobuje rakovinu u experimentálnych zvierat (Diggs a kol. 2012). Vzhľadom na ich smrteľnú toxicitu je prioritou čistenie/odstránenie týchto PAH z postihnutých/kontaminovaných miest.
Na odstránenie PAH z kontaminovaných miest/prostredí sa používajú rôzne fyzikálne a chemické metódy. Procesy ako spaľovanie, dechlorácia, UV oxidácia, fixácia a extrakcia rozpúšťadlom majú mnoho nevýhod vrátane tvorby toxických vedľajších produktov, zložitosti procesu, bezpečnostných a regulačných problémov, nízkej účinnosti a vysokých nákladov. Mikrobiálna biodegradácia (nazývaná bioremediácia) je však sľubným alternatívnym prístupom, ktorý zahŕňa použitie mikroorganizmov vo forme čistých kultúr alebo kolónií. V porovnaní s fyzikálnymi a chemickými metódami je tento proces šetrný k životnému prostrediu, neinvazívny, nákladovo efektívny a udržateľný. Bioremediácia sa môže vykonávať na postihnutom mieste (in situ) alebo na špeciálne pripravenom mieste (ex situ), a preto sa považuje za udržateľnejšiu metódu sanácie ako tradičné fyzikálne a chemické metódy (Juhasz a Naidu, 2000; Andreoni a Gianfreda, 2007; Megharaj a kol., 2011; Phale a kol., 2020; Sarkar a kol., 2020).
Pochopenie mikrobiálnych metabolických krokov zapojených do degradácie aromatických znečisťujúcich látok má obrovské vedecké a ekonomické dôsledky pre ekologickú a environmentálnu udržateľnosť. Odhaduje sa, že na celom svete sa v sedimentoch a organických zlúčeninách (t. j. ropa, zemný plyn a uhlie, t. j. fosílne palivá) ukladá 2,1 × 1018 gramov uhlíka (C), čo významne prispieva ku globálnemu uhlíkovému cyklu. Rýchla industrializácia, ťažba fosílnych palív a ľudské činnosti však tieto litosférické zásobárne uhlíka vyčerpávajú a ročne uvoľňujú do atmosféry odhadom 5,5 × 1015 g organického uhlíka (ako znečisťujúcich látok) (Gonzalez-Gaya a kol., 2019). Väčšina tohto organického uhlíka vstupuje do suchozemských a morských ekosystémov sedimentáciou, transportom a odtokom. Okrem toho nové syntetické znečisťujúce látky odvodené z fosílnych palív, ako sú plasty, zmäkčovadlá a stabilizátory plastov (ftaláty a ich izoméry), vážne znečisťujú morské, pôdne a vodné ekosystémy a ich biotu, čím zhoršujú globálne klimatické riziká. V Tichom oceáne medzi Severnou Amerikou a juhovýchodnou Áziou sa nahromadili rôzne druhy mikroplastov, nanoplastov, fragmentov plastov a ich toxických monomérnych produktov odvodených z polyetyléntereftalátu (PET), ktoré vytvorili „Veľkú tichomorskú odpadkovú škvrnu“ a poškodili morský život (Newell a kol., 2020). Vedecké štúdie preukázali, že takéto znečisťujúce látky/odpad nie je možné odstrániť žiadnymi fyzikálnymi ani chemickými metódami. V tejto súvislosti sú najužitočnejšie mikroorganizmy tie, ktoré sú schopné oxidatívne metabolizovať znečisťujúce látky na oxid uhličitý, chemickú energiu a iné netoxické vedľajšie produkty, ktoré nakoniec vstupujú do iných procesov kolobehu živín (H, O, N, S, P, Fe atď.). Preto je pochopenie mikrobiálnej ekofyziológie mineralizácie aromatických znečisťujúcich látok a jej environmentálnej kontroly kľúčové pre posúdenie mikrobiálneho uhlíkového cyklu, čistého uhlíkového rozpočtu a budúcich klimatických rizík. Vzhľadom na naliehavú potrebu odstrániť takéto zlúčeniny z prostredia sa objavili rôzne ekologické odvetvia zamerané na čisté technológie. Alternatívne sa zhodnocovanie priemyselného odpadu/odpadových chemikálií nahromadených v ekosystémoch (t. j. prístup „z odpadu k bohatstvu“) považuje za jeden z pilierov obehového hospodárstva a cieľov trvalo udržateľného rozvoja (Close a kol., 2012). Preto je pochopenie metabolických, enzymatických a genetických aspektov týchto potenciálnych kandidátov na degradáciu mimoriadne dôležité pre účinné odstránenie a bioremediáciu takýchto aromatických znečisťujúcich látok.
Spomedzi mnohých aromatických znečisťujúcich látok venujeme osobitnú pozornosť nízkomolekulárnym PAH, ako je naftalén a substituované naftalény. Tieto zlúčeniny sú hlavnými zložkami palív získaných z ropy, textilných farbív, spotrebného tovaru, pesticídov (naftalín a repelenty proti hmyzu), zmäkčovadiel a trieslovín, a preto sú rozšírené v mnohých ekosystémoch (Preuss a kol., 2003). Nedávne správy zdôrazňujú akumuláciu koncentrácií naftalénu v sedimentoch zvodnenej vrstvy, podzemnej vode a podpovrchových pôdach, vadóznych zónach a riečnych dnach, čo naznačuje jeho bioakumuláciu v životnom prostredí (Duttagupta a kol., 2019, 2020). Tabuľka 2 sumarizuje fyzikálno-chemické vlastnosti, aplikácie a zdravotné účinky naftalénu a jeho derivátov. V porovnaní s inými PAH s vysokou molekulovou hmotnosťou sú naftalén a jeho deriváty menej hydrofóbne, viac rozpustné vo vode a široko rozšírené v ekosystémoch, preto sa často používajú ako modelové substráty na štúdium metabolizmu, genetiky a metabolickej diverzity PAH. Veľké množstvo mikroorganizmov je schopných metabolizovať naftalén a jeho deriváty a sú k dispozícii komplexné informácie o ich metabolických dráhach, enzýmoch a regulačných vlastnostiach (Mallick a kol., 2011; Phale a kol., 2019, 2020). Okrem toho sú naftalén a jeho deriváty označené ako prototypové zlúčeniny na hodnotenie znečistenia životného prostredia kvôli ich vysokej hojnosti a biologickej dostupnosti. Agentúra na ochranu životného prostredia USA odhaduje, že priemerné hladiny naftalénu sú 5,19 μg na meter kubický z cigaretového dymu, predovšetkým z nedokonalého spaľovania, a 7,8 až 46 μg z vedľajšieho prúdu dymu, zatiaľ čo expozícia kreozotu a naftalénu je 100 až 10 000-krát vyššia (Preuss a kol. 2003). Zistilo sa, že najmä naftalén má druhovo, regionálne a pohlavne špecifickú respiračnú toxicitu a karcinogénnosť. Na základe štúdií na zvieratách Medzinárodná agentúra pre výskum rakoviny (IARC) klasifikovala naftalén ako „možný ľudský karcinogén“ (skupina 2B)1. Expozícia substituovaným naftalénom, predovšetkým inhaláciou alebo parenterálnym (orálnym) podaním, spôsobuje poškodenie pľúcneho tkaniva a zvyšuje výskyt pľúcnych nádorov u potkanov a myší (Národný toxikologický program 2). Medzi akútne účinky patrí nevoľnosť, vracanie, bolesti brucha, hnačka, bolesti hlavy, zmätenosť, nadmerné potenie, horúčka, tachykardia atď. Na druhej strane, širokospektrálny karbamátový insekticíd karbaryl (1-naftyl N-metylkarbamát) bol hlásený ako toxický pre vodné bezstavovce, obojživelníky, včely medonosné a ľudí a preukázalo sa, že inhibuje acetylcholínesterázu, čo spôsobuje paralýzu (Smulders a kol., 2003; Bulen a Distel, 2011). Preto je pochopenie mechanizmov mikrobiálnej degradácie, genetickej regulácie, enzymatických a bunkových reakcií kľúčové pre vývoj stratégií bioremediacie v kontaminovanom prostredí.
