Súčasnosť†Aktuálna adresa: OX11 0DE, Spojené kráľovstvo, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Spojené kráľovstvo, Diamond Light Source Co., Ltd., Centrum elektronického biologického zobrazovania.
Svetlozbierajúci komplex reakčného centra 1 (RC-LH1) je jadrom fotosyntetickej zložky purpurových fototrofných baktérií. Predstavili sme dve kryoelektrónmikroskopické štruktúry komplexu RC-LH1 z Rhodopseudomonas palustris. Štruktúra komplexu RC-LH114-W s rozlíšením 2,65 Å pozostáva zo 14 podjednotkových slučiek LH1 obklopujúcich RC, ktorá je prerušená proteínom W, zatiaľ čo komplex bez proteínu W má kompletné zloženie RC obklopené RC. Uzavretá 16-podjednotková slučka LH1. Porovnanie týchto štruktúr poskytuje pohľad na dynamiku chinónu v komplexe RC-LH1, vrátane doteraz neurčených konformačných zmien pri väzbe chinónu na miesto QB RC, ako aj na umiestnenie pomocných väzbových miest chinónov, ktoré pomáhajú ich prechodu na RC. Unikátna štruktúra proteínu W zabraňuje uzavretiu slučky LH1, čím vytvára kanál na urýchlenie výmeny chinón/chinolón.
Energia poskytovaná fotosyntézou dokáže uživiť takmer všetok život na Zemi a má veľký potenciál pre solárnu biotechnológiu. Fialové fototrofné baktérie, ktoré podporujú globálnu fotosyntézu, vykazujú aj rôzne energetické režimy a metabolické schopnosti. Môžu sa vyhnúť fotosyntéze a rásť ako heterotrofné baktérie v tme, dokážu fixovať dusík a oxid uhličitý, produkovať vodík a degradovať aromatické zlúčeniny (1-3). Aby sa zabezpečila energia pre tieto procesy, svetlo sa musí rýchlo a efektívne premeniť na chemickú energiu. Tento proces začína, keď anténny komplex zachytávajúci svetlo absorbuje svetlo a prenáša zachytenú energiu do reakčného centra (RC), čím sa spustí separácia náboja (4-7). Základná jednotka fotosyntézy u purpurových fototrofných baktérií sa skladá z RC typu 2, obklopeného komplexom zachytávajúcim svetlo 1 (LH1), ktorý tvorí jadrový komplex RC-LH1. LH1 je tvorený radom zakrivených heterodimérov αβ, z ktorých každý viaže dve molekuly bakteriálneho chlorofylu (BChl) a jeden alebo dva karotenoidy (8-12). Najjednoduchšia anténa LH1 pozostáva zo 16 alebo 17 αβ heterodimérov obklopujúcich RC (9-13) v uzavretej slučke, ale v iných jadrových komplexoch transmembránové peptidy prerušujú kontinuitu okolitého LH1, čím podporujú difúziu chinolu/chinónu medzi RC a komplexom cytochrómu bc1 (11, 13-15). Fialová fototrofná rastlina Rhodopseudomonas (Rps.) je modelový organizmus, ktorý dokáže pochopiť prenos energie a elektrónov, ktorý podporuje fotosyntézu. Prvá kryštalická štruktúra Rps. Modelom komplexu palustris RC-LH1 je RC, obklopený 15 heterodimérnymi slučkami LH1, ktoré sú prerušené neznámym proteínom nazývaným „Proteín W“ (14). Proteín W bol následne identifikovaný ako RPA4402, čo je necharakterizovaný 10,5 kDa proteín s tromi predpokladanými transmembránovými helixmi (TMH) (16). Navrhujeme premenovať gén rpa4402 kódujúci proteín W na pufW, aby bol v súlade s nomenklatúrou používanou pre gény kódujúce podjednotky RC-L, M (pufL, pufM) a LH1α, β (pufA, pufB). Je zaujímavé, že proteín W je prítomný iba v približne 10 % RC-LH1, čo ukazuje, že Rps. palustris produkuje dva rôzne komplexy RC-LH1. V tejto štúdii uvádzame kryo-EM (cryo-EM) štruktúry s vysokým rozlíšením dvoch jadrových komplexov, jedného s proteínom W a 14 αβ heterodimérmi, druhého bez proteínu W a uzavretou 16-heterodimérovou slučkou LH1. Naša štruktúra predstavuje skokový posun v chápaní komplexu RC-LH1 Rps. palustris, pretože sme analyzovali homogénnu populáciu každého variantu a máme dostatočné rozlíšenie na jasné priradenie každého peptidu a viazaných pigmentov a súvisiacich lipidov a chinónov. Porovnanie týchto štruktúr ukazuje, že tri TMH proteíny-W, ktoré sa doteraz nenašli v žiadnom inom komplexe RC-LH1, generujú chinónový kanál na urýchlenie výmeny chinónu/chinolónu. Bolo identifikovaných niekoľko konzervovaných väzbových miest pre lipidy a chinóny a odhalili sme novú konformačnú zmenu po kombinácii chinónu a RC, ktorá môže byť vhodná pre RC fotosystému II (PSII) okysličených fototrofných organizmov. Naše zistenia poskytujú nový pohľad na kinetiku väzby a výmeny chinónu/chinolónu v jadre komplexu RC-LH1 purpurových fototrofných baktérií.
Aby sme uľahčili podrobnú štúdiu dvoch komplexov nachádzajúcich sa v Rps. palustris, izolovali sme každý RC-LH1 biochemickými metódami. Komplex s deficitom proteínu W (ďalej len ΔpufW) bol purifikovaný z kmeňa, ktorému chýba gén pufW (16), a je možné produkovať iba jeden komplex RC-LH1. Komplex obsahujúci proteín W je produkovaný kmeňom. Proteín W tohto kmeňa je modifikovaný 10x His značkou na svojom C-konci, takže komplex obsahujúci proteín W sa môže účinne spojiť s väčšinou chýbajúceho proteínu W imobilizáciou kovu. Komplex sa účinne oddelí (16) afinitnou chromatografiou (IMAC).
Ako je znázornené na obrázku 1, oba komplexy obsahujú trojpodjednotkový RC (RC-L, RC-M a RC-H) obklopený anténou LH1. Štruktúra 2,80 Å komplexu bez proteínu W vykazuje 16 heterodimérov αβ, ktoré tvoria uzavretú slučku LH1 úplne obklopujúcu RC, ďalej označovaný ako komplex RC-LH116. Štruktúra 2,65 Å komplexu obsahujúceho proteín W má 14-heterodimér LH1 prerušený proteínom W, ďalej označovaný ako RC-LH114-W.
(A a B) Povrchové znázornenie zlúčeniny. (C a D) Viazané pigmenty exprimované v tyčinkách. (E a ​​F) Komplexy pozorované z cytoplazmatického povrchu majú peptidy a podjednotky LH1 znázornené v kreslených obrázkoch a sú číslované v smere hodinových ručičiek od medzery proteín-W [v súlade s číslovaním Rba. komplex sphaeroides (13)]. Pre LH1-α je farba proteínovej podjednotky žltá; pre LH1-β je farba proteínovej podjednotky modrá; pre proteín-W je proteín červený; pre RC-H je azúrová; pre RC-L je oranžová; pre RC-M je purpurová. Kofaktory sú znázornené tyčinkami, zelená predstavuje molekuly BChl a BPh a, fialová predstavuje karotenoidy a žltá predstavuje molekuly UQ10. (G a H) Zväčšený pohľad na medzeru proteín-W v ekvivalentnej oblasti komplexu RC-LH114-W (G) a komplexu RC-LH116 (H). Kofaktory sú zobrazené vo forme vypĺňania priestoru, chelátovaný chinón je zobrazený modrou farbou. Medzera proteín-W je zvýraznená modrou prerušovanou čiarou v (G) a malé otvory, kde chinón/chinolol difunduje na kruhu LH116, sú zvýraznené čiernou prerušovanou čiarou v (H).
Obrázok 1 (A a B) zobrazuje RC obklopený otvorenými alebo uzavretými súbormi heterodimérov LH1αβ, z ktorých každý viaže dva BChl a jeden karotenoid (obrázok 1, C a D). Predchádzajúce štúdie ukázali, že Rps je komplex LH1. V biosyntetickej dráhe xantínu spirulíny tieto druhy obsahujú zmiešané populácie karotenoidov (17). Spiropyroxantín je však dominantným karotenoidom a jeho hustota je uspokojivá. Preto sme sa rozhodli modelovať spiroxantín na všetkých väzbových miestach LH1. Alfa a beta polypeptidy sú jednotlivé TMH s krátkymi vonkajšími oblasťami membrány (obrázok 1, A, B, E a F). Hoci hustota 17 zvyškov na C-konci nebola pozorovaná, alfa polypeptid bol v oboch komplexoch štiepený z Met1 na Ala46. β polypeptid bol v RC-LH116 redukovaný z Gly4 na Tyr52 a v RC-LH114-W zo Ser5 na Tyr52. Nebola pozorovaná žiadna hustota 3 alebo 4 N-terminálnych alebo 13 C-terminálnych zvyškov (obrázok S1). Analýza hmotnostnou spektrometriou zmiešaného komplexu RC-LH1 pripraveného z kmeňa divokého typu ukázala, že chýbajúca oblasť bola výsledkom heterológneho štiepenia týchto peptidov (obrázok S1 a S2). Pozorovala sa aj N-terminálna formylácia α-Met1 (f). Analýza ukázala, že α-peptid pozostáva zo zvyškov fMet1 až Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 a β-peptid pozostáva zo zvyškov Ser2 až Ala53, čo je v dobrej zhode s mapou hustoty nízkoteplotnej EM.
Koordinácia α-His29 a β-His36 vytvára BChls tvárou v tvár; každý αβ heterodimér sa zostavuje so svojimi susedmi a vytvára otvorenú slučku (RC-LH114-W) alebo uzavretú slučku (RC-LH116) okolo RC excitónovo viazaného pigmentového poľa (obrázok 1, C a D). V porovnaní s pásmom 877 nm RC-LH114-W je absorpčný červený posun RC-LH116 pri 880 nm 3 nm (obrázok 2A). Spektrum kruhového dichroizmu je však takmer rovnaké (obrázok 2B), čo naznačuje, že hoci existuje jasný rozdiel medzi otvorenými a uzavretými slučkami, lokálne prostredie BChls je veľmi podobné. Absorpčný červený posun môže byť výsledkom zníženého tepelného pohybu a zvýšenej stability v uzavretej slučke (18, 19), zmeny väzby pigmentov spôsobenej uzavretou slučkou (20, 21) alebo kombinácie týchto dvoch účinkov (11).
(A) Absorpčné spektrum v ultrafialovom/viditeľnom/blízkom infračervenom spektre, ktorého vrcholy sú označené zodpovedajúcimi pigmentmi a normalizované na vrchol BPh pri 775 nm. (B) Spektrum kruhového dichroizmu normalizované na absorbanciu BChl pri 805 nm. (C a D) Vybrané ΔA spektrá z časovo rozlíšených absorpčných spektier komplexu RC-LH114-W (C) a komplexu RC-LH116 (D). Pre lepšiu porovnateľnosť sú všetky spektrá normalizované na ∆A od −A pri 0,2 ps. (E) Rýchlosť oxidácie cytochrómu c2 po ožiarení v prítomnosti rôznych koncentrácií UQ2 (surové údaje pozri na obrázku S8). (F) V bunkách pestovaných pri svetle s nízkou, strednou alebo vysokou intenzitou (10, 30 alebo 300 μMm-2 s-1) podjednotky proteínu W a RC-L v purifikovanom komplexe a pomer oddelených membrán. Hladinu proteínu stanovte pomocou SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforézy a imunotestu (nespracované údaje nájdete na obrázku S9). Určte pomer vzhľadom na purifikovaný komplex RC-LH114-W. Stechiometrický pomer RC-L k proteínu-W v komplexe je 1:1.
BChl v polohe 1 v deformovanej slučke αβ14 RC-LH114-W (obrázok 1, A, C a E) sú o 6,8 Å bližšie k primárnemu donoru RC (P) ako ekvivalentné BChl v RC-LH116 (obrázok 1, B, D a F a obrázok S3); kinetika prechodnej absorpcie oboch komplexov však ukazuje, že pre RC-LH114-W a RC-LH116 sú časové konštanty prenosu excitačnej energie z LH1 do RC 40 ± 4 a 44 ± 3 ps (obrázok 2). , C a D, obrázok S4 a tabuľka S2). Taktiež nie je významný rozdiel v prenose elektrónov v rámci RC (obrázok S5 a súvisiaci doplnkový text). Domnievame sa, že blízka zhoda času prenosu energie medzi LH1 a RC-P je spôsobená podobnou vzdialenosťou, uhlom a potenciálnou energiou väčšiny BChl v oboch slučkách LH1. Zdá sa, že skúmanie energetického vzoru LH1 na dosiahnutie minimálnej vzdialenosti nie je rýchlejšie ako priamy prenos energie zo suboptimálnych miest do RC. Otvorená slučka LH1 v RC-LH114-W môže tiež podliehať nevýznamnému tepelnému pohybu za podmienok nízkej teploty pre štrukturálnu analýzu a pri izbovej teplote existuje dlhšia konformácia kruhu αβ14 od pigmentačnej vzdialenosti βBChls v polohe RC1.
Komplex RC-LH116 obsahuje 32 BChl a 16 karotenoidov a jeho celkové usporiadanie je rovnaké ako usporiadanie získané z Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), kmeňa Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) a zelených rias (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Po zarovnaní sa pozorovali iba malé odchýlky v polohách heterodimérov αβ, najmä 1-5, 15 a 16 (obrázok S6). Prítomnosť proteínu-W má významný vplyv na štruktúru LH1. Jeho tri TMH sú spojené krátkymi slučkami, pričom N-terminál je na lúmenovej strane komplexu a C-terminál je na cytoplazmatickej strane (obrázky 1A a 3, A až D). Proteín-W je prevažne hydrofóbny (obrázok 3B) a TMH2 a TMH3 interagujú s LH1αβ-14 za vzniku transmembránového povrchu (obrázok 3, B a E až G). Rozhranie sa skladá prevažne zo zvyškov Phe, Leu a Val v transmembránovej oblasti. Tieto zvyšky sú spojené s hydrofóbnymi aminokyselinami a pigmentmi αβ-14. K interakcii prispievajú aj niektoré polárne zvyšky, vrátane vodíkovej väzby medzi W-Thr68 a β-Trp42 na povrchu komplexnej dutiny (obrázok 3, F a G). Na povrchu cytoplazmy susedí Gln34 s keto skupinou karotenoidov αβ-14. Okrem toho bola molekula n-dodecyl β-d-maltozidu (β-DDM) oddelená a jej hydrofóbny koniec sa rozšíril na rozhranie medzi proteínom-W a αβ-14 a lipidový koniec sa môže nachádzať v tele. Všimli sme si tiež, že C-terminálne rozlišovacie oblasti proteínu W a RCH sú si veľmi blízke, ale nie sú v rozsahu vytvárania špecifických interakcií (obrázok 1, A a E). Môžu však existovať interakcie v nerozlíšených C-terminálnych aminokyselinách týchto dvoch proteínov, čo môže poskytnúť mechanizmus pre nábor proteínu W počas zostavovania komplexu RC-LH114-W.
(A) Proteín-W, ktorý je v kreslenom zobrazení otočený k rozhraniu s LH1αβ14, má tyčinkovitý bočný reťazec (červená farba), zobrazený v časti diagramu elektrostatického potenciálu (priehľadný sivý povrch s úrovňou kontúry 0,13). (B) Proteín-W znázornený hydrofóbnym farebným povrchom. Polárne a nabité oblasti sú zobrazené azúrovou farbou, hydrofóbne oblasti sú zobrazené bielou farbou a silne hydrofóbne oblasti sú zobrazené oranžovou farbou. (C a D) Proteín-W znázornený v kreslenom zobrazení, jeho orientácia je rovnaká ako v (A) (C) a otočený o 180° (D). Podľa polohy v sekvencii majú rozlíšiteľné zvyšky dúhovú farebnú schému, kde N-terminál je modrý a C-terminál červený. (E) Proteín-W v rovnakom pohľade ako v (A) a zvyšky na rozhraní proteínu-W:LH1 sú znázornené tyčinkami s pripojenými značkami. (F) Proteín-W je otočený o 90° vzhľadom na (E) a LH1αβ14 v kreslenom zobrazení a vzhľadom na zvyšky na rozhraní v stĺpcovom zobrazení. Presahujúce zvyšky z beta polypeptidu sú označené. Kofaktor je zobrazený ako stĺpec zodpovedajúci farbe na obrázku 1, rozložený β-DDM je zobrazený sivou farbou a kyslík je zobrazený červenou farbou. (G) Pohľad na obrázku (F) je otočený o 180° s výraznými zvyškami označeného alfa polypeptidu.
Proteín-W nahrádza αβ heterodimér (15. na obrázku 1F), čím zabraňuje uzavretiu slučky a nakloneniu prvých troch αβ heterodimérov. Bolo pozorované, že maximálny uhol sklonu prvého αβ-1 heterodiméru vzhľadom na kolmicu filmu bol 25° až 29° (obrázok 1, A a E), ktorý bol vytvorený sklonom αβ-1 v RC A v ostrom kontraste s LH116 (obrázok 1, B a F). Druhý a tretí heterodimér sú naklonené v uhle 12° až 22° a 5° až 10°. Kvôli sterickej zábrannej schopnosti RC, sklon αβ-1 nezahŕňa druhý pár αβ (ktorý zodpovedá 16. αβ na obrázku 1F), čím sa vytvára jasná medzera v kruhu LH1 (obrázok 1, A a E). Kvôli absencii dvoch heterodimérov αβ, sprevádzanej stratou štyroch BChl a dvoch karotenoidov, sa žiadny z karotenoidov neviaže na skrútenú podjednotku αβ-1, čo vedie k kruhu LH114-W obsahujúcemu 13 karotenoidov Vegetarian a 28 BChl. Odhady lokálneho rozlíšenia dvoch komplexov v oblastiach αβ1 až 7 sú nižšie ako odhady zvyšku slučky LH1, čo môže odrážať inherentnú plasticitu podjednotky LH1 susediacej s miestom RC QB (obrázok 4).