Tabuľka 2. Podrobné informácie o fyzikálno-chemických vlastnostiach, použití, metódach identifikácie a súvisiacich ochoreniach naftalénu a jeho derivátov.
V znečistených výklenkoch môžu hydrofóbne a lipofilné aromatické polutanty spôsobiť rôzne bunkové účinky na environmentálny mikrobióm (spoločenstvo), ako sú zmeny v fluidite membrány, permeabilite membrány, opuch lipidovej dvojvrstvy, narušenie prenosu energie (elektrónový transportný reťazec/protónová hybná sila) a aktivita membránovo asociovaných proteínov (Sikkema a kol., 1995). Okrem toho niektoré rozpustné medziprodukty, ako sú katecholy a chinóny, generujú reaktívne formy kyslíka (ROS) a tvoria adukty s DNA a proteínmi (Penning a kol., 1999). Množstvo takýchto zlúčenín v ekosystémoch teda vyvíja selektívny tlak na mikrobiálne spoločenstvá, aby sa stali účinnými degradátormi na rôznych fyziologických úrovniach, vrátane príjmu/transportu, intracelulárnej transformácie, asimilácie/využitia a kompartmentalizácie.
Vyhľadávanie v projekte Ribosomal Database Project-II (RDP-II) odhalilo, že z médií alebo obohacovacích kultúr kontaminovaných naftalénom alebo jeho derivátmi bolo izolovaných celkovo 926 bakteriálnych druhov. Skupina Proteobacteria mala najvyšší počet zástupcov (n = 755), nasledovali Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) a neklasifikované baktérie (8) (obrázok 2). Zástupcovia γ-Proteobacteria (Pseudomonadales a Xanthomonadales) dominovali vo všetkých gramnegatívnych skupinách s vysokým obsahom G+C (54 %), zatiaľ čo Clostridiales a Bacillales (30 %) boli grampozitívne skupiny s nízkym obsahom G+C. Uvádza sa, že Pseudomonas (najvyšší počet, 338 druhov) sú schopné degradovať naftalén a jeho metylové deriváty v rôznych znečistených ekosystémoch (uhoľný decht, ropa, ropa, kaly, ropné škvrny, odpadová voda, organický odpad a skládky), ako aj v neporušených ekosystémoch (pôda, rieky, sedimenty a podzemná voda) (obrázok 2). Okrem toho štúdie obohatenia a metagenomická analýza niektorých z týchto oblastí odhalili, že nekultivované druhy Legionella a Clostridium môžu mať degradačnú kapacitu, čo naznačuje potrebu kultivácie týchto baktérií s cieľom študovať nové dráhy a metabolickú diverzitu.
Obr. 2. Taxonomická diverzita a ekologické rozšírenie bakteriálnych zástupcov v prostrediach kontaminovaných naftalénom a derivátmi naftalénu.
Spomedzi rôznych mikroorganizmov degradujúcich aromatické uhľovodíky je väčšina schopná degradovať naftalén ako jediný zdroj uhlíka a energie. Postupnosť udalostí zapojených do metabolizmu naftalénu bola opísaná pre Pseudomonas sp. (kmene: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 a CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 a ďalšie kmene (ND6 a AS1) (Mahajan a kol., 1994; Resnick a kol., 1996; Annweiler a kol., 2000; Basu a kol., 2003; Dennis a Zylstra, 2004; Sota a kol., 2006; Metabolizmus je iniciovaný viaczložkovou dioxygenázou [naftalén dioxygenáza (NDO), dioxygenáza hydroxylujúca kruh], ktorá katalyzuje oxidáciu jedného z aromatických kruhov naftalénu s použitím molekulárneho kyslíka ako druhého substrátu, čím sa naftalén premieňa na cis-naftaléndiol (obrázok 3). Cis-dihydrodiol sa premieňa na 1,2-dihydroxynaftalén dehydrogenázou. Kruh štiepiaca enzým Dioxygenáza, 1,2-dihydroxynaftaléndioxygenáza (12DHNDO), premieňa 1,2-dihydroxynaftalénu na kyselinu 2-hydroxychromén-2-karboxylovú. Enzymatická cis-trans izomerizácia produkuje trans-o-hydroxybenzylidénpyruvát, ktorý je štiepený hydratázovou aldolázou na salicylový aldehyd a pyruvát. Organická kyselina pyruvát bola prvou zlúčeninou C3 odvodenou z uhlíkového skeletu naftalénu a smerovanou do centrálnej uhlíkovej dráhy. Okrem toho NAD+-dependentná salicylaldehyddehydrogenáza premieňa salicylaldehyd na kyselinu salicylovú. Metabolizmus v tomto štádiu sa nazýva „horná dráha“ degradácie naftalénu. Táto dráha je veľmi bežná u väčšiny baktérií degradujúcich naftalén. Existuje však niekoľko výnimiek; napríklad u termofilného Bacillus hamburgii 2 je degradácia naftalénu iniciovaná naftalén-2,3-dioxygenázou za vzniku... 2,3-dihydroxynaftalén (Annweiler a kol., 2000).
Obrázok 3. Dráhy degradácie naftalénu, metylnaftalénu, kyseliny naftoovej a karbarylu. Zakrúžkované čísla predstavujú enzýmy zodpovedné za postupnú premenu naftalénu a jeho derivátov na následné produkty. 1 – naftalén dioxygenáza (NDO); 2, cis-dihydrodiol dehydrogenáza; 3, 1,2-dihydroxynaftaléndioxygenáza; 4, izomeráza 2-hydroxychromén-2-karboxylovej kyseliny; 5, trans-O-hydroxybenzylidénpyruvát hydratáza aldoláza; 6, salicylaldehyd dehydrogenáza; 7, salicylát 1-hydroxyláza; 8, katechol 2,3-dioxygenáza (C23DO); 9, 2-hydroxymukonát semialdehyd dehydrogenáza; 10, 2-oxopent-4-enoát hydratáza; 11, 4-hydroxy-2-oxopentanoát aldoláza; 12, acetaldehyd dehydrogenáza; 13, katechol-1,2-dioxygenáza (C12DO); 14, mukonátcykloizomeráza; 15, mukonolaktóndelta-izomeráza; 16, β-ketoadipatenollaktónhydroláza; 17, β-ketoadipátsukcinyl-CoA transferáza; 18, β-ketoadipát-CoA tioláza; 19, sukcinyl-CoA: acetyl-CoA sukcinyltransferáza; 20, salicylát-5-hydroxyláza; 21 – gentisát 1,2-dioxygenáza (GDO); 22, maleylpyruvátizomeráza; 23, fumarylpyruváthydroláza; 24, metylnaftalénhydroxyláza (NDO); 25, hydroxymetylnaftaléndehydrogenáza; 26, naftaldehyddehydrogenáza; 27, oxidáza kyseliny 3-formylsalicylovej; 28, hydroxyizoftalátdekarboxyláza; 29, karbarylhydroláza (CH); 30, 1-naftol-2-hydroxyláza.
V závislosti od organizmu a jeho genetickej výbavy sa výsledná kyselina salicylová ďalej metabolizuje buď katecholovou dráhou pomocou salicylát-1-hydroxylázy (S1H), alebo gentisátovou dráhou pomocou salicylát-5-hydroxylázy (S5H) (obrázok 3). Keďže kyselina salicylová je hlavným medziproduktom v metabolizme naftalénu (horná dráha), kroky od kyseliny salicylovej k medziproduktu TCA sa často označujú ako dolná dráha a gény sú organizované do jedného operónu. Je bežné, že gény v operóne hornej dráhy (nah) a operóne dolnej dráhy (sal) sú regulované spoločnými regulačnými faktormi; napríklad NahR a kyselina salicylová pôsobia ako induktory, čo umožňuje obom operónom úplne metabolizovať naftalén (Phale a kol., 2019, 2020).