Obrázky RC-LH114-W (A a B) a RC-LH116 (C a D) sú zobrazené z rovnakého pohľadu zhora/bočného pohľadu (A a B) (A a C) a povrchu dutiny ako na obr. 1 (B a D). Farebné kľúče sú zobrazené vpravo.
Jediným ďalším charakteristickým jadrovým komplexom so stechiometrickým pomerom 1:14 je dimér Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Proteín W a PufX však nemajú žiadnu zjavnú homológiu a majú významný vplyv na ich príslušné štruktúry LH1. PufX je jediný TMH s N-terminálnou cytoplazmatickou doménou, ktorá interaguje s cytoplazmatickou stranou podjednotky RC-H (13) v polohe zodpovedajúcej Rps. palustris LH116αβ-16. PufX vytvára kanál pre výmenu chinónu/chinolónu medzi RC-LH1 a komplexom cytochrómu bcl a je prítomný vo všetkých jadrových komplexoch Rba. sphaeroides (13). Hoci rozhranie monomér-monomér je v Rba. Dimér RC-LH1-PufX u sphaeroidov sa nachádza vo väzbovej pozícii proteínu W v RC-LH114-W a medzera vyvolaná PufX a proteínom W je v ekvivalentnej pozícii (obrázok S7A). Medzera v RC-LH114-W je tiež zarovnaná s hypotetickým chinónovým kanálom (8) Pseudomonas rosea LH1, ktorý je tvorený peptidmi, ktoré nesúvisia s proteínom W ani PufX (obrázok S7B). Okrem toho sa chinónový kanál v Blc. Smaragdovo zelený LH1, ktorý vznikol vylúčením jednej γ podjednotky (7), nachádza v podobnej pozícii (obrázok S7C). Hoci je sprostredkovaný rôznymi proteínmi, výskyt týchto chinónových/chinololových kanálov v spoločnej pozícii v komplexe RC-LH1 sa javí ako príklad konvergentnej evolúcie, čo naznačuje, že medzera vytvorená proteínom W môže pôsobiť ako chinónový kanál.
Medzera v slučke LH114-W umožňuje vytvorenie súvislej membránovej oblasti medzi vnútorným priestorom komplexu RC-LH114-W a objemovou membránou (obrázok 1G), namiesto spojenia týchto dvoch domén cez proteínový pór ako v proteínoch. Komplex RC-LH116 je podobný uzavretému ihlovitému komplexu Tch. (22) (obrázok 1H). Keďže difúzia chinónu cez membránu je rýchlejšia ako difúzia cez úzky proteínový kanál, otvorená slučka LH114-W môže umožniť rýchlejšiu premenu RC ako uzavretá slučka LH116 a difúzia chinónu do RC môže byť obmedzenejšia. Aby sme otestovali, či proteín W ovplyvňuje premenu chinónov cez RC, vykonali sme test oxidácie cytochrómu s určitou koncentráciou ubichinónu 2 (UQ2) (analóg prírodného UQ10 s kratším izoprénovým chvostom) (obrázok 2E). Hoci prítomnosť chelátovaného chinónu bráni presnému stanoveniu zdanlivej Michaelisovej konštanty (RC-LH114-W a RC-LH116 sú vhodné pre 0,2 ± 0,1 μM a 0,5 ± 0,2 μM), maximálna rýchlosť RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) je o 28 ± 5 % vyššia ako RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Spočiatku sme odhadli, že proteín-W je prítomný v približne 10 % jadrového komplexu (16); miera obsadenosti rastových buniek pri slabom, strednom a silnom svetle je tu 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % a 0,9 ± 0,5 % (obrázok 2F). Kvantitatívne porovnanie hmotnostnej spektrometrie ukázalo, že pridanie histidínovej značky neznížilo relatívnu abundanciu proteínu-W v porovnaní s kmeňmi divokého typu (P = 0,59), takže tieto hladiny nie sú artefaktom modifikovaného proteínu-W (obrázok S10). Táto nízka obsadenosť proteínu-W v komplexe RC-LH1 však môže umožniť niektorým RC zrýchlenú premenu, čím sa zmierni pomalšia výmena chinónov/chinolónov v komplexe RC-LH116. Všimli sme si, že miera obsadenosti pri vysokom svetle nie je v súlade s nedávnymi transkriptomickými údajmi, čo naznačuje, že expresia génu pufW sa zvyšuje pri silnom svetle (obrázok S11) (23). Rozdiel medzi transkripciou pufW a inkorporáciou proteínu W do komplexu RC-LH1 je mätúci a môže odrážať komplexnú reguláciu proteínu.
V RC-LH114-W je alokovaných a modelovaných 6 molekúl kardiolipínu (CDL), 7 molekúl fosfatidylcholínu (POPC), 1 molekula fosfatidylglycerolu (POPG) a 29 molekúl β-DDM: 6 molekúl CDL, 24 molekúl POPC, 2 molekuly POPG a 12 molekúl β-DDM. RC-LH116 (obrázok 5, A a B). V týchto dvoch štruktúrach sa CDL nachádza takmer na cytoplazmatickej strane komplexu, zatiaľ čo POPC, POPG a β-DDM sa nachádzajú prevažne na luminálnej strane. Dve molekuly lipidu a detergentu boli izolované v oblasti αβ-1 až αβ-6 komplexu RC-LH114-W (obrázok 5A) a päť bolo izolovaných v ekvivalentnej oblasti RC-LH116 (obrázok 5B). Viac lipidov sa našlo na druhej strane komplexu, najmä CDL, akumulovaných medzi RC a αβ-7 až αβ-13 (obrázok 5, A a B). Ostatné štrukturálne rozlíšené lipidy a detergenty sa nachádzajú mimo kruhu LH1 a dobre rozlíšené acylové reťazce sa rozprestierajú medzi podjednotkami LH1, predbežne označenými ako β-DDM v RC-LH114-W a definovanými ako β-DDM v RC Zmes β-DDM a POPC-LH116. Podobné polohy chelatujúcich lipidov a detergentov v našej štruktúre naznačujú, že ide o fyziologicky relevantné väzbové miesta (obrázok S12A). Polohy ekvivalentných molekúl v Tch majú tiež dobrú konzistenciu. Jemný a Trv. Kmeň 970 RC-LH1 (obrázok S12, B až E) (9, 12) a vodíkové väzbové zvyšky lipidovej hlavnej skupiny vykazovali pomerne dobrú konzerváciu v zarovnaní sekvencie (obrázok S13), čo naznačuje, že konzervovaný CDL, ktorý sa viaže na RC (24), tieto miesta môžu byť konzervované v komplexe RC-LH1.
(A a B) Peptidy RC-LH114-W (A) a RC-LH116 (B) sú znázornené kreslenými kresbami a pigmenty sú znázornené tyčinkami, pričom sa použije farebná schéma na obrázku 1. Lipidy sú znázornené červenou farbou a detergenty sivou farbou. UQ viazaný na miesta RC QA a QB je žltý, zatiaľ čo izolovaný UQ je modrý. (C a D) Rovnaké pohľady ako (A) a (B), s vynechanými lipidmi. (E až G) Zväčšený pohľad na Q1(E), Q2(F) a Q3(G) z RC-LH116 s bočnými reťazcami, ktoré sa navzájom ovplyvňujú. Vodíkové väzby sú znázornené čiernymi prerušovanými čiarami.
V RC-LH116 sú RC QA aj QB UQ, ktoré sa podieľajú na prenose elektrónov v procese separácie náboja, rozložené vo svojich väzbových miestach. Avšak v RC-LH114-W nebol QB chinón rozlíšený a bude podrobnejšie diskutovaný nižšie. Okrem chinónov QA a QB sú v štruktúre RC-LH114-W alokované dve chelátované molekuly UQ (umiestnené medzi kruhmi RC a LH1) podľa ich dobre rozlíšených hlavných skupín (umiestnených v priestore Q1 a Q2). Obrázok 5C). Dve izoprénové jednotky sú priradené k Q1 a mapa hustoty rozlišuje celých 10 izoprénových koncov Q2. V štruktúre RC-LH116 boli rozlíšené tri chelátované molekuly UQ10 (Q1 až Q3, obrázok 5D) a všetky molekuly majú jasnú hustotu v celom chvoste (obrázok 5, D až G). V týchto dvoch štruktúrach majú polohy chinónových hlavových skupín Q1 a Q2 vynikajúcu konzistenciu (obrázok S12F) a interagujú iba s RC. Q1 sa nachádza na vstupe do W medzery RC-LH114-W (obrázok 1G a 5, C, D a E) a Q2 sa nachádza v blízkosti väzbového miesta QB (obrázok 5, C, D) a F). Konzervované zvyšky L-Trp143 a L-Trp269 sú veľmi blízko Q1 a Q2 a poskytujú potenciálne π-stacking interakcie (obrázok 5, E a F a obrázok S12). L-Gln88, 3,0 Å od distálneho kyslíka Q1, poskytuje silnú vodíkovú väzbu (obrázok 5E); tento zvyšok je konzervovaný vo všetkých RC okrem najvzdialenejšieho vzťahu (obrázok S13). L-Ser91 je konzervatívne substituovaný za Thr vo väčšine ostatných RC (obrázok S13), je vzdialený 3,8 Å od metylového kyslíka Q1 a môže vytvárať slabé vodíkové väzby (obrázok 5E). Q3 sa nezdá byť špecificky interagovaný, ale nachádza sa v hydrofóbnej oblasti medzi podjednotkou RC-M a podjednotkou LH1-α 5 až 6 (obrázok 5, D a G). Q1, Q2 a Q3 alebo blízke chelátované chinóny boli tiež rozlíšené v Tch. Gentle, Trv. Strain 970 a Blc. Štruktúra dúhovky (9, 10, 12) ukazuje na konzervované pomocné väzbové miesto chinónu v komplexe RC-LH1 (obrázok S12G). Päť rozložených UQ v RC-LH116 je v dobrej zhode s hodnotou 5,8 ± 0,7 pre každý komplex stanovenou vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC), zatiaľ čo tri rozložené UQ v RC-LH114-W sú nižšie ako Nameraná hodnota 6,2 ± 0,3 (obr. S14) naznačuje, že v štruktúre sú prítomné nerozlíšené molekuly UQ.
Pseudosymetrické L a M polypeptidy obsahujú každý päť TMH a tvoria heterodimér, ktorý kombinuje jeden dimér BChl, dva monoméry BChl, dva monoméry bakteriofága (BPh) a jednu molekulu nehemového železa a jednu alebo dve molekuly UQ10. Prostredníctvom prítomnosti vodíkových väzieb na terminálnej ketónovej skupine a jej známej akumulácie v Rps sú karotenoidy začlenené do M-podjednotky, ktorá sa nazýva cis-3,4-dehydroorhodopín. Druhy (25). Doména vonkajšej membrány RC-H je ukotvená k membráne jedným TMH. Celková štruktúra RC je podobná trojpodjednotkovej štruktúre RC príbuzných druhov (ako je Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrocykly BChl a BPh, karotenoidný hlavný reťazec a nehemové železo sa prekrývajú v rámci rozsahu rozlíšenia týchto štruktúr, rovnako ako hlavná skupina UQ10 v mieste QA a QB chinón v RC-LH116 (obrázok S15).
Dostupnosť dvoch RC štruktúr s rôznymi mierami obsadenosti QB miest poskytuje novú príležitosť preskúmať konzistentné konformačné zmeny sprevádzajúce väzbu QB chinónu. V komplexe RC-LH116 sa QB chinón nachádza v plne viazanej „proximálnej“ polohe (26), ale oddelenie RC-LH114-W neobsahuje QB chinón. V RC-LH114-W nie je žiadny QB chinón, čo je prekvapujúce, pretože komplex je aktívnejší, viac ako komplex RC-LH116 so štrukturálne rozštiepeným QB chinónom. Hoci dva kruhy LH1 chelátujú približne šesť chinónov, päť je štrukturálne rozštiepených v uzavretom kruhu RC-LH116, zatiaľ čo iba tri sú štrukturálne obmedzené v otvorenom kruhu RC-LH114-W. Táto zvýšená štrukturálna porucha môže odrážať rýchlejšiu náhradu QB miest RC-LH114-W, rýchlejšiu kinetiku chinónov v komplexe a zvýšenú pravdepodobnosť prekročenia slučky LH1. Predpokladáme, že nedostatok UQ v mieste RC QB génu RC-LH114-W môže byť výsledkom komplexnejšieho a aktívnejšieho komplexu a miesto QB génu RC-LH114-W bolo okamžite zmrazené v obrate UQ. Špecifické štádium (vstup do miesta QB bol uzavretý) odráža konformáciu tejto aktivity.
Bez QB dochádza k sprievodnej rotácii L-Phe217 do polohy, ktorá nie je kompatibilná s väzbou UQ10, pretože to spôsobí priestorovú kolíziu s prvou izoprénovou jednotkou chvosta (obrázok 6A). Okrem toho sú zrejmé hlavné konformačné zmeny, najmä helix de (krátka helix v slučke medzi TMH D a E), kde je L-Phe217 posunutý do väzbového vrecka QB a rotácia L-Tyr223 (obrázok 6A) preruší vodíkovú väzbu s rámcom M-Asp45 a uzavrie vstup do väzbového miesta QB (obrázok 6B). Helix de sa otáča na svojej základni, Cα L-Ser209 sa posunie o 0,33 Å, zatiaľ čo L-Val221Cα sa posunie o 3,52 Å. V TMH D a E nie sú pozorovateľné žiadne zmeny, ktoré by sa dali prekrývať v oboch štruktúrach (obrázok 6A). Pokiaľ vieme, toto je prvá štruktúra v prirodzenom RC, ktorá uzatvára miesto QB. Porovnanie s kompletnou (QB-viazanou) štruktúrou ukazuje, že predtým, ako sa chinón redukuje, je potrebná konformačná zmena, aby vstúpil do chinónu. L-Phe217 sa otáča a vytvára π-stohovaciu interakciu s chinónovou hlavnou skupinou a helix sa posúva smerom von, čo umožňuje kostre L-Gly222 a bočnému reťazcu L-Tyr223 vytvoriť sieť vodíkových väzieb so stabilnou štruktúrou vodíkových väzieb (obrázok 6, A a C).
(A) Prekrývajúci sa náčrt hologramu (reťazec L, oranžová/reťazec M, purpurová) a apo (sivá) štruktúry, v ktorej sú kľúčové zvyšky zobrazené vo forme tyčinky. UQ10 je znázornený žltým pruhom. Prerušovaná čiara označuje vodíkové väzby vytvorené v celej štruktúre. (B a C) Povrchové znázornenie apolipoproteínu a celej kruhovej štruktúry, pričom kyslík v bočnom reťazci je zvýraznený modrou farbou v L-Phe217 a červenou farbou v L-Tyr223. Podjednotka L je oranžová; podjednotky M a H nie sú sfarbené. (D a E) Apolipoproteín (D) a celé (E) RC QB miesta [zafarbené podľa (A)] a Thermophilus thermophilus PSII (zelená, modrá s plastovým chinónom; PDB ID: 3WU2) Zarovnanie (58).
Neočakávane, hoci je k dispozícii niekoľko štruktúr QB-deficientných RC bez LH1, konformačné zmeny pozorované v tejto štúdii neboli doteraz publikované. Patrí medzi ne štruktúra QB deplécie z Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) a Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), pričom všetky sú takmer rovnaké ako ich celková štruktúra QB. Bližšia analýza 3PRC odhalila, že molekuly detergentu LDAO (lauryl dimetyl amín oxid) sa viažu na vstupe do pozície QB, čo môže zabrániť preskupeniu do uzavretej konformácie. Hoci sa LDAO nerozkladá v rovnakej pozícii v 1EYS alebo 1OGV, tieto RC sa pripravujú s použitím rovnakého detergentu, a preto môžu mať rovnaký účinok. Kryštálová štruktúra Rba. Zdá sa, že aj Sphaeroides RC kokryštalizovaný s cytochrómom c2 (PDB ID: 1L9B) má uzavreté miesto QB. V tomto prípade však N-terminálna oblasť RC-M polypeptidu (interagujúca s väzbovým miestom QB prostredníctvom H väzby Tyr zvyšku na Q helixe) prijíma neprirodzenú konformáciu a konformačná zmena QB nie je ďalej skúmaná (30). Upokojujúce je, že sme tento druh deformácie M polypeptidu nevideli v štruktúre RC-LH114-W, ktorá je takmer rovnaká ako N-terminálna oblasť RC-LH116 RC. Treba tiež poznamenať, že po odstránení antény LH1 na báze detergentu boli RC apolipoproteínu v PDB rozpustené, čo eliminovalo vnútorné chinónové zásoby a lipidy v medzere medzi RC a vnútorným povrchom okolitého kruhu LH1 (31, 32). RC zostáva funkčný, pretože si zachováva všetky kofaktory okrem rozložiteľného QB chinónu, ktorý je menej stabilný a počas procesu prípravy sa často stráca (33). Okrem toho je známe, že odstránenie LH1 a prirodzených cyklických lipidov z RC môže mať vplyv na funkcie, ako je skrátená životnosť nábojovo oddeleného P+QB stavu (31, 34, 35). Preto sa domnievame, že existencia lokálneho kruhu LH1 obklopujúceho RC môže udržiavať „uzavreté“ miesto QB, čím sa zachováva lokálne prostredie v blízkosti QB.