Okrem toho sa katechol cyklicky štiepi na 2-hydroxymukonát-semialdehyd meta cestou katechol-2,3-dioxygenázou (C23DO) (Yen a kol., 1988) a ďalej sa hydrolyzuje 2-hydroxymukonát-semialdehydhydrolázou za vzniku kyseliny 2-hydroxypent-2,4-diénovej. 2-hydroxypent-2,4-dienoát sa potom premieňa na pyruvát a acetaldehyd hydratázou (2-oxopent-4-enoáthydratáza) a aldolázou (4-hydroxy-2-oxopentanoátaldoláza) a potom vstupuje do centrálnej uhlíkovej dráhy (obrázok 3). Alternatívne sa katechol cyklicky štiepi na cis,cis-mukonát orto cestou katechol-1,2-oxygenázou (C12DO). Mukonátová cykloizomeráza, mukonolaktónová izomeráza a β-ketoadipát-nollaktónová hydroláza premieňajú cis,cis-mukonát na 3-oxoadipát, ktorý vstupuje do centrálnej uhlíkovej dráhy cez sukcinyl-CoA a acetyl-CoA (Nozaki a kol., 1968) (obrázok 3).
V gentisátovej (2,5-dihydroxybenzoátovej) dráhe sa aromatický kruh štiepi gentisát-1,2-dioxygenázou (GDO) za vzniku maleylpyruvátu. Tento produkt sa môže priamo hydrolyzovať na pyruvát a malát alebo sa môže izomerizovať za vzniku fumarylpyruvátu, ktorý sa potom môže hydrolyzovať na pyruvát a fumarát (Larkin a Day, 1986). Voľba alternatívnej dráhy bola pozorovaná u gramnegatívnych aj grampozitívnych baktérií na biochemickej aj genetickej úrovni (Morawski a kol., 1997; Whyte a kol., 1997). Gramnegatívne baktérie (Pseudomonas) uprednostňujú použitie kyseliny salicylovej, ktorá je induktorom metabolizmu naftalénu, a dekarboxylujú ju na katechol pomocou salicylát-1-hydroxylázy (Gibson a Subramanian, 1984). Na druhej strane, v grampozitívnych baktériách (Rhodococcus) salicylát-5-hydroxyláza premieňa kyselinu salicylovú na kyselinu gentisovú, zatiaľ čo kyselina salicylová nemá žiadny indukčný účinok na transkripciu naftalénových génov (Grund a kol., 1992) (obrázok 3).
Bolo hlásené, že druhy ako Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas a Mycobacterium dokážu degradovať monometylnaftalén alebo dimetylnaftalén (Dean-Raymond a Bartha, 1975; Cane a Williams, 1982; Mahajan a kol., 1994; Dutta a kol., 1998; Hedlund a kol., 1999). Spomedzi nich bola dráha degradácie 1-metylnaftalénu a 2-metylnaftalénu u Pseudomonas sp. CSV86 jasne študovaná na biochemickej a enzymatickej úrovni (Mahajan a kol., 1994). 1-metylnaftalén sa metabolizuje dvoma cestami. Najprv sa aromatický kruh hydroxyluje (nesubstituovaný kruh metylnaftalénu) za vzniku cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydro-8-metylnaftalénu, ktorý sa ďalej oxiduje na metylsalicylát a metylkatechol a potom po rozštiepení kruhu vstupuje do centrálnej uhlíkovej dráhy (obrázok 3). Táto dráha sa nazýva „dráha zdroja uhlíka“. V druhej „detoxikačnej dráhe“ môže byť metylová skupina hydroxylovaná pomocou NDO za vzniku 1-hydroxymetylnaftalénu, ktorý sa ďalej oxiduje na kyselinu 1-naftoovú a vylučuje sa do kultivačného média ako slepý produkt. Štúdie ukázali, že kmeň CSV86 nie je schopný rásť na kyseline 1- a 2-naftoovej ako jedinom zdroji uhlíka a energie, čo potvrdzuje jeho detoxikačnú dráhu (Mahajan a kol., 1994; Basu a kol., 2003). V 2-metylnaftaléne sa metylová skupina hydroxyluje hydroxylázou za vzniku 2-hydroxymetylnaftalénu. Okrem toho nesubstituovaný kruh naftalénového kruhu podlieha hydroxylácii kruhu za vzniku dihydrodiolu, ktorý sa v sérii enzýmovo katalyzovaných reakcií oxiduje na 4-hydroxymetylkatechol a vstupuje do centrálnej uhlíkovej dráhy prostredníctvom dráhy štiepenia meta-kruhu. Podobne sa uvádza, že S. paucimobilis 2322 využíva NDO na hydroxyláciu 2-metylnaftalénu, ktorý sa ďalej oxiduje za vzniku metylsalicylátu a metylkatecholu (Dutta a kol., 1998).
Kyseliny naftoové (substituované/nesubstituované) sú vedľajšie produkty detoxikácie/biotransformácie, ktoré vznikajú počas degradácie metylnaftalénu, fenantrénu a antracénu a uvoľňujú sa do použitého kultivačného média. Bolo hlásené, že pôdny izolát Stenotrophomonas maltophilia CSV89 je schopný metabolizovať kyselinu 1-naftoovú ako zdroj uhlíka (Phale a kol., 1995). Metabolizmus začína dihydroxyláciou aromatického kruhu za vzniku 1,2-dihydroxy-8-karboxynaftalénu. Výsledný diol sa oxiduje na katechol prostredníctvom 2-hydroxy-3-karboxybenzylidénpyruvátu, kyseliny 3-formylsalicylovej, kyseliny 2-hydroxyizoftalovej a kyseliny salicylovej a vstupuje do centrálnej uhlíkovej dráhy prostredníctvom dráhy štiepenia meta-kruhu (obrázok 3).
Karbaryl je pesticíd zo skupiny naftylkarbamátov. Od Zelenej revolúcie v Indii v 70. rokoch 20. storočia viedlo používanie chemických hnojív a pesticídov k nárastu emisií polycyklických aromatických uhľovodíkov (PAH) z poľnohospodárskych disperzných zdrojov (Pingali, 2012; Duttagupta a kol., 2020). Odhaduje sa, že 55 % (85 722 000 hektárov) celkovej ornej pôdy v Indii je ošetrených chemickými pesticídmi. Za posledných päť rokov (2015 – 2020) indický poľnohospodársky sektor spotreboval v priemere 55 000 až 60 000 ton pesticídov ročne (Ministerstvo družstiev a blahobytu farmárov, Ministerstvo poľnohospodárstva, Vláda Indie, august 2020). V severných a centrálnych Gangských nížinách (štáty s najvyššou populáciou a hustotou obyvateľstva) je používanie pesticídov na plodinách rozšírené, pričom prevažujú insekticídy. Karbaryl (1-naftyl-N-metylkarbamát) je širokospektrálny, stredne až vysoko toxický karbamátový insekticíd používaný v indickom poľnohospodárstve v priemernom množstve 100 – 110 ton. Bežne sa predáva pod obchodným názvom Sevin a používa sa na kontrolu hmyzu (vošky, mravce ohnivé, blchy, roztoče, pavúky a mnoho ďalších vonkajších škodcov), ktorý postihuje rôzne plodiny (kukurica, sója, bavlna, ovocie a zelenina). Niektoré mikroorganizmy, ako napríklad Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus a Arthrobacter, sa môžu použiť aj na kontrolu iných škodcov. Bolo hlásené, že RC100 môže degradovať karbaryl (Larkin a Day, 1986; Chapalamadugu a Chaudhry, 1991; Hayatsu a kol., 1999; Swetha a Phale, 2005; Trivedi a kol., 2017). Degradačná dráha karbarylu bola rozsiahlo študovaná na biochemickej, enzymatickej a genetickej úrovni v pôdnych izolátoch kmeňov Pseudomonas sp. C4, C5 a C6 (Swetha a Phale, 2005; Trivedi a kol., 2016) (Obr. 3). Metabolická dráha začína hydrolýzou esterovej väzby karbarylhydrolázou (CH) za vzniku 1-naftolu, metylamínu a oxidu uhličitého. 1-naftol sa potom premieňa na 1,2-dihydroxynaftalén 1-naftolhydroxylázou (1-NH), ktorý sa ďalej metabolizuje centrálnou uhlíkovou dráhou cez salicylát a gentisát. Bolo hlásené, že niektoré baktérie degradujúce karbaryl ho metabolizujú na kyselinu salicylovú štiepením katecholového orto kruhu (Larkin a Day, 1986; Chapalamadugu a Chaudhry, 1991). Je pozoruhodné, že baktérie degradujúce naftalén metabolizujú primárne kyselinu salicylovú prostredníctvom katecholu, zatiaľ čo baktérie degradujúce karbaryl uprednostňujú metabolizáciu kyseliny salicylovej gentisátovou dráhou.