Hoci apolipoproteín (bez QB chinónu) a kompletná štruktúra predstavujú iba dva momenty obratu QB miesta, a nie sériu udalostí, existujú náznaky, že väzba môže byť riadená, aby sa zabránilo opätovnej väzbe hydrochinónom, aby sa inhibovala inhibícia substrátu. Interakcia chinololu a chinónu v blízkosti QB miesta apolipoproteínu môže byť odlišná, čo vedie k jeho odmietnutiu RC. Dlho sa predpokladalo, že konformačné zmeny hrajú úlohu vo väzbe a redukcii chinónov. Schopnosť zmrazených RC redukovať chinóny po adaptácii na tmu je narušená (36); röntgenová kryštalografia ukazuje, že toto poškodenie je spôsobené tým, že QB chinóny sú zachytené v „distálnej“ konformácii približne 4,5 Å od aktívnej proximálnej polohy (26, 37). Domnievame sa, že táto distálna väzbová konformácia je momentom medzistavu medzi apolipoproteínom a plnou kruhovou štruktúrou, ktorý nasleduje po počiatočnej interakcii s chinónom a otvorení QB miesta.
Redukcia chinónov typu II typu II, ktorá sa nachádza v komplexe PSII určitých fototrofných baktérií a siníc, rias a rastlín, má štrukturálnu a funkčnú konzerváciu (38). Štrukturálne usporiadanie znázornené na obrázku 6 (D a E) zdôrazňuje podobnosť medzi RC typu PSII a miestom QB bakteriálneho komplexu RC. Toto porovnanie je už dlho modelom pre štúdium úzko súvisiacich systémov väzby a redukcie chinónov. Predchádzajúce publikácie naznačovali, že konformačné zmeny sú sprevádzané redukciou chinónov pomocou PSII (39, 40). Preto vzhľadom na evolučnú konzerváciu RC môže byť tento predtým nepozorovaný väzbový mechanizmus aplikovateľný aj na miesto QB RC typu PSII v okysličených fototrofných rastlinách.
Kmene Rps ΔpufW (neznačená delécia pufW) a PufW-His (C-terminálny 10x His-značený proteín-W exprimovaný z prirodzeného lokusu pufW). Kmeň palustris CGA009 bol opísaný v našej predchádzajúcej práci (16). Tieto kmene a izogénny rodič divokého typu boli získané z mrazničky nanesením malého počtu buniek na platňu PYE (každá 5 g liter -1) (skladovanú v LB pri -80 °C, obsahujúcu 50 % (hm./obj.) glycerolového proteínu, kvasinkového extraktu a sukcinátu) agaru [1,5 % (hm./obj.)]. Platňa bola inkubovaná cez noc v tme pri izbovej teplote za anaeróbnych podmienok a potom osvetlená bielym svetlom (~50 μmolm-2 s-1) poskytnutým halogénovými žiarovkami OSRAM 116-W (RS Components, Spojené kráľovstvo) počas 3 až 5 dní, kým sa neobjavila jedna kolónia. Jedna kolónia sa použila na inokuláciu 10 ml média M22+ (41) doplneného o 0,1 % (hm./obj.) kasaminokyselín (ďalej len M22). Kultúra sa pestovala za podmienok nízkeho obsahu kyslíka v tme pri teplote 34 °C za trepania pri 180 ot./min. počas 48 hodín a potom sa 70 ml kultúry inokulovalo za rovnakých podmienok počas 24 hodín. Semiaeróbna kultúra s objemom 1 ml sa použila na inokuláciu 30 ml média M22 v 30 ml univerzálnej priehľadnej sklenenej fľaši so skrutkovacím uzáverom a ožarovala sa za miešania (~50 μmolm-2 s-1) počas 48 hodín sterilnou magnetickou miešacou tyčinkou. Potom sa 30 ml kultúry inokulovalo približne 1 litrom kultúry za rovnakých podmienok, ktorá sa potom použila na inokuláciu približne 9 litrov kultúry osvetlenej pri ~200 μmolm-2 s-1 počas 72 hodín. Bunky boli zozbierané centrifugáciou pri 7132 RCF počas 30 minút, resuspendované v ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) a skladované pri teplote -20 °C až do použitia.
Po rozmrazení pridajte k resuspendovaným bunkám niekoľko kryštálov deoxyribonukleázy I (Merck, Spojené kráľovstvo), lyzozýmu (Merck, Spojené kráľovstvo) a dve tablety inhibítora proteázy holoenzýmu Roche (Merck, Spojené kráľovstvo). V tlakovej cele French s tlakom 20 000 psi (Aminco, USA) boli bunky rozrušené 8 až 12-krát. Po odstránení nerozbitých buniek a nerozpustných zvyškov centrifugáciou pri 18 500 RCF počas 15 minút pri 4 °C bola membrána precipitovaná z pigmentovaného lyzátu centrifugáciou pri 113 000 RCF počas 2 hodín pri 43 000 °C. Rozpustnú frakciu odstráňte a farebnú membránu resuspendujte v 100 až 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) a homogenizujte, kým nezmiznú všetky viditeľné agregáty. Suspendovaná membrána sa inkubovala v 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) s obsahom 2 % (hm./obj.) β-DDM počas 1 hodiny v tme pri teplote 4 °C za jemného miešania. Potom sa centrifugovala pri teplote 70 °C, aby sa rozpustilo 150 000 RCF pri teplote 4 °C počas 1 hodiny a odstránili sa zvyšné nerozpustné látky.
Solubilizačná membrána z kmeňa ΔpufW bola nanesená na 50 ml DEAE Sepharose ionomeničovú kolónu s tromi objemami kolóny (CV) väzbového pufra [20 mM tris-HCl (pH 8,0) obsahujúci 0,03 % (hm./obj.) β-DDM]. Kolóna bola premytá dvoma väzbovými puframi CV a potom dvoma väzbovými puframi obsahujúcimi 50 mM NaCl. Komplex RC-LH116 bol eluovaný lineárnym gradientom 150 až 300 mM NaCl (vo väzbovom pufri) pri 1,75 CV a zostávajúci väzbový komplex bol eluovaný väzbovým pufrom obsahujúcim 300 mM NaCl pri 0,5 CV. Absorpčné spektrum bolo zaznamenané medzi 250 a 1000 nm, frakcia s absorbančným pomerom (A880/A280) bola udržiavaná pri 880 až 280 nm, dvakrát zriedená vo väzbovom pufri a rovnaký postup bol použitý znova na DEAE kolóne pri čistení. Frakcie s pomermi A880/A280 vyššími ako 1,7 a pomermi A880/A805 vyššími ako 3,0 sa zriedia, vykona sa tretie kolo iónovej výmeny a frakcie s pomermi A880/A280 vyššími ako 2,2 a pomermi A880/A805 vyššími ako 5,0 sa ponechajú. Čiastočne vyčistený komplex sa skoncentroval na približne 2 ml v odstredivom filtri Amicon 100 000 s hraničnou hodnotou molekulovej hmotnosti (MWCO) (Merck, Spojené kráľovstvo) a naniesol sa na vylučovaciu kolónu Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, USA) obsahujúcu 200 mM NaCl pufor, a potom sa eluoval v rovnakom pufri pri 1,5 CV. Zozbierajte absorpčné spektrá frakcie vylučujúcej veľkosť a koncentrujte absorpčné spektrá s pomermi A880/A280 nad 2,4 a pomermi A880/A805 nad 5,8 až 100 A880 a ihneď ich použite na prípravu alebo skladovanie mriežky kryo-TEM. Uchovávajte pri teplote -80 °C, kým ich nebudete používať.
Solubilizačná membrána z kmeňa PufW-His bola nanesená na 20 ml kolónu HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8,0) obsahujúcu 200 mM NaCl a 0,03 % (hmotn./hmotn.)) v IMAC pufri (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolóna bola premytá piatimi CV pufra IMAC a potom piatimi CV pufra IMAC obsahujúceho 10 mM histidín. Jadrový komplex bol eluovaný z kolóny piatimi IMAC puframi obsahujúcimi 100 mM histidín. Frakcia obsahujúca komplex RC-LH114-W bola zakoncentrovaná na ~10 ml v miešacej nádrži vybavenej filtrom Amicon 100 000 MWCO (Merck, Spojené kráľovstvo), 20-krát zriedená väzbovým pufrom a potom pridaná do 25 ml. V kolóne DEAE Sepharose sa vopred použili štyri CV naviazané na pufor. Kolóna sa premyje štyrmi väzbovými puframi pre CV, potom sa komplex eluuje na ôsmich CV s lineárnym gradientom 0 až 100 mM NaCl (vo väzbovom pufri) a zvyšné štyri CV obsahujúce 100 mM väzbový pufor. Zvyškové komplexy eluované na chloride sodnom v kombinácii s frakciami s pomerom A880/A280 vyšším ako 2,4 a pomerom A880/A805 vyšším ako 4,6 sa koncentrujú na približne 2 ml v odstredivom filtri Amicon 100 000 MWCO a naplnia sa 1,5 CV IMAC vopred. Kolóna s vylučovaním podľa veľkosti Superdex 200 16/600, ekvilibrovaná pufrom, sa eluuje v rovnakom pufri s objemom 1,5 CV. Zozbierajte absorpčné spektrá frakcií s vylúčením veľkosti a koncentrujte absorpčné spektrá s pomermi A880/A280 nad 2,1 a pomermi A880/A805 nad 4,6 na 100 A880, ktoré sa okamžite použijú na prípravu zmrazenej TEM mriežky alebo sa uskladnia pri teplote -80 °C do použitia.
Na prípravu nízkoteplotných TEM mriežok sa použil imerzný mrazničky Leica EM GP. Komplex sa zriedil v IMAC pufri na A880 50 a potom sa 5 μl nanieslo na novo vybitú uhlíkom potiahnutú medenú sieťku QUANTIFOIL 1,2/1,3 (Agar Scientific, Spojené kráľovstvo). Mriežku inkubujte pri teplote 20 °C a relatívnej vlhkosti 60 % počas 30 sekúnd, potom ju osušte 3 sekundy a potom ju ochladte v tekutom etáne pri teplote -176 °C.
Dáta komplexu RC-LH114-W boli zaznamenané na zariadení eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) pomocou mikroskopu Titan Krios, ktorý pracuje pri urýchľovacom napätí 300 kV, s nominálnym zväčšením 130 000× a energiou medzery 20 eV. Na zaznamenávanie snímok v režime počítania a zber dát bol použitý Gatan 968 GIF Quantum s detektorom píkov K2. Kalibrovaná veľkosť pixelu je 1,048 Å a dávkový príkon je 3,83 e-Å-2s-1. Záznam bol zozbieraný za 11 sekúnd a rozdelený na 40 častí. Na zaostrenie mikroskopu bola použitá oblasť potiahnutá uhlíkom a potom boli zozbierané tri záznamy na otvor. Celkovo bolo zozbieraných 3130 záznamov s hodnotami rozostrenia medzi -1 a -3 μm.
Dáta pre komplex RC-LH116 boli zozbierané pomocou rovnakého mikroskopu v Asterbury Biostructure Laboratory (Univerzita v Leedse, Spojené kráľovstvo). Dáta boli zozbierané v režime počítania so zväčšením 130 k a veľkosť pixelu bola kalibrovaná na 1,065 Å s dávkou 4,6 e-Å-2s-1. Film bol nahratý za 12 sekúnd a rozdelený na 48 častí. Celkovo bolo zozbieraných 3359 filmov s hodnotami rozostrenia medzi -1 a -3 μm.
Všetko spracovanie údajov sa vykonáva v systéme Relion 3.0 (42). Na korekciu pohybu lúča dávkovým vážením použite Motioncorr 2 (43) a potom použite CTFFIND 4.1 (44) na určenie parametra CTF (funkcia prenosu kontrastu). Typické mikrofotografie po týchto počiatočných fázach spracovania sú znázornené na obrázku 2. S16. Šablóna automatického výberu sa generuje manuálnym výberom približne 250 pixelov s 1000 časticami v 250-pixelovom snímku a bez referenčnej dvojrozmernej (2D) klasifikácie, čím sa zamietnu tie klasifikácie, ktoré spĺňajú požiadavky na kontamináciu vzorky alebo nemajú žiadne rozpoznateľné charakteristiky. Potom sa na všetkých mikrofotografiách vykonal automatický výber a RC-LH114-W obsahoval 849 359 častíc a komplex RC-LH116 obsahoval 476 547 častíc. Všetky vybrané častice prešli dvoma kolami nereferenčnej 2D klasifikácie a po každom cykle sú častice, ktoré spĺňajú požiadavky na uhlíkovú oblasť, kontamináciu vzorky, žiadne zjavné znaky alebo silne sa prekrývajúce častice, zamietnuté, čo vedie k 772 033 (90,9 %) a 359 678 (75,5 %) časticiam. Počiatočný 3D referenčný model bol vygenerovaný pomocou stochastickej gradientovej zostupnej metódy. Použitím počiatočného modelu ako referencie sú vybrané častice klasifikované do štyroch kategórií v 3D. Použitím modelu v tejto kategórii ako referencie vykonajte 3D spresnenie častíc v najväčšej kategórii, potom použite počiatočný 15 Å dolnopriepustný filter na pokrytie oblasti rozpúšťadla, pridajte 6 pixelov s mäkkými okrajmi a následne spracujte pixely na korekciu prenosovej funkcie modulácie píku Gatan K2 horného detektora. Pre súbor údajov RC-LH114-W bol tento počiatočný model upravený odstránením silnej hustoty na okrajoch masky (oddelenej od hustoty jadra komplexu v UCSF Chimera). Výsledné modely (rozlíšenie RC-LH114-W a RC-LH116 je 3,91 a 4,16 Å) sa používajú ako referencia pre druhé kolo 3D klasifikácie. Použité častice sú zoskupené do počiatočnej 3D triedy a neobsahujú silnú koreláciu s okolím. Prekrývanie alebo nedostatok zjavných štrukturálnych znakov. Po druhom kole 3D klasifikácie bola vybraná kategória s najvyšším rozlíšením [Pre RC-LH114-W je jedna kategória 377 703 častíc (44,5 %), pre RC-LH116 existujú dve kategórie s celkovým počtom 260 752 častíc (54,7 %), pričom sú rovnaké iba po zarovnaní po počiatočnej rotácii s malým rozdielom]. Vybrané častice sa reextrahujú v 400-pixelovom boxe a spresnia sa 3D spresňovaním. Maska rozpúšťadla sa vygeneruje pomocou počiatočného 15 Å dolnopriepustného filtra, 3-pixelovej expanzie mapy a 3-pixelovej mäkkej masky. Pomocou spresňovania CTF na častice, korekcie pohybu na častice a druhého kola spresňovania CTF na častice sa po každom kroku vykoná 3D spresňovanie, maskovanie rozpúšťadla a následné spracovanie, aby sa výsledná textúra ďalej spresnila. Použitím hraničnej hodnoty FSC (Fourierov Shell Correlation Coefficient) 0,143 sú rozlíšenie finálnych modelov RC-LH114-W a RC-LH116 2,65 a 2,80 Å. Krivka FSC finálneho modelu je znázornená na obrázku 2. S17.
Všetky proteínové sekvencie sú stiahnuté z UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Na zostavenie homologického modelu RC bol použitý SWISS-MODEL (45), ktorý obsahuje proteínové sekvencie RC-L, RC-M a RC-H a kryštalickú štruktúru Rba. sphaeroides RC bol použitý ako templát (PDB ID: 5LSE) (46). Na prispôsobenie vygenerovaného modelu mape (47) použite nástroj „fit map“ v UCSF Chimera, aby ste zlepšili štruktúru proteínu a pridali kofaktor [4×BChl a (názov zvyšku z knižnice monomérov = BCL), 2×BPh a (BPH), jeden alebo dva druhy UQ10 (U10), jedno nehemové železo (Fe) a jeden 3,4-dihydrohexakarbonylcholín (QAK)] pomocou Coota (48). Keďže QAK nie je dostupný v knižnici monomérov, bol parametrizovaný pomocou nástroja eLBOW v PHENIX (49).
Následne bola skonštruovaná podjednotka LH1. Spočiatku bol použitý nástroj na automatickú konštrukciu v programe PHENIX (49) na automatickú konštrukciu časti sekvencie LH1 s použitím mapy a sekvencií proteínov LH1-α a LH1-β ako vstupu. Vyberte najkompletnejšiu podjednotku LH1, extrahujte ju a načítajte ju do Coot, manuálne doplňte chýbajúcu sekvenciu a manuálne spresnite celú štruktúru pred pridaním dvoch BCl a (BCL) a spirilloxantínu (CRT) [podľa relevantnej hustoty komplexu LH1 a známeho obsahu karotenoidov. Druhy (17)]. Skopírujte celú podjednotku LH1 a pomocou nástroja UCSF Chimera „Docking Map Tool“ ju ukotvite v susednej nemodelovej oblasti hustoty LH1 a potom ju spresnite v Coot; proces opakujte, kým nebudú modelované všetky podjednotky LH1. Pre štruktúru RC-LH114-W sa extrakciou nepridelenej hustoty v Coot segmentuje proteín od zostávajúcich neproteínových zložiek v mape USCF Chimera a na vytvorenie počiatočného modelu a modelovania zostávajúcich podjednotiek (proteín-W) sa použije nástroj Autobuild. V PHENIX (49). Do výsledného modelu v Coot (48) pridajte všetky chýbajúce sekvencie a potom manuálne spresnite celú podjednotku. Zostávajúca nepridelená hustota zodpovedá kombinácii lipidov (ID knižnice monomérov PDB CDL = CDL, POPC = 6PL a POPG = PGT), detergentu β-DDM (LMT) a molekúl UQ10 (U10). Na zdokonalenie celého počiatočného modelu použite optimalizáciu PHENIX (49) a manuálnu optimalizáciu v Coot (48), kým sa štatistiky modelu a vizuálna kvalita prispôsobenia nebudú dať ďalej zlepšiť. Nakoniec použite LocScale (50) na zaostrenie lokálnej mapy a potom vykonajte niekoľko ďalších cyklov modelovania nepridelenej hustoty a automatickú a manuálnu optimalizáciu.