Deriváty kyseliny naftalénsulfónovej/disulfónovej a kyseliny naftylamínsulfónovej sa môžu použiť ako medziprodukty pri výrobe azofarbív, zmáčadiel, dispergačných činidiel atď. Hoci tieto zlúčeniny majú nízku toxicitu pre ľudí, hodnotenia cytotoxicity ukázali, že sú smrteľné pre ryby, dafnie a riasy (Greim a kol., 1994). U zástupcov rodu Pseudomonas (kmene A3, C22) sa uvádza, že iniciujú metabolizmus dvojitou hydroxyláciou aromatického kruhu obsahujúceho skupinu sulfónovej kyseliny za vzniku dihydrodiolu, ktorý sa ďalej spontánnym štiepením sulfitovej skupiny premieňa na 1,2-dihydroxynaftalén (Brilon a kol., 1981). Výsledný 1,2-dihydroxynaftalén sa katabolizuje klasickou naftalénovou dráhou, t. j. katecholovou alebo gentisátovou dráhou (obrázok 4). Ukázalo sa, že kyselina aminonaftalénsulfónová a kyselina hydroxynaftalénsulfónová môžu byť úplne degradované zmiešanými bakteriálnymi konzorciami s komplementárnymi katabolickými dráhami (Nortemann a kol., 1986). Ukázalo sa, že jeden člen konzorcia desulfurizuje kyselinu aminonaftalénsulfónovú alebo kyselinu hydroxynaftalénsulfónovú 1,2-dioxygenáciou, zatiaľ čo aminosalicylát alebo hydroxysalicylát sa uvoľňuje do kultivačného média ako slepý metabolit a následne ho prijímajú ostatní členovia konzorcia. Kyselina naftaléndisulfónová je relatívne polárna, ale slabo biologicky odbúrateľná, a preto sa môže metabolizovať rôznymi dráhami. Prvá desulfurizácia prebieha počas regioselektívnej dihydroxylácie aromatického kruhu a skupiny sulfónovej kyseliny; druhá desulfurizácia prebieha počas hydroxylácie kyseliny 5-sulfosalicylovej kyselinou salicylovou 5-hydroxylázou za vzniku kyseliny gentisovej, ktorá vstupuje do centrálnej uhlíkovej dráhy (Brilon a kol., 1981) (obrázok 4). Enzýmy zodpovedné za degradáciu naftalénu sú zodpovedné aj za metabolizmus naftalénsulfonátu (Brilon a kol., 1981; Keck a kol., 2006).
Obrázok 4. Metabolické dráhy degradácie naftalénsulfonátu. Čísla vo vnútri krúžkov predstavujú enzýmy zodpovedné za metabolizmus naftylsulfonátu, podobné/identické s enzýmami opísanými na obr. 3.
Nízkomolekulárne PAH (LMW-PAH) sú redukovateľné, hydrofóbne a zle rozpustné, a preto nie sú náchylné na prirodzený rozklad/degradáciu. Aeróbne mikroorganizmy ich však dokážu oxidovať absorpciou molekulárneho kyslíka (O2). Tieto enzýmy patria prevažne do triedy oxidoreduktáz a môžu vykonávať rôzne reakcie, ako je hydroxylácia aromatického kruhu (mono- alebo dihydroxylácia), dehydrogenácia a štiepenie aromatického kruhu. Produkty získané z týchto reakcií sú vo vyššom oxidačnom stave a ľahšie sa metabolizujú centrálnou uhlíkovou dráhou (Phale a kol., 2020). Uvádza sa, že enzýmy v degradačnej dráhe sú indukovateľné. Aktivita týchto enzýmov je veľmi nízka alebo zanedbateľná, keď sa bunky pestujú na jednoduchých zdrojoch uhlíka, ako je glukóza alebo organické kyseliny. Tabuľka 3 sumarizuje rôzne enzýmy (oxygenázy, hydrolázy, dehydrogenázy, oxidázy atď.) zapojené do metabolizmu naftalénu a jeho derivátov.
Tabuľka 3. Biochemické charakteristiky enzýmov zodpovedných za degradáciu naftalénu a jeho derivátov.
Rádioizotopové štúdie (18O2) ukázali, že zabudovanie molekulárneho O2 do aromatických kruhov oxygenázami je najdôležitejším krokom pri aktivácii ďalšej biodegradácie zlúčeniny (Hayaishi a kol., 1955; Mason a kol., 1955). Zabudovanie jedného atómu kyslíka (O) z molekulárneho kyslíka (O2) do substrátu je iniciované buď endogénnymi, alebo exogénnymi monooxygenázami (nazývanými aj hydroxylázy). Ďalší atóm kyslíka sa redukuje na vodu. Exogénne monooxygenázy redukujú flavín pomocou NADH alebo NADPH, zatiaľ čo v endomonooxygenázach je flavín redukovaný substrátom. Poloha hydroxylácie vedie k diverzite vo tvorbe produktu. Napríklad salicylát-1-hydroxyláza hydroxyluje kyselinu salicylovú v polohe C1 za vzniku katecholu. Na druhej strane, viaczložková salicylát-5-hydroxyláza (obsahujúca podjednotky reduktázy, ferredoxínu a oxygenázy) hydroxyluje kyselinu salicylovú v polohe C5 za vzniku kyseliny gentisovej (Yamamoto a kol., 1965).
Dioxygenázy viažu do substrátu dva atómy O2. V závislosti od vytvorených produktov sa delia na kruhové hydroxylujúce dioxygenázy a kruhové štiepiace dioxygenázy. Kruhové hydroxylujúce dioxygenázy premieňajú aromatické substráty na cis-dihydrodioly (napr. naftalén) a sú rozšírené medzi baktériami. Doteraz sa ukázalo, že organizmy obsahujúce kruhové hydroxylujúce dioxygenázy sú schopné rásť na rôznych aromatických zdrojoch uhlíka a tieto enzýmy sa klasifikujú ako NDO (naftalén), toluén dioxygenáza (TDO, toluén) a bifenyl dioxygenáza (BPDO, bifenyl). NDO aj BPDO môžu katalyzovať dvojitú oxidáciu a hydroxyláciu bočných reťazcov rôznych polycyklických aromatických uhľovodíkov (toluén, nitrotoluén, xylén, etylbenzén, naftalén, bifenyl, fluorén, indol, metylnaftalén, naftalénsulfonát, fenantrén, antracén, acetofenón atď.) (Boyd a Sheldrake, 1998; Phale a kol., 2020). NDO je viaczložkový systém pozostávajúci z oxidoreduktázy, ferredoxínu a oxygenázovej zložky obsahujúcej aktívne miesto (Gibson a Subramanian, 1984; Resnick a kol., 1996). Katalytická jednotka NDO pozostáva z veľkej α podjednotky a malej β podjednotky usporiadaných v konfigurácii α3β3. NDO patrí do veľkej rodiny oxygenáz a jeho α-podjednotka obsahuje Rieskeho miesto [2Fe-2S] a mononukleárny nehemový atóm železa, ktorý určuje substrátovú špecificitu NDO (Parales a kol., 1998). Typicky sa v jednom katalytickom cykle dva elektróny z redukcie pyridínového nukleotidu prenesú na ión Fe(II) v aktívnom mieste prostredníctvom reduktázy, ferredoxínu a Rieskeho miesta. Redukčné ekvivalenty aktivujú molekulárny kyslík, čo je predpokladom pre dihydroxyláciu substrátu (Ferraro a kol., 2005). Doteraz bolo purifikovaných a podrobne charakterizovaných len niekoľko NDO z rôznych kmeňov a genetická kontrola dráh zapojených do degradácie naftalénu bola podrobne študovaná (Resnick a kol., 1996; Parales a kol., 1998; Karlsson a kol., 2003). Dioxygenázy štiepiace kruh (enzýmy štiepiace endo- alebo orto-kruh a enzýmy štiepiace exodiol- alebo meta-kruh) pôsobia na hydroxylované aromatické zlúčeniny. Napríklad dioxygenáza štiepiaca orto-kruh je katechol-1,2-dioxygenáza, zatiaľ čo dioxygenáza štiepiaca meta-kruh je katechol-2,3-dioxygenáza (Kojima a kol., 1961; Nozaki a kol., 1968). Okrem rôznych oxygenáz existujú aj rôzne dehydrogenázy zodpovedné za dehydrogenáciu aromatických dihydrodiolov, alkoholov a aldehydov a využívajúce NAD+/NADP+ ako akceptory elektrónov, čo sú niektoré z dôležitých enzýmov zapojených do metabolizmu (Gibson a Subramanian, 1984; Shaw a Harayama, 1990; Fahle a kol., 2020).