Príslušné peptidy, kofaktory a ďalšie lipidy a chinóny v rámci ich príslušných hustôt sú znázornené na obrázkoch 1 a 2. S18 až S23. Štatistické informácie o konečnom modeli sú uvedené v tabuľke S1.
Pokiaľ nie je uvedené inak, absorpčné spektrá UV/Vis/NIR boli zaznamenané na spektrofotometri Cary60 (Agilent, USA) v intervaloch 1 nm od 250 nm do 1000 nm a s integračným časom 0,1 s.
Vzorku zrieďte v kremennej kyvete s 2 mm dráhou na A880 = 1 a zaznamenajte absorpčné spektrum medzi 400 a 1000 nm. Kruhové dichroické spektrá boli zaznamenané na spektropolarimetri Jasco 810 (Jasco, Japonsko) v 1 nm intervaloch medzi 400 nm a 950 nm pri rýchlosti skenovania 20 nm min-1.
Molárny extinkčný koeficient sa stanoví zriedením jadrového komplexu na A880 približne 50. Zrieďte 10 μl objem v 990 μl väzbového pufra alebo metanolu a ihneď zaznamenajte absorpčné spektrum, aby sa minimalizovala degradácia BChl. Obsah BChl v každej vzorke metanolu sa vypočítal pomocou extinkčného koeficientu pri 771 nm 54,8 mM-1 cm-1 a extinkčný koeficient sa stanovil (51). Nameraná koncentrácia BChl sa vydelí 32 (RC-LH114-W) alebo 36 (RC-LH116), aby sa určila koncentrácia jadrového komplexu, ktorá sa potom použije na určenie absorpčného spektra tej istej vzorky odobratej v pufri. Extinkčný koeficient. Pre každú vzorku sa vykonali tri opakované merania a na výpočet sa použila priemerná absorbancia maxima BChl Qy. Extinkčný koeficient RC-LH114-W meraný pri 878 nm je 3280 ± 140 mM-1 cm-1, zatiaľ čo extinkčný koeficient RC-LH116 meraný pri 880 nm je 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
UQ10 bol kvantifikovaný podľa metódy v (52). Stručne povedané, HPLC s reverznou fázou (RP-HPLC) bola vykonaná s použitím HPLC systému Agilent 1200. Rozpustite približne 0,02 nmol RC-LH116 alebo RC-LH114-W v 50 μl zmesi metanol:chloroform 50:50 s obsahom 0,02 % (hm./obj.) chloridu železitého a vstreknite vopred ekvilibrovaný Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm. Rozpustite v 1 ml-1 min-1 pri 40 °C v HPLC rozpúšťadle (80:20 metanol:2-propanol) na kolónu s rozmermi × 25 cm. Vykonajte izokratickú eluciu v HPLC rozpúšťadle, aby ste monitorovali absorbanciu pri 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidy) a 780 nm (BChl) počas 1 hodiny. Pík na chromatograme pri 275 nm v čase 25,5 minúty bol integrovaný a neobsahoval žiadne ďalšie detekovateľné zlúčeniny. Integrovaná plocha sa používa na výpočet molárneho množstva extrahovaného UQ10 s odkazom na kalibračnú krivku vypočítanú z injekcie čistých štandardov od 0 do 5,8 nmol (obrázok S14). Každá vzorka bola analyzovaná v troch opakovaniach a zaznamenaná chyba zodpovedá štandardnej odchýlke priemeru.
Roztok obsahujúci komplex RC-LH1 s maximálnou absorpciou Qy 0,1 bol pripravený s 30 μM redukovaného cytochrómu c2 z konského srdca (Merck, Spojené kráľovstvo) a 0 až 50 μMUQ2 (Merck, Spojené kráľovstvo). Pri každej koncentrácii UQ2 boli pripravené tri 1 ml vzorky a inkubované cez noc v tme pri teplote 4 °C, aby sa zabezpečila úplná adaptácia na tmu pred meraním. Roztok bol vložený do modulárneho spektrofotometra OLIS RSM1000 vybaveného mriežkou s plameňom 300 nm/čiarovou mriežkou s priemerom 500 mm, vstupnými štrbinami s priemerom 1,24 mm, strednými štrbinami s priemerom 0,12 mm a výstupnými štrbinami s priemerom 0,6 mm. Na vstupe do fotoelektronickej trubice so vzorkou a referenčného fotonásobiča je umiestnený 600 nm dlhý priepustný filter, aby sa vylúčilo excitačné svetlo. Absorbancia bola monitorovaná pri 550 nm s integračným časom 0,15 s. Excitačné svetlo je emitované z 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., Spojené kráľovstvo) cez optický kábel s 90 % intenzitou a regulátorom DC2200 (Thorlabs Ltd., Spojené kráľovstvo) a je emitované do zdroja svetla pod uhlom 90°. Merací lúč je smerovaný oproti zrkadlu, aby sa vrátilo akékoľvek svetlo, ktoré nebolo pôvodne absorbované vzorkou. Absorbanciu monitorujte 10 sekúnd pred osvetlením trvajúcim 50 sekúnd. Potom sa absorbancia monitorovala ďalej počas 60 sekúnd v tme, aby sa posúdil rozsah, v akom chinolol spontánne redukuje cytochróm c23+ (surové údaje nájdete na obrázku S8).
Dáta boli spracované fitovaním lineárnej počiatočnej rýchlosti v rozmedzí 0,5 až 10 s (v závislosti od koncentrácie UQ2) a spriemerovaním rýchlostí všetkých troch vzoriek pri každej koncentrácii UQ2. Koncentrácia RC-LH1 vypočítaná príslušným extinkčným koeficientom bola použitá na prevod rýchlosti na katalytickú účinnosť, vynesenú do grafu v programe Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) a fitovaním do modelu Michaelis-Menten na určenie zdanlivých hodnôt Km a Kcat.
Pre merania prechodnej absorpcie bola vzorka RC-LH1 zriedená na ~2 μM v IMAC pufri obsahujúcom 50 mM askorbát sodný (Merck, USA) a 0,4 mM terbutín (Merck, USA). Kyselina askorbová sa používa ako obetný donor elektrónov a terc-butaklofén sa používa ako inhibítor QB, aby sa zabezpečilo, že hlavný donor RC zostane redukovaný (t. j. nie fotooxidovaný) počas celého procesu merania. Približne 3 ml vzorky sa pridá do vlastnej rotujúcej cely (s priemerom približne 0,1 m, 350 ot./min.) s dĺžkou optickej dráhy 2 mm, aby sa zabezpečilo, že vzorka v laserovej dráhe má dostatok času na adaptáciu na tmu medzi excitačnými impulzmi. Na amplifikáciu Ti:Sapphire laserového systému (Spectra Physics, USA) sa použite laserové impulzy s dĺžkou ~100 fs na excitáciu vzorky pri 880 nm s opakovacou frekvenciou 1 kHz (20 nJ pre NIR alebo 100 nJ pre Vis). Pred zberom údajov sa vzorka vystaví excitačnému svetlu približne na 30 minút. Expozícia spôsobí inaktiváciu QA (možno raz alebo dvakrát zníži QA). Upozorňujeme však, že tento proces je reverzibilný, pretože po dlhom období adaptácie na tmu sa RC pomaly vráti k aktivite QA. Na meranie prechodových spektier s časom oneskorenia -10 až 7000 ps bol použitý spektrometer Helios (Ultrafast Systems, USA). Na rozskupenie súborov údajov, ich zlúčenie a štandardizáciu použite softvér Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA). Na získanie diferenciálnych spektier súvisiacich s rozpadom použite softvérový balík CarpetView (Light Conversion Ltd., Litva) alebo použite funkciu, ktorá konvolvuje viacero exponentov s odozvou prístroja, aby sa prispôsobila spektrálnemu vývoju s jednou vlnovou dĺžkou v programe Origin (OriginLab, USA).