Enzýmy ako hydrolázy (esterázy, amidázy) sú druhou dôležitou triedou enzýmov, ktoré používajú vodu na štiepenie kovalentných väzieb a vykazujú širokú substrátovú špecificitu. Karbarylhydroláza a iné hydrolázy sa považujú za zložky periplazmy (transmembrány) u gramnegatívnych baktérií (Kamini a kol., 2018). Karbaryl má amidovú aj esterovú väzbu; preto ho môže hydrolyzovať buď esteráza, alebo amidáza za vzniku 1-naftolu. Bolo hlásené, že karbaryl v kmeni Rhizobium rhizobium AC10023 a kmeni Arthrobacter RC100 funguje ako esteráza, respektíve amidáza. Karbaryl v kmeni Arthrobacter RC100 funguje aj ako amidáza. Bolo preukázané, že RC100 hydrolyzuje štyri insekticídy triedy N-metylkarbamátov, ako sú karbaryl, metomyl, kyselina mefenámová a XMC (Hayaatsu a kol., 2001). Bolo hlásené, že CH v Pseudomonas sp. C5pp môže pôsobiť na karbaryl (100 % aktivita) a 1-naftylacetát (36 % aktivita), ale nie na 1-naftylacetamid, čo naznačuje, že ide o esterázu (Trivedi a kol., 2016).
Biochemické štúdie, vzorce regulácie enzýmov a genetická analýza ukázali, že gény degradácie naftalénu pozostávajú z dvoch indukovateľných regulačných jednotiek alebo „operónov“: nah („upstream dráha“, premieňajúca naftalén na kyselinu salicylovú) a sal („downstream dráha“, premieňajúca kyselinu salicylovú na centrálnu uhlíkovú dráhu prostredníctvom katecholu). Kyselina salicylová a jej analógy môžu pôsobiť ako induktory (Shamsuzzaman a Barnsley, 1974). V prítomnosti glukózy alebo organických kyselín je operón potlačený. Obrázok 5 zobrazuje kompletnú genetickú organizáciu degradácie naftalénu (vo forme operónu). Bolo opísaných niekoľko pomenovaných variantov/foriem génu nah (ndo/pah/dox) a zistilo sa, že majú vysokú sekvenčnú homológiu (90 %) medzi všetkými druhmi Pseudomonas (Abbasian a kol., 2016). Gény upstream dráhy naftalénu boli vo všeobecnosti usporiadané v konsenzuálnom poradí, ako je znázornené na obrázku 5A. Ďalší gén, nahQ, bol tiež hlásený ako zapojený do metabolizmu naftalénu a zvyčajne sa nachádzal medzi nahC a nahE, ale jeho skutočná funkcia si vyžaduje objasnenie. Podobne sa gén nahY, zodpovedný za chemotaxiu citlivú na naftalén, u niektorých členov našiel na distálnom konci nah operónu. U Ralstonia sp. sa zistilo, že gén U2 kódujúci glutatión S-transferázu (gsh) sa nachádza medzi nahAa a nahAb, ale neovplyvňuje charakteristiky využitia naftalénu (Zylstra a kol., 1997).
Obrázok 5. Genetická organizácia a diverzita pozorovaná počas degradácie naftalénu medzi bakteriálnymi druhmi; (A) Horná naftalénová dráha, metabolizmus naftalénu na kyselinu salicylovú; (B) Dolná naftalénová dráha, kyselina salicylová cez katechol do centrálnej uhlíkovej dráhy; (C) kyselina salicylová cez gentisát do centrálnej uhlíkovej dráhy.
„Nižšia dráha“ (sal operón) typicky pozostáva z nahGTHINLMOKJ a premieňa salicylát na pyruvát a acetaldehyd prostredníctvom dráhy štiepenia katechol metaringu. Zistilo sa, že gén nahG (kódujúci salicyláthydroxylázu) je konzervovaný na proximálnom konci operónu (obr. 5B). V porovnaní s inými kmeňmi degradujúcimi naftalén sú v P. putida CSV86 operóny nah a sal tandemové a veľmi blízko príbuzné (približne 7,5 kb). V niektorých gramnegatívnych baktériách, ako sú Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 a P. putida AK5, sa naftalén metabolizuje ako centrálny uhlíkový metabolit prostredníctvom gentisátovej dráhy (vo forme sgp/nag operónu). Génová kazeta je typicky reprezentovaná vo forme nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, kde nagR (kódujúci regulátor typu LysR) sa nachádza na hornom konci (obrázok 5C).
Karbaryl vstupuje do centrálneho uhlíkového cyklu metabolizmom 1-naftolu, 1,2-dihydroxynaftalénu, kyseliny salicylovej a kyseliny gentisovej (obrázok 3). Na základe genetických a metabolických štúdií bolo navrhnuté rozdeliť túto dráhu na „upstream“ (premena karbarylu na kyselinu salicylovú), „strednú“ (premena kyseliny salicylovej na kyselinu gentisovú) a „downstream“ (premena kyseliny gentisovej na medziprodukty centrálnej uhlíkovej dráhy) (Singh a kol., 2013). Genomická analýza C5pp (superkontig A, 76,3 kb) odhalila, že gén mcbACBDEF sa podieľa na premene karbarylu na kyselinu salicylovú, nasledovaný génom mcbIJKL pri premene kyseliny salicylovej na kyselinu gentisovú a mcbOQP pri premene kyseliny gentisovej na medziprodukty s centrálnym uhlíkom (fumarát a pyruvát, Trivedi a kol., 2016) (obrázok 6).
Bolo hlásené, že enzýmy zapojené do degradácie aromatických uhľovodíkov (vrátane naftalénu a kyseliny salicylovej) môžu byť indukované zodpovedajúcimi zlúčeninami a inhibované jednoduchými zdrojmi uhlíka, ako je glukóza alebo organické kyseliny (Shingler, 2003; Phale a kol., 2019, 2020). Spomedzi rôznych metabolických dráh naftalénu a jeho derivátov boli do určitej miery študované regulačné vlastnosti naftalénu a karbarylu. V prípade naftalénu sú gény v dráhach upstream aj downstream regulované NahR, trans-pôsobiacim pozitívnym regulátorom typu LysR. Je potrebný na indukciu génu nah kyselinou salicylovou a jeho následnú expresiu na vysokej úrovni (Yen a Gunsalus, 1982). Okrem toho štúdie ukázali, že integratívny hostiteľský faktor (IHF) a XylR (sigma 54-dependentný transkripčný regulátor) sú tiež kritické pre transkripčnú aktiváciu génov v metabolizme naftalénu (Ramos a kol., 1997). Štúdie ukázali, že enzýmy dráhy otvárania meta-kruhu katecholu, konkrétne katechol-2,3-dioxygenáza, sú indukované v prítomnosti naftalénu a/alebo kyseliny salicylovej (Basu a kol., 2006). Štúdie ukázali, že enzýmy dráhy otvárania orto-kruhu katecholu, konkrétne katechol-1,2-dioxygenáza, sú indukované v prítomnosti kyseliny benzoovej a cis,cis-mukonátu (Parsek a kol., 1994; Tover a kol., 2001).
V kmeni C5pp kóduje päť génov, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR a mcbS, regulátory patriace do rodiny transkripčných regulátorov LysR/TetR zodpovedných za kontrolu degradácie karbarylu. Zistilo sa, že homológny gén mcbG je najviac príbuzný s regulátorom typu LysR PhnS (58 % identita aminokyselín) zapojeným do metabolizmu fenantrénu u Burkholderia RP00725 (Trivedi a kol., 2016). Zistilo sa, že gén mcbH je zapojený do medziľahlej dráhy (konverzia kyseliny salicylovej na kyselinu gentisovú) a patrí do transkripčného regulátora typu LysR NagR/DntR/NahR u Pseudomonas a Burkholderia. Uvádza sa, že členovia tejto čeľade rozpoznávajú kyselinu salicylovú ako špecifickú efektorovú molekulu pre indukciu degradačných génov. Na druhej strane, v downstream dráhe (metabolity gentizát-centrálnej uhlíkovej dráhy) boli identifikované tri gény, mcbN, mcbR a mcbS, patriace k transkripčným regulátorom typu LysR a TetR.
V prokaryotoch sú horizontálne procesy prenosu génov (získavanie, výmena alebo prenos) prostredníctvom plazmidov, transpozónov, profágov, genómových ostrovčekov a integračných konjugačných elementov (ICE) hlavnými príčinami plasticity v bakteriálnych genómoch, čo vedie k získaniu alebo strate špecifických funkcií/znakov. Umožňuje baktériám rýchlo sa prispôsobiť rôznym podmienkam prostredia, čo poskytuje hostiteľovi potenciálne adaptívne metabolické výhody, ako je degradácia aromatických zlúčenín. Metabolické zmeny sa často dosahujú jemným doladením degradačných operónov, ich regulačných mechanizmov a enzýmových špecifík, čo uľahčuje degradáciu širšej škály aromatických zlúčenín (Nojiri a kol., 2004; Phale a kol., 2019, 2020). Zistilo sa, že génové kazety pre degradáciu naftalénu sa nachádzajú na rôznych mobilných elementoch, ako sú plazmidy (konjugačné a nekonjugačné), transpozóny, genómy, ICE a kombinácie rôznych bakteriálnych druhov (obrázok 5). V Pseudomonas G7 sú nah a sal operóny plazmidu NAH7 transkribované v rovnakej orientácii a sú súčasťou defektného transpozónu, ktorý na mobilizáciu vyžaduje transpozázu Tn4653 (Sota a kol., 2006). V kmeni Pseudomonas NCIB9816-4 bol gén nájdený na konjugatívnom plazmide pDTG1 ako dva operóny (vzdialené od seba približne 15 kb), ktoré boli transkribované v opačných smeroch (Dennis a Zylstra, 2004). V kmeni Pseudomonas putida AK5 kóduje nekonjugačný plazmid pAK5 enzým zodpovedný za degradáciu naftalénu prostredníctvom gentisátovej dráhy (Izmalkova a kol., 2013). V kmeni Pseudomonas PMD-1 sa nah operón nachádza na chromozóme, zatiaľ čo sal operón sa nachádza na konjugatívnom plazmide pMWD-1 (Zuniga a kol., 1981). Avšak v Pseudomonas stutzeri AN10 sú všetky gény degradácie naftalénu (operóny nah a sal) umiestnené na chromozóme a pravdepodobne sú získavané prostredníctvom transpozície, rekombinácie a preskupenia (Bosch a kol., 2000). V Pseudomonas sp. CSV86 sú operóny nah a sal umiestnené v genóme vo forme ICE (ICECSV86). Štruktúra je chránená tRNAGly, po ktorej nasledujú priame opakovania indikujúce miesta rekombinácie/pripojenia (attR a attL) a fágová integráza umiestnená na oboch koncoch tRNAGly, teda štrukturálne podobná elementu ICEclc (ICEclcB13 v Pseudomonas knackmusii pre degradáciu chlórkatecholu). Bolo hlásené, že gény na ICE sa môžu prenášať konjugáciou s extrémne nízkou frekvenciou prenosu (10-8), čím sa degradačné vlastnosti prenášajú na príjemcu (Basu a Phale, 2008; Phale a kol., 2019).
Väčšina génov zodpovedných za degradáciu karbarylu sa nachádza na plazmidoch. Arthrobacter sp. RC100 obsahuje tri plazmidy (pRC1, pRC2 a pRC300), z ktorých dva konjugačné plazmidy, pRC1 a pRC2, kódujú enzýmy, ktoré premieňajú karbaryl na gentisát. Na druhej strane, enzýmy zapojené do premeny gentisátu na centrálne uhlíkové metabolity sa nachádzajú na chromozóme (Hayaatsu a kol., 1999). Baktérie rodu Rhizobium. Kmeň AC100, používaný na premenu karbarylu na 1-naftol, obsahuje plazmid pAC200, ktorý nesie gén cehA kódujúci CH ako súčasť transpozónu Tnceh obklopený sekvenciami podobnými inzerčným elementom (istA a istB) (Hashimoto a kol., 2002). V kmeni Sphingomonas CF06 sa predpokladá, že gén degradujúci karbaryl je prítomný v piatich plazmidoch: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 a pCF05. Homológia DNA týchto plazmidov je vysoká, čo naznačuje existenciu duplikácie génu (Feng a kol., 1997). V symbionte degradujúcom karbaryl zloženom z dvoch druhov Pseudomonas obsahuje kmeň 50581 konjugačný plazmid pCD1 (50 kb) kódujúci gén karbarylhydrolázy mcd, zatiaľ čo konjugačný plazmid v kmeni 50552 kóduje enzým degradujúci 1-naftol (Chapalamadugu a Chaudhry, 1991). V kmeni Achromobacter WM111 sa gén furadánhydrolázy mcd nachádza na 100 kb plazmide (pPDL11). Ukázalo sa, že tento gén je prítomný na rôznych plazmidoch (100, 105, 115 alebo 124 kb) v rôznych baktériách z rôznych geografických oblastí (Parekh a kol., 1995). V Pseudomonas sp. C5pp sa všetky gény zodpovedné za degradáciu karbarylu nachádzajú v genóme s dĺžkou sekvencie 76,3 kb (Trivedi a kol., 2016). Analýza genómu (6,15 Mb) odhalila prítomnosť 42 MGE a 36 GEI, z ktorých 17 MGE sa nachádzalo v superkontige A (76,3 kb) s priemerným asymetrickým obsahom G+C (54 – 60 mol %), čo naznačuje možné horizontálne prenosy génov (Trivedi a kol., 2016). P. putida XWY-1 vykazuje podobné usporiadanie génov degradujúcich karbaryl, ale tieto gény sa nachádzajú na plazmide (Zhu a kol., 2019).
Okrem metabolickej účinnosti na biochemickej a genomickej úrovni vykazujú mikroorganizmy aj ďalšie vlastnosti alebo reakcie, ako je chemotaxia, modifikácia bunkového povrchu, kompartmentalizácia, preferenčné využitie, produkcia biosurfaktantov atď., ktoré im pomáhajú efektívnejšie metabolizovať aromatické znečisťujúce látky v kontaminovanom prostredí (obrázok 7).
Obrázok 7. Rôzne stratégie bunkovej odpovede ideálnych baktérií degradujúcich aromatické uhľovodíky pre efektívnu biodegradáciu cudzích znečisťujúcich zlúčenín.