Ako bolo uvedené vyššie (53), bol pripravený fotosyntetický film obsahujúci komplex LH1 bez RC aj periférnej antény LH2. Membrána bola zriedená v 20 mM Tris (pH 8,0) a potom vložená do kremennej kyvety s optickou dráhou 2 mm. Na excitáciu vzorky pri 540 nm bol použitý laserový impulz s energiou 30 nJ s časom oneskorenia -10 až 7000 ps. Súbor údajov spracujte podľa popisu pre vzorku Rps.pal.
Membrána bola peletovaná centrifugáciou pri 150 000 RCF počas 2 hodín pri 4 °C a potom bola jej absorbancia pri 880 nm resuspendovaná v 20 mM tris-HCl (pH 8,0) a 200 mM NaCl. Membrána bola rozpustená pomalým miešaním v 2 % (hm./obj.) β-DDM počas 1 hodiny v tme pri 4 °C. Vzorka bola zriedená v 100 mM trietylamóniumkarbonáte (pH 8,0) (TEAB; Merck, Spojené kráľovstvo) na koncentráciu proteínu 2,5 mg ml-1 (analýza Bio-Rad). Ďalšie spracovanie bolo vykonané podľa predtým publikovanej metódy (54), počnúc zriedením 50 μg proteínu do celkovo 50 μl TEAB obsahujúceho 1 % (hm./obj.) laurátu sodného (Merck, Spojené kráľovstvo). Po sonikácii počas 60 sekúnd bola redukovaná s 5 mM tris(2-karboxyetyl)fosfínom (Merck, Spojené kráľovstvo) pri teplote 37 °C počas 30 minút. Pre S-alkyláciu bola vzorka inkubovaná s 10 mM metyl-S-metyltiometánsulfonátom (Merck, Spojené kráľovstvo) a pridaná z 200 mM zásobného roztoku izopropanolu počas 10 minút pri izbovej teplote. Proteolytické štiepenie bolo vykonané pridaním 2 μg zmesi trypsín/endoproteinázový Lys-C (Promega, Spojené kráľovstvo) a inkubované pri teplote 37 °C počas 3 hodín. Laurátový surfaktant bol extrahovaný pridaním 50 μl etylacetátu a 10 μl 10 % (v/v) kyseliny trifluóroctovej (TFA; Thermo Fisher Scientific, Spojené kráľovstvo) kvality LC a vortexovaním počas 60 sekúnd. Fázová separácia bola podporená centrifugáciou pri 15 700 RCF počas 5 minút. Podľa protokolu výrobcu sa na opatrné odsatie a odsolenie spodnej fázy obsahujúcej peptid použila spinová kolóna C18 (Thermo Fisher Scientific, Spojené kráľovstvo). Po vysušení vákuovou centrifugáciou sa vzorka rozpustila v 0,5 % TFA a 3 % acetonitrile a 500 ng sa analyzovalo pomocou nanoflow RP chromatografie spojenej s hmotnostnou spektrometriou s použitím systémových parametrov podrobne uvedených vyššie.
Na identifikáciu a kvantifikáciu proteínov použite MaxQuant v.1.5.3.30 (56) na vyhľadanie databázy proteómov Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Proteomické údaje získané hmotnostnou spektrometriou boli uložené v aliancii ProteomeXchange Alliance prostredníctvom partnerského repozitára PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) pod identifikátorom súboru údajov PXD020402.
Na analýzu pomocou RPLC v spojení s hmotnostnou spektrometriou s elektrosprejovou ionizáciou bol komplex RC-LH1 pripravený z divokého typu Rps. Použitím predtým publikovanej metódy (16) bola koncentrácia proteínu vytvorená v bunkách palustris 2 mg ml-1 v 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl a 0,03 % (hm./obj.) β- (analýza Bio-Rad) DDM. Podľa protokolu výrobcu sa na extrakciu 10 μg proteínu precipitačnou metódou použila 2D purifikačná súprava (GE Healthcare, USA) a zrazenina sa rozpustila v 20 μl 60 % (v/v) kyseliny mravčej (FA), 20 % (v/v) acetonitrilu a 20 % (v/v) vody. Päť mikrolitrov sa analyzovalo pomocou RPLC (Dionex RSLC) v spojení s hmotnostnou spektrometriou (Maxis UHR-TOF, Bruker). Na separáciu pri teplote 60 °C a rýchlosti 100 μl min-1 s gradientom 85 % (v/v) rozpúšťadla A [0,1 % (v/v) FA a 0,02 % (v/v) vodného roztoku TFA] až 85 % (v/v) rozpúšťadla B [0,1 % (v/v) FA a 0,02 % (v/v) v 90 % (v/v) acetonitrile TFA]. Použitím štandardného zdroja elektrosprejovej ionizácie a predvolených parametrov počas viac ako 60 minút hmotnostný spektrometer dosiahol 100 až 2750 m/z (pomer hmotnosti k náboju). Pomocou nástroja FindPept z bioinformatického portálu ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/) namapujte hmotnostné spektrum na podjednotky komplexu.
Bunky boli pestované 72 hodín v 100 ml NF-nízkeho (10 μMm-2 s-1), stredného (30 μMm-2 s-1) alebo silného (300 μMm-2 s-1) svetla. Médium M22 (médium M22, v ktorom je síran amónny vynechaný a sukcinát sodný je nahradený octanom sodným) v 100 ml fľaši so skrutkovacím uzáverom (23). V piatich 30-sekundových cykloch boli nanesené 0,1 mikrónové sklenené guľôčky v objemovom pomere 1:1 na lýzu buniek a následne boli 5 minút chladené na ľade. Nerozpustná látka, nerozbité bunky a sklenené guľôčky boli odstránené centrifugáciou pri 16 000 RCF počas 10 minút v stolovej mikrocentrifúge. Membrána bola separovaná v rotore Ti 70.1 so 100 000 RCF v 20 mM tris-HCl (pH 8,0) s gradientom sacharózy 40/15 % (hmotn./hmotn.) počas 10 hodín.
Ako je opísané v našej predchádzajúcej práci, imunodetekcia His značky na PufW (16). Stručne povedané, purifikovaný jadrový komplex (11,8 nM) alebo membrána obsahujúca rovnakú koncentráciu RC (stanovenú oxidáciou odčítaním redukovaného diferenčného spektra a porovnaním záťaže na zafarbenom géli) v 2x SDS nanášacom pufri (Merck, Spojené kráľovstvo) dvakrát zriedenom. Proteíny boli separované na replikačnom 12% bis-tris NuPage géli (Thermo Fisher Scientific, Spojené kráľovstvo). Gél bol zafarbený Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Spojené kráľovstvo) na nanesenie a vizualizáciu podjednotky RC-L. Proteín na druhom géli bol prenesený na metanolom aktivovanú polyvinylidénfluoridovú (PVDF) membránu (Thermo Fisher Scientific, Spojené kráľovstvo) pre imunotest. PVDF membrána bola blokovaná v 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2 % (v/v) Tween-20 a 5 % (hm./v) sušenom odstredenom mlieku a potom inkubovaná s primárnou protilátkou anti-His (v zriedenom pufri protilátok [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl a 0,05 % (v/v) Tween-20] v 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) počas 4 hodín. Po trojnásobnom 5-minútovom premytí v protilátkovom pufri sa membrána skombinovala so sekundárnou protilátkou proti myšej chrenovej peroxidáze (Sigma-Aldrich, Spojené kráľovstvo) (zriedenou 1:10 000 v protilátkovom pufri). Inkubovala sa, aby sa umožnila detekcia (5 minút po 3 premytiach v protilátkovom pufri) s použitím chemiluminiscenčného substrátu WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Taliansko) a Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Spojené kráľovstvo).
Nakreslením distribúcie intenzity každého zafarbeného gélu alebo dráhy imunotestu, integráciou plochy pod píkom a výpočtom pomeru intenzity RC-L (zafarbený gél) a Protein-W (imunotest) v programe ImageJ (57) spracujte obrázok. Tieto pomery boli prevedené na molárne pomery za predpokladu, že pomer RC-L k proteínu-W v čistej vzorke RC-LH114-W bol 1:1 a zodpovedajúcou normalizáciou celého súboru údajov.
Doplňujúce materiály k tomuto článku nájdete na stránke http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný podľa podmienok licencie Creative Commons Attribution. Článok umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v akomkoľvek médiu za podmienky, že je pôvodné dielo riadne citované.
Poznámka: Žiadame vás o poskytnutie vašej e-mailovej adresy iba preto, aby osoba, ktorú odporúčate stránke, vedela, že chcete, aby videla daný e-mail a že nejde o spam. Nebudeme zaznamenávať žiadne e-mailové adresy.
Táto otázka sa používa na overenie, či ste návštevník, a na zabránenie automatického odosielania spamu.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Štruktúra komplexu svetelnej pasce 1 v reakčnom centre s vysokým rozlíšením poskytuje nové poznatky o dynamike chinónov.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Štruktúra komplexu svetelnej pasce 1 v reakčnom centre s vysokým rozlíšením poskytuje nové poznatky o dynamike chinónov.
©2021 American Association for the Advancement of Science. všetky práva vyhradené. AAAS je partnerom HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.