Chemotaktické reakcie sa považujú za faktory zvyšujúce degradáciu organických polutantov v heterogénne znečistených ekosystémoch. (2002) preukázali, že chemotaxia Pseudomonas sp. G7 na naftalén zvýšila rýchlosť degradácie naftalénu vo vodných systémoch. Kmeň divokého typu G7 degradoval naftalén oveľa rýchlejšie ako mutantný kmeň s deficitom chemotaxie. Zistilo sa, že proteín NahY (538 aminokyselín s membránovou topológiou) je ko-transkribovaný s génmi metaštiepnej dráhy na plazmide NAH7 a podobne ako prevodníky chemotaxie, aj tento proteín zrejme funguje ako chemoreceptor pre degradáciu naftalénu (Grimm a Harwood 1997). Ďalšia štúdia Hansela a kol. (2009) ukázala, že proteín je chemotaktický, ale jeho rýchlosť degradácie je vysoká. (2011) preukázali chemotaktickú reakciu Pseudomonas (P. putida) na plynný naftalén, pričom difúzia v plynnej fáze viedla k stabilnému toku naftalénu do buniek, čo riadilo chemotaktickú reakciu buniek. Výskumníci využili toto chemotaktické správanie na vytvorenie mikróbov, ktoré by zvýšili rýchlosť degradácie. Štúdie ukázali, že chemosenzorické dráhy regulujú aj ďalšie bunkové funkcie, ako je bunkové delenie, regulácia bunkového cyklu a tvorba biofilmu, čím pomáhajú kontrolovať rýchlosť degradácie. Využitie tejto vlastnosti (chemotaxie) na efektívnu degradáciu však brzdí niekoľko úzkych miest. Hlavné prekážky sú: (a) rôzne paralogické receptory rozpoznávajú rovnaké zlúčeniny/ligandy; (b) existencia alternatívnych receptorov, t. j. energetický tropizmus; (c) významné sekvenčné rozdiely v senzorických doménach tej istej rodiny receptorov; a (d) nedostatok informácií o hlavných bakteriálnych senzorových proteínoch (Ortega a kol., 2017; Martin-Mora a kol., 2018). Niekedy biodegradácia aromatických uhľovodíkov produkuje viacero metabolitov/medziproduktov, ktoré môžu byť chemotaktické pre jednu skupinu baktérií, ale odpudivé pre iné, čo proces ďalej komplikuje. Na identifikáciu interakcií ligandov (aromatických uhľovodíkov) s chemickými receptormi sme skonštruovali hybridné senzorové proteíny (PcaY, McfR a NahY) fúziou senzorových a signálnych domén Pseudomonas putida a Escherichia coli, ktoré cielia na receptory aromatických kyselín, medziproduktov TCA a naftalénu (Luu a kol., 2019).
Pod vplyvom naftalénu a iných polycyklických aromatických uhľovodíkov (PAH) dochádza k významným zmenám v štruktúre bakteriálnej membrány a integrite mikroorganizmov. Štúdie ukázali, že naftalén narúša interakciu acylového reťazca prostredníctvom hydrofóbnych interakcií, čím zvyšuje napučiavanie a tekutosť membrány (Sikkema a kol., 1995). Aby sa tento škodlivý účinok vyrovnal, baktérie regulujú tekutosť membrány zmenou pomeru a zloženia mastných kyselín medzi izo/anteizo mastnými kyselinami s rozvetveným reťazcom a izomerizáciou cis-nenasýtených mastných kyselín na zodpovedajúce trans-izoméry (Heipieper a de Bont, 1994). V Pseudomonas stutzeri pestovanej pri pôsobení naftalénu sa pomer nasýtených a nenasýtených mastných kyselín zvýšil z 1,1 na 2,1, zatiaľ čo v Pseudomonas JS150 sa tento pomer zvýšil zo 7,5 na 12,0 (Mrozik a kol., 2004). Pri pestovaní na naftaléne vykazovali bunky Achromobacter KAs 3–5 agregáciu buniek okolo kryštálov naftalénu a pokles povrchového náboja buniek (z -22,5 na -2,5 mV) sprevádzaný cytoplazmatickou kondenzáciou a vakuolizáciou, čo naznačuje zmeny v bunkovej štruktúre a vlastnostiach bunkového povrchu (Mohapatra a kol., 2019). Hoci bunkové/povrchové zmeny priamo súvisia s lepším príjmom aromatických polutantov, relevantné stratégie bioinžinierstva neboli dôkladne optimalizované. Manipulácia s tvarom buniek sa zriedkavo používala na optimalizáciu biologických procesov (Volke a Nikel, 2018). Delécia génov ovplyvňujúcich bunkové delenie spôsobuje zmeny v bunkovej morfológii. Delécia génov ovplyvňujúcich bunkové delenie spôsobuje zmeny v bunkovej morfológii. U Bacillus subtilis sa preukázalo, že proteín bunkovej priehradky SepF sa podieľa na tvorbe priehradky a je potrebný pre následné kroky bunkového delenia, ale nie je to esenciálny gén. Delécia génov kódujúcich peptidové glykánhydrolázy v Bacillus subtilis viedla k predĺženiu buniek, zvýšeniu špecifickej rýchlosti rastu a zlepšeniu kapacity produkcie enzýmov (Cui a kol., 2018).
Na dosiahnutie účinnej degradácie kmeňov Pseudomonas C5pp a C7 bola navrhnutá kompartmentalizácia dráhy degradácie karbarylu (Kamini a kol., 2018). Predpokladá sa, že karbaryl je transportovaný do periplazmatického priestoru cez vonkajšiu membránovú priehradku a/alebo cez difuzibilné poríny. CH je periplazmatický enzým, ktorý katalyzuje hydrolýzu karbarylu na 1-naftol, ktorý je stabilnejší, hydrofóbnejší a toxickejší. CH je lokalizovaný v periplazme a má nízku afinitu ku karbarylu, čím kontroluje tvorbu 1-naftolu, čím zabraňuje jeho akumulácii v bunkách a znižuje jeho toxicitu pre bunky (Kamini a kol., 2018). Výsledný 1-naftol je transportovaný do cytoplazmy cez vnútornú membránu rozdelením a/alebo difúziou a potom je hydroxylovaný na 1,2-dihydroxynaftalén vysokoafinitným enzýmom 1NH pre ďalší metabolizmus v centrálnej uhlíkovej dráhe.
Hoci mikroorganizmy majú genetické a metabolické schopnosti degradovať xenobiotické zdroje uhlíka, hierarchická štruktúra ich využitia (t. j. preferenčné využitie jednoduchých zdrojov uhlíka pred komplexnými) je hlavnou prekážkou biodegradácie. Prítomnosť a využitie jednoduchých zdrojov uhlíka znižuje reguláciu génov kódujúcich enzýmy, ktoré degradujú komplexné/nepreferované zdroje uhlíka, ako sú PAH. Dobre preštudovaným príkladom je, že keď sa Escherichia coli súčasne podáva glukóza a laktóza, glukóza sa využíva efektívnejšie ako laktóza (Jacob a Monod, 1965). Bolo hlásené, že Pseudomonas degraduje rôzne PAH a xenobiotické zlúčeniny ako zdroje uhlíka. Hierarchia využitia zdrojov uhlíka u Pseudomonas je organické kyseliny > glukóza > aromatické zlúčeniny (Hylemon a Phibbs, 1972; Collier a kol., 1996). Existuje však výnimka. Je zaujímavé, že Pseudomonas sp. CSV86 vykazuje jedinečnú hierarchickú štruktúru, ktorá prednostne využíva aromatické uhľovodíky (kyselinu benzoovú, naftalén atď.) pred glukózou a kometabolizuje aromatické uhľovodíky s organickými kyselinami (Basu a kol., 2006). V tejto baktérii nie sú gény pre degradáciu a transport aromatických uhľovodíkov downregulované ani v prítomnosti druhého zdroja uhlíka, ako je glukóza alebo organické kyseliny. Pri pestovaní v médiu s glukózou a aromatickými uhľovodíkmi sa pozorovalo, že gény pre transport a metabolizmus glukózy boli downregulované, aromatické uhľovodíky boli využívané v prvej logaritmickej fáze a glukóza bola využívaná v druhej logaritmickej fáze (Basu a kol., 2006; Choudhary a kol., 2017). Na druhej strane, prítomnosť organických kyselín neovplyvnila expresiu metabolizmu aromatických uhľovodíkov, takže sa očakáva, že táto baktéria bude kandidátskym kmeňom pre štúdie biodegradácie (Phale a kol., 2020).
Je dobre známe, že biotransformácia uhľovodíkov môže spôsobiť oxidačný stres a zvýšenú reguláciu antioxidačných enzýmov v mikroorganizmoch. Neefektívna biodegradácia naftalénu v stacionárnych fázach buniek aj v prítomnosti toxických zlúčenín vedie k tvorbe reaktívnych foriem kyslíka (ROS) (Kang a kol. 2006). Keďže enzýmy degradujúce naftalén obsahujú železo-sírové zhluky, pri oxidačnom strese sa železo v hémových a železo-sírových proteínoch oxiduje, čo vedie k inaktivácii proteínov. Ferredoxín-NADP+ reduktáza (Fpr) spolu so superoxiddismutázou (SOD) sprostredkováva reverzibilnú redoxnú reakciu medzi NADP+/NADPH a dvoma molekulami ferredoxínu alebo flavodoxínu, čím zachytáva ROS a obnovuje železo-sírové centrum pri oxidačnom strese (Li a kol. 2006). Bolo hlásené, že Fpr aj SodA (SOD) u Pseudomonas môžu byť indukované oxidačným stresom a zvýšené aktivity SOD a katalázy boli pozorované u štyroch kmeňov Pseudomonas (O1, W1, As1 a G1) počas rastu za podmienok pridania naftalénu (Kang a kol., 2006). Štúdie ukázali, že pridanie antioxidantov, ako je kyselina askorbová alebo železnaté železo (Fe2+), môže zvýšiť rýchlosť rastu naftalénu. Keď Rhodococcus erythropolis rástol v naftalénovom médiu, zvýšila sa transkripcia génov cytochrómu P450 súvisiacich s oxidačným stresom vrátane sodA (Fe/Mn superoxiddismutáza), sodC (Cu/Zn superoxiddismutáza) a recA (Sazykin a kol., 2019). Porovnávacia kvantitatívna proteomická analýza buniek Pseudomonas kultivovaných v naftaléne ukázala, že zvýšená regulácia rôznych proteínov spojených s reakciou na oxidačný stres je stratégiou zvládania stresu (Herbst a kol., 2013).
Bolo hlásené, že mikroorganizmy produkujú biosurfaktanty pôsobením hydrofóbnych zdrojov uhlíka. Tieto surfaktanty sú amfifilné povrchovo aktívne zlúčeniny, ktoré môžu tvoriť agregáty na rozhraní olej-voda alebo vzduch-voda. To podporuje pseudo-solubilizáciu a uľahčuje adsorpciu aromatických uhľovodíkov, čo vedie k účinnej biodegradácii (Rahman a kol., 2002). Vďaka týmto vlastnostiam sa biosurfaktanty široko používajú v rôznych priemyselných odvetviach. Pridanie chemických surfaktantov alebo biosurfaktantov do bakteriálnych kultúr môže zvýšiť účinnosť a rýchlosť degradácie uhľovodíkov. Spomedzi biosurfaktantov boli rozsiahlo študované a charakterizované ramnolipidy produkované Pseudomonas aeruginosa (Hisatsuka a kol., 1971; Rahman a kol., 2002). Medzi ďalšie typy biosurfaktantov patria lipopeptidy (mucíny z Pseudomonas fluorescens), emulgátor 378 (z Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg a Ron, 1999), trehalózodisacharidové lipidy z Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenín z Bacillus (Saraswathy a Hallberg, 2002) a surfaktant z Bacillus subtilis (Siegmund a Wagner, 1991) a Bacillus amyloliquefaciens (Zhi a kol., 2017). Ukázalo sa, že tieto silné surfaktanty znižujú povrchové napätie zo 72 dynov/cm na menej ako 30 dynov/cm, čo umožňuje lepšiu absorpciu uhľovodíkov. Bolo hlásené, že Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia a ďalšie bakteriálne druhy môžu produkovať rôzne biosurfaktanty na báze ramnolipidov a glykolipidov, keď sú pestované v naftalénovom a metylnaftalénovom médiu (Kanga a kol., 1997; Puntus a kol., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 môže produkovať extracelulárny biosurfaktant Biosur-Pm, keď je pestovaný na aromatických zlúčeninách, ako je kyselina naftoová (Phale a kol., 1995). Kinetika tvorby Biosur-Pm ukázala, že jeho syntéza je proces závislý od rastu a pH. Zistilo sa, že množstvo Biosur-Pm produkované bunkami pri neutrálnom pH bolo vyššie ako pri pH 8,5. Bunky pestované pri pH 8,5 boli hydrofóbnejšie a mali vyššiu afinitu k aromatickým a alifatickým zlúčeninám ako bunky pestované pri pH 7,0. V Rhodococcus spp. N6, vyšší pomer uhlíka k dusíku (C:N) a obmedzenie železa sú optimálnymi podmienkami pre produkciu extracelulárnych biosurfaktantov (Mutalik a kol., 2008). Boli vykonané pokusy o zlepšenie biosyntézy biosurfaktantov (surfaktínov) optimalizáciou kmeňov a fermentácie. Titer surfaktantu v kultivačnom médiu je však nízky (1,0 g/l), čo predstavuje výzvu pre produkciu vo veľkom meradle (Jiao a kol., 2017; Wu a kol., 2019). Preto sa na zlepšenie jeho biosyntézy použili metódy genetického inžinierstva. Jeho modifikácia je však náročná kvôli veľkej veľkosti operónu (∼25 kb) a komplexnej biosyntetickej regulácii systému quorum sensing (Jiao a kol., 2017; Wu a kol., 2019). Na baktériách Bacillus sa vykonalo množstvo modifikácií genetického inžinierstva, zameraných najmä na zvýšenie produkcie surfaktínov nahradením promótora (operón srfA), nadmernou expresiou proteínu YerP, ktorý exportuje surfaktín, a regulačných faktorov ComX a PhrC (Jiao a kol., 2017). Tieto metódy genetického inžinierstva však dosiahli iba jednu alebo niekoľko genetických modifikácií a zatiaľ nedosiahli komerčnú produkciu. Preto je potrebné ďalšie štúdium metód optimalizácie založených na znalostiach.
Štúdie biodegradácie PAH sa vykonávajú prevažne za štandardných laboratórnych podmienok. Avšak na kontaminovaných miestach alebo v kontaminovanom prostredí sa ukázalo, že mnohé abiotické a biotické faktory (teplota, pH, kyslík, dostupnosť živín, biologická dostupnosť substrátu, iné xenobiotiká, inhibícia konečných produktov atď.) menia a ovplyvňujú degradačnú kapacitu mikroorganizmov.
Teplota má významný vplyv na biodegradáciu PAH. S rastúcou teplotou klesá koncentrácia rozpusteného kyslíka, čo ovplyvňuje metabolizmus aeróbnych mikroorganizmov, pretože tie vyžadujú molekulárny kyslík ako jeden zo substrátov pre oxygenázy, ktoré vykonávajú hydroxyláciu alebo reakcie štiepenia kruhu. Často sa uvádza, že zvýšená teplota premieňa materské PAH na toxickejšie zlúčeniny, čím inhibuje biodegradáciu (Muller a kol., 1998).
Bolo zaznamenané, že mnohé lokality kontaminované PAH majú extrémne hodnoty pH, ako napríklad lokality kontaminované kyslými banskými odvodňovacími vodami (pH 1 – 4) a lokality splyňovania zemného plynu/uhlia kontaminované alkalickým výluhom (pH 8 – 12). Tieto podmienky môžu vážne ovplyvniť proces biodegradácie. Preto sa pred použitím mikroorganizmov na bioremediáciu odporúča upraviť pH pridaním vhodných chemikálií (so stredným až veľmi nízkym oxidačno-redukčným potenciálom), ako je síran amónny alebo dusičnan amónny pre alkalické pôdy alebo vápnenie uhličitanom vápenatým alebo uhličitanom horečnatým pre kyslé lokality (Bowlen a kol. 1995; Gupta a Sar 2020).
Prísun kyslíka do postihnutej oblasti je faktorom limitujúcim rýchlosť biodegradácie PAH. Vzhľadom na redoxné podmienky prostredia si procesy bioremediácie in situ zvyčajne vyžadujú prívod kyslíka z externých zdrojov (orba, prebublávanie vzduchom a pridávanie chemikálií) (Pardieck a kol., 1992). Odenkranz a kol. (1996) preukázali, že pridanie peroxidu horečnatého (zlúčeniny uvoľňujúcej kyslík) do kontaminovanej zvodnenej vrstvy by mohlo účinne bioremediovať zlúčeniny BTEX. Ďalšia štúdia skúmala degradáciu fenolu a BTEX in situ v kontaminovanej zvodnenej vrstve vstrekovaním dusičnanu sodného a vybudovaním extrakčných vrtov na dosiahnutie účinnej bioremediácie (Bewley a Webb, 2001